本發(fā)明涉及干細(xì)胞提取培養(yǎng)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：糖尿病是一種常見(jiàn)的由內(nèi)分泌系統(tǒng)代謝障礙引起的慢性終身疾病，長(zhǎng)期患病可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等多種系統(tǒng)的慢性損害。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及人民生活水平的提高，糖尿病患病率逐年增加，嚴(yán)重危害人們的健康，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。最新大樣本流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國(guó)成人糖尿病患病率為11.6％，其中男性患病率為12.1％，女性患病率為11％，城市居民為14.3％，農(nóng)村居民為10.3％；調(diào)查結(jié)果還顯示糖尿病前期率為50.1％。目前主要是使用口服降糖藥及胰島素替代治療，不能根治，且存在很多不足。人羊膜來(lái)源干細(xì)胞包括人羊膜上皮細(xì)胞(humanamnioticepithelialcells，hAEC)、人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(humanamnioticmes-enchymalstromalcells，hAMSC)。人羊膜干細(xì)胞可在體內(nèi)及體外向外胚層來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)胚層來(lái)源的胰腺細(xì)胞、肝臟細(xì)胞以及中胚層來(lái)源的心肌樣細(xì)胞、肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞方向分化，并且具有無(wú)性集落形成能力和抗炎性。作為很多細(xì)胞的前體，羊膜干細(xì)胞又能抑制細(xì)胞免疫。不同的抗血管生成和抗炎癥的蛋白都在羊膜干細(xì)胞中表達(dá)，這也解釋了羊膜的抗血管生成和抗炎癥的作用。這些性質(zhì)使得羊膜干細(xì)胞已在很多治療起到輔佐作用，而且大多數(shù)效果顯著。人羊膜干細(xì)胞在具有類似胚胎干細(xì)胞性質(zhì)的同時(shí)，因其無(wú)致瘤性、低免疫排斥性、含量豐富、容易獲取、不引起倫理爭(zhēng)議，極有潛力成為臨床應(yīng)用的干細(xì)胞來(lái)源之一。近年來(lái)，隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，羊膜干細(xì)胞移植已經(jīng)成為新的疾病治療的發(fā)展方向。在臨床應(yīng)用上，羊膜干細(xì)胞在結(jié)膜損傷修復(fù)、重建眼表、防治瞼球粘連與視網(wǎng)膜移植等眼科臨床已開(kāi)展了大量工作，而且在糖尿病難愈性皮膚潰瘍、燒傷等創(chuàng)面修復(fù)愈合方面也有積極的療效。而且，已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明羊膜干細(xì)胞能夠分化在一定條件下能夠分化為胰島細(xì)胞。同時(shí)，也有學(xué)者報(bào)道了人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞治療糖尿病的病例，并取得了良好的效果。雖然現(xiàn)在羊膜干細(xì)胞的應(yīng)用研究上已經(jīng)取得了一定的成果，并已經(jīng)開(kāi)始利用人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行糖尿病治療的研究。然而，現(xiàn)有的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)的方法仍比較復(fù)雜，且無(wú)法得到具有較高純度和活性的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。因此，開(kāi)發(fā)一種便捷高效且能夠產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化提取和培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，就成了目前亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，所述方法中，通過(guò)將人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞從胎盤組織上分離、提取并純化，然后在體外擴(kuò)大增殖培養(yǎng)，因而能夠簡(jiǎn)易、便捷且規(guī)?；牡玫饺搜蚰らg充質(zhì)干細(xì)胞。從而能夠解決現(xiàn)有技術(shù)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞提取分離方法復(fù)雜等技術(shù)問(wèn)題。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：一種人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞提取分離方法，所述方法包括如下步驟：(1)將羊膜從胎盤組織上剝離，并清洗；(2)將清洗后的羊膜剪碎后，加入胰酶處理；(3)將胰酶處理后的組織清洗后，加入膠原酶I消化處理；(4)將消化處理后的組織過(guò)濾，并離心；(5)用培養(yǎng)液將離心后得到的細(xì)胞重懸后接種培養(yǎng)；(6)培養(yǎng)后細(xì)胞匯合度達(dá)到80～90％后，加入胰酶消化，然后加入培養(yǎng)基終止消化，并傳代培養(yǎng)，即得到人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明中，通過(guò)將人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞從胎盤組織上分離、提取并純化，然后在體外擴(kuò)大增殖培養(yǎng)，因而能夠簡(jiǎn)易、便捷且規(guī)?；牡玫饺搜蚰らg充質(zhì)干細(xì)胞?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(1)中所述清洗為以含3％雙抗的HBSS緩沖溶液清洗。本發(fā)明中，通過(guò)使用含有雙抗的HBSS緩沖溶液清洗剝離后所得的組織，從而能夠在有效去除殘留血跡的同時(shí)，還能夠起到進(jìn)一步消毒的作用。本發(fā)明中，步驟(1)中所述剝離是在無(wú)菌條件下進(jìn)行的。本發(fā)明中，步驟(1)中所述剝離是采用機(jī)械法將羊膜從胎盤組織上剝離。本發(fā)明中，所述HBSS緩沖溶液為平衡鹽溶液。本發(fā)明中，所述含3％雙抗的HBSS緩沖溶液為含有3％青霉素和鏈霉素的HBSS緩沖溶液。本發(fā)明中，步驟(1)中所述清洗為多次清洗。可選的，本發(fā)明中，步驟(2)中所述胰酶處理為在33～38℃條件下處理25～35min；優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(2)中所述胰酶處理為在35～37℃條件下處理30～32min?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(2)中所述胰酶為處理2～3次。本發(fā)明中，通過(guò)多次胰酶處理，從而能夠充分的將羊膜上皮除去，從而得到高純度的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(3)中所述消化處理為以濃度為0.3～0.6mg/ml的膠原酶I消化處理；優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(3)中所述消化處理為以濃度為0.4～0.5mg/ml的膠原酶I消化處理?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(3)中所述消化處理為在35～39℃條件下消化處理1～2h；優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(3)中所述消化處理為在37～38℃條件下消化處理1～2h。本發(fā)明中，通過(guò)對(duì)消化處理溫度和時(shí)間的調(diào)整，從而能夠提高酶活性，并進(jìn)一步提高酶解處理效率；同時(shí)還不會(huì)由于酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)所導(dǎo)致的處理效率過(guò)低以及對(duì)目標(biāo)細(xì)胞組織的破壞?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(3)中所述的消化處理是在水浴條件下進(jìn)行的?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(4)中所述離心為在轉(zhuǎn)速為1300～1600rpm條件下，離心8～15min；優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(4)中所述離心為在轉(zhuǎn)速為1400～1500rpm條件下，離心8～10min。本發(fā)明中，通過(guò)對(duì)離心轉(zhuǎn)速以及離心時(shí)間等條件的選擇和調(diào)整，從而能夠在將人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞充分離心得到的同時(shí)，還能夠避免由于離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)所導(dǎo)致的整體純化處理效率的降低?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(5)中所述培養(yǎng)是在35～38℃條件下CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行的培養(yǎng)；優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(5)中所述培養(yǎng)是在36～37℃條件下CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行的培養(yǎng)?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(6)中所述胰酶消化是在35～38℃條件下消化3～6min；優(yōu)選的，本發(fā)明中，步驟(6)中所述胰酶消化是在36～37℃條件下消化4～5min。本發(fā)明中，通過(guò)對(duì)消化處理溫度和時(shí)間的調(diào)整，從而能夠提高酶活性，并進(jìn)一步提高酶解處理效率；同時(shí)還不會(huì)由于酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)所導(dǎo)致的處理效率過(guò)低以及對(duì)目標(biāo)細(xì)胞組織的破壞。可選的，本發(fā)明中，步驟(5)所述接種培養(yǎng)是先將離心處理所得的細(xì)胞按1×106的細(xì)胞密度接種于10mm培養(yǎng)皿內(nèi)，再放入37℃條件下的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)?？蛇x的，本發(fā)明中，步驟(6)中所述培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明中，通過(guò)將人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞從胎盤組織上分離、提取并純化，然后在體外擴(kuò)大增殖培養(yǎng)，因而能夠簡(jiǎn)易、便捷且規(guī)?；牡玫饺搜蚰らg充質(zhì)干細(xì)胞；(2)本發(fā)明中，通過(guò)對(duì)酶解消化處理等步驟條件的選擇、調(diào)整以及優(yōu)化，從而進(jìn)一步提高了本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞提取純化效率。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。圖1為培養(yǎng)48h后，在4×顯微鏡下觀察到的培養(yǎng)基中細(xì)胞形態(tài)；圖2為培養(yǎng)基中細(xì)胞匯合度達(dá)到80％-90％時(shí)，4×顯微鏡下觀察到的培養(yǎng)基中細(xì)胞形態(tài)；圖3為P5代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在4×顯微鏡下觀察到的培養(yǎng)基中細(xì)胞形態(tài)；圖4為P10代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在4×顯微鏡下觀察到的培養(yǎng)基中細(xì)胞形態(tài)；圖5為P15代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在4×顯微鏡下觀察到的培養(yǎng)基中細(xì)胞形態(tài)；圖6為細(xì)胞表面子在羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞上的表達(dá)分析檢測(cè)圖譜；圖7A為未經(jīng)誘導(dǎo)分化處理的P3代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在10×顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)。圖7B為經(jīng)成脂誘導(dǎo)試劑誘導(dǎo)分化處理后P3代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在10×顯微鏡下觀察到的細(xì)胞染色情況。圖7C為經(jīng)成骨誘導(dǎo)試劑誘導(dǎo)分化處理后P3代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在10×顯微鏡下觀察到的細(xì)胞染色情況。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1(1)在無(wú)菌條件下，采用機(jī)械法將羊膜從胎盤組織上剝離，然后，用含3％雙抗HBSS沖洗數(shù)次清除殘留血跡；(2)將清洗后的羊膜組織剪碎，并加入胰酶進(jìn)行處理，從而去除羊膜上皮細(xì)胞；(3)將步驟(2)處理后所得組織用HBSS清洗3次后，加入濃度為0.5mg/ml膠原酶I，并在37℃水浴鍋中消化處理1-2h；(4)將消化處理后所得混合物用篩網(wǎng)過(guò)濾，并去掉未消化組；然后在1500rpm條件下，離心處理10min.(5)用羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸離心處理所得的細(xì)胞，并按1×106的細(xì)胞密度接種于10mm培養(yǎng)皿內(nèi)，并放入37℃條件下的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)48小時(shí)后，得到圖1所示細(xì)胞形態(tài)的培養(yǎng)基，并更換為新的DMEM/F12培養(yǎng)基；(6)如圖2所示，細(xì)胞匯合度達(dá)到80％-90％后，加入胰酶37℃消化5min加入培養(yǎng)基終止消化，按1:3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本發(fā)明方法培養(yǎng)的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞可穩(wěn)態(tài)由如圖3所示的P5代、如圖4所示的P10代一直傳代培養(yǎng)至圖5所示的P15代。實(shí)驗(yàn)例1流式細(xì)胞儀檢測(cè)收集實(shí)施例1步驟(3)中消化處理后，過(guò)濾離心得到的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，并收集約106個(gè)細(xì)胞；將收集得到的細(xì)胞用PBS緩沖溶液洗滌2次，并適當(dāng)稀釋；然后在流式細(xì)胞儀上加樣檢測(cè)；檢測(cè)后，采用軟件分析CD73、CD90、CD44、CD45、CD105等5種細(xì)胞表面子在人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞上的表達(dá)，分析結(jié)果如圖6所示；進(jìn)一步根據(jù)圖6所示分析結(jié)果進(jìn)行積分計(jì)算，得出5種細(xì)胞表面子在各代的表達(dá)情況，結(jié)果如下：CD73表達(dá)情況：種群數(shù)量占母本比例(％)占總體比例總體10000—100.0P1代617161.761.7P2代6168100.061.7CD90表達(dá)情況：種群數(shù)量占母本比例(％)占總體比例總體10000—100.0P1代602860.360.3P2代587297.458.7CD105表達(dá)情況：種群數(shù)量占母本比例(％)占總體比例總體10000—100.0P1代616461.661.6P3代611899.361.2CD45表達(dá)情況：種群數(shù)量占母本比例(％)占總體比例總體10000—100.0P1代635763.663.6P3代240.40.2CD44表達(dá)情況：種群數(shù)量占母本比例(％)占總體比例總體10000—100.0P1代621862.262.2P3代616199.161.6然后統(tǒng)計(jì)各標(biāo)志物表達(dá)情況，結(jié)果如下表所示：細(xì)胞表面標(biāo)志物羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞CD73100％CD4499.1％CD10599.3％CD9097.4％CD450.4％檢測(cè)結(jié)果顯示，本發(fā)明人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)了CD73、CD44、CD105以及CD90，基本不表達(dá)CD45。實(shí)驗(yàn)例2成脂及成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究干細(xì)胞具有自我復(fù)制及多項(xiàng)分化的潛能。到目前為止人們已經(jīng)陸續(xù)從臍帶，胎盤，骨髓，脂肪，皮膚，毛囊等組織提取分離出間充質(zhì)干細(xì)胞。分離方法主要有種植法和酶消化法兩種。不同的方法和實(shí)驗(yàn)程序?qū)μ崛〉母杉?xì)胞的質(zhì)量和純度有很大差異。所以干細(xì)胞的分化實(shí)驗(yàn)是世界上普遍認(rèn)可的干細(xì)胞鑒定標(biāo)準(zhǔn)。具體檢測(cè)方法如下：a、將實(shí)施例1步驟(5)中P3代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞以1x105ml-1的密度接種于12孔板，待其融合度達(dá)到70％-80％后，加入成脂誘導(dǎo)液，并有對(duì)照孔。每周換液兩次，誘導(dǎo)14-18天后，進(jìn)行油紅O染色鑒定脂滴形成，顯微鏡下觀察并拍照，見(jiàn)圖7B。b、將實(shí)施例1步驟(5)中P3代羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞以1x105ml-1的密度接種于12孔板，待其融合度達(dá)到70％-80％加入成骨誘導(dǎo)液，并有對(duì)照孔。每周換液兩次，誘導(dǎo)21-25天后，進(jìn)行茜素紅染色鑒定骨結(jié)節(jié)形成，顯微鏡下觀察并拍照，見(jiàn)圖7C。圖7A為陰性對(duì)照，經(jīng)對(duì)照檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好的成脂、成骨能力。經(jīng)對(duì)照檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好的成脂、成骨能力。本發(fā)明方法中，通過(guò)將人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞從胎盤組織上分離、提取并純化，然后在體外擴(kuò)大增殖培養(yǎng)，因而能夠簡(jiǎn)易、便捷且規(guī)?；牡玫饺搜蚰らg充質(zhì)干細(xì)胞。盡管已用具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3