本發(fā)明涉及一種產(chǎn)前診斷領域，具體涉及一種孕婦外周血中胎兒游離DNA的保存劑及其構(gòu)成的真空采血管。
背景技術(shù)：
無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷主要是利用孕婦血漿中游離胎兒DNA進行的診斷，孕婦從懷孕7周開始即可檢測到胎兒游離DNA，利用胎兒游離DNA可以早期、特異地進行產(chǎn)前篩查和診斷。
但是，孕婦血漿中胎兒游離DNA的量甚微，僅占總游離DNA的約5％～7％，且極易受到母體有核細胞破裂釋放出的染色體DNA污染和細胞內(nèi)高濃度的DNA酶降解。
研究表明游離胎兒DNA檢測分析前因素如：血樣采集、保存、血漿分離方法等不當時，會明顯影響分析的效果。而且，目前尚未見成熟的孕婦外周血中游離DNA的體外檢測的采集和保存技術(shù)，導致現(xiàn)有血漿中胎兒游離DNA保存時間短、易降解、易污染的問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：目前尚未見成熟的孕婦外周血中游離DNA的體外檢測的采集和保存技術(shù)，導致現(xiàn)有血漿中胎兒游離DNA保存時間短、易降解的問題，提供解決上述問題的一種孕婦外周血中胎兒游離DNA的保存劑及其構(gòu)成的真空采血管。
本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
一種孕婦外周血中胎兒游離DNA的保存劑，包括細胞穩(wěn)定劑、抗凝劑、緩沖液、代謝抑制劑和DNA酶抑制劑。
本發(fā)明通過上述組分的結(jié)合，能穩(wěn)定母體外周血有核細胞，防止釋放細胞染色體DNA，抑制DNA酶介導降解，有助于胎兒游離DNA的整體穩(wěn)定。解決了血漿中胎兒游離DNA保存時間短、易降解的問題。
優(yōu)選地，所述細胞穩(wěn)定劑為60～250重量份，抗凝劑為15～22重量份，緩沖液為12～40重量份，代謝抑制劑為0.5～3重量份，DNA酶抑制劑為0.2～2重量份。
通過上述組成配比的優(yōu)化，能極大保證孕婦外周血在常溫下的保存時間，保存時間甚至可以達到7天以上，且在該保存期間內(nèi)，胎兒游離DNA的量不會發(fā)生顯著降解。
進一步，所述細胞穩(wěn)定劑由50～200重量份的重氮咪唑烷基脲和1～5重量份的NaF組成；或所述細胞穩(wěn)定劑由50～200重量份的重氮咪唑烷基脲和10～50重量份的濃度為40％的甲醛組成。
更進一步，所述抗凝劑為EDTA鉀鹽或EDTA鈉鹽。所述緩沖液為終濃度為10mM的標準Tris-Cl緩沖液。所述代謝抑制劑為分子生物級糖原。所述DNA酶抑制劑為二硫蘇糖醇(DTT)。
一種用于孕婦外周血中胎兒游離DNA檢測的真空采血管，包括采血管本體，設置在采血管本體內(nèi)用于將血液細胞和血漿進行隔離的惰性分離膠，以及設置在采血管本體內(nèi)如權(quán)利要求1～7任一項所述的保存劑。
本發(fā)明通過惰性分離膠的設置，在臨床機構(gòu)常用離心條件(如1500g-2200g離心力)分離后，能有效將血細胞隔離，防止血細胞尤其是有核細胞成分對樣品血漿的影響，進一步提高胎兒游離DNA的穩(wěn)定性。
進一步，所述惰性分離膠的密度為1.05～1.07g/cm3。
更進一步地，所述采血管本體的內(nèi)壁膜化處理，處理方法為：采血管內(nèi)壁進行超聲波潔凈處理，噴涂水溶性硅油和乳化劑混合制成的混合液，經(jīng)150～200℃干燥，表面形成光滑永固且不與添加劑及血液發(fā)生反應的一層仿生膜?；旌弦褐兴苄怨栌秃腿榛瘎┑闹亓颗浔葹?0～80∶250～500。該混合液的具體制備方法如下：
定量稱取乳化劑40～80份，水溶性硅油250～500，將水溶性硅油按60～120滴/秒的速度緩慢滴加入乳化劑中，勻速攪拌5～20分鐘，直到混合物呈透明均勻粘性體，然后溶入1000份純化水而成。
同理，本發(fā)明中的采血管本體可以采用玻璃或塑料材質(zhì)構(gòu)成，如本發(fā)明的真空采血管可以是實驗室用中性玻璃材質(zhì)，也可以是滿足真空保持和水份穩(wěn)定的PET塑料材質(zhì)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果：
1、本發(fā)明通過上述組成成分的組合，能穩(wěn)定母體外周血有核細胞，防止釋放細胞染色體DNA，抑制DNA酶介導降解，有助于胎兒游離DNA的整體穩(wěn)定；
2、本發(fā)明通過配比和具體物質(zhì)的優(yōu)化，能有效使保存時間更長，保存效果更佳；
3、本發(fā)明通過惰性分離膠的設置，能有效將血細胞隔離，防止血細胞尤其是有核細胞成分對樣品血漿的影響，進一步提高胎兒游離DNA的穩(wěn)定性；
4、本發(fā)明通過采血管的內(nèi)壁膜化處理，降低對胎兒游離DNA的吸附，提高檢測時胎兒游離DNA的準確度。
具體實施方式
為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的示意性實施方式及其說明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對本發(fā)明的限定。
實施例1
一種孕婦外周血中胎兒游離DNA的保存劑，包括細胞穩(wěn)定劑、抗凝劑、緩沖液、代謝抑制劑和DNA酶抑制劑。
本實施例中該細胞穩(wěn)定劑為重氮咪唑烷基脲和NaF，該抗凝劑為EDTA鉀鹽，該緩沖液為終濃度為10mM的標準Tris-Cl緩沖液，該代謝抑制劑為分子生物級糖原，該DNA酶抑制劑為二硫蘇糖醇(DTT)。
其中，各組分的配比具體設置如表1所示。
表1
實施例2
本實施例與實施例1的區(qū)別在于，本實施例中將實施例1中的NaF替換成了濃度為40％的甲醛作為實例4-6，具體設置如下：
實例4：將實例1中的NaF替換成了添加量為30μl的濃度為40％的甲醛；
實例5：將實例2中的NaF替換成了添加量為10μl的濃度為40％的甲醛；
實例6：將實例3中的NaF替換成了添加量為50μl的濃度為40％的甲醛。
實施例3
本實施例提供了一種用于孕婦外周血中胎兒游離DNA檢測的真空采血管，包括采血管本體，設置在采血管本體內(nèi)用于將血液細胞和血漿進行隔離的惰性分離膠，以及設置在采血管本體內(nèi)的保存劑。
本實施例中該惰性分離膠的密度為1.05～1.07g/cm3，該采血管本體采用塑料材質(zhì)構(gòu)成，同時，本實施例還對采血管本體的內(nèi)壁膜化處理，處理方法如下：
采血管內(nèi)壁進行超聲波潔凈處理，在采血管內(nèi)壁上噴涂水溶性硅油和乳化劑混合制成的混合液，經(jīng)150～200℃干燥，表面形成光滑永固且不與添加劑及血液發(fā)生反應的一層仿生膜。
混合液的具體制備方法為：定量稱取乳化劑60重量份，水溶性硅油400重量份，將水溶性硅油按60～120滴/秒的速度緩慢滴加入乳化劑中，勻速攪拌5～20分鐘，直到混合物呈透明均勻粘性體，然后溶入1000重量份純化水而成。
選取孕齡12-30周健康待產(chǎn)孕婦50例，分別采用實施例1和實施例2中的保存劑以及常規(guī)EDTA-K3采血管對同一孕婦外周血的血液標本進行處理，對處理后的外周血進行檢測，然后再常溫保存7天，再對采血管內(nèi)外周血進行檢測，檢測結(jié)果如表2所示。本實施例中保存劑1ml可采集保存血液為10ml。
檢測時，使用熒光定量PCR技術(shù)檢測ALU基因長片段的CT值以換算出血漿中總游離DNA含量。檢測SRY基因當量(GE)變化體現(xiàn)DNA含量變化。
表2
通過表2可知：采用實施例1至實施例2的產(chǎn)品對孕婦外周血進行保存后，外周血中的胎兒游離DNA穩(wěn)定性遠遠高于對照例和常規(guī)EDTA-K3管，且同期保存胎兒游離DNA在常溫下7天后含量無顯著差異。
以上所述的具體實施方式，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進行了進一步詳細說明，所應理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。