本發(fā)明涉及木犀草素在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞定向分化中的用途。

背景技術(shù)：

對(duì)于神經(jīng)元損傷和功能喪失等神經(jīng)系統(tǒng)的疾病,目前尚無(wú)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生的有效方法，所以細(xì)胞替代療法是治療神經(jīng)功能缺失最有前途的治療策略之一。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord-mesenchymal stem cells,hUC MSCs)為存在于臍帶華爾通氏膠和血管周圍組織。臍帶為分娩后廢棄物，無(wú)道德及法律限制,免疫原性低，異體移植無(wú)免疫排斥反應(yīng)或反應(yīng)較弱，使hUC MSC s成為臨床上最具應(yīng)用前景的多能干細(xì)胞。

木犀草素(Luteolin)最初是從草本植物木犀草的葉、莖、枝中被分離出而得名，具有抗炎、抗氧化、抑制凋亡、抗過(guò)敏、抗腫瘤等多種生物學(xué)作用，富含木犀草素的藥物，被廣泛應(yīng)用于高血壓病和癌癥等疾病的治療。對(duì)于木犀草素具有誘導(dǎo)hUC MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的可能，目前尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了木犀草素的新用途。

本發(fā)明首先提供了木犀草素在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞定向分化中的用途。

其中，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞定向分化是指促使間充質(zhì)干細(xì)胞出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞樣改變(胞核增大，細(xì)胞呈分叉狀改變，細(xì)胞伸出較多細(xì)長(zhǎng)的突起)，同時(shí)神經(jīng)細(xì)胞特異性基因nestin、GFAP、MAP2、NEFH的表達(dá)明顯上調(diào)。

優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了木犀草素在制備誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)液中的用途。

優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)液，它以常用細(xì)胞培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加有木犀草素。

常用細(xì)胞培養(yǎng)基，是指包含供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促使細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)的培養(yǎng)基，如，α-MEM培養(yǎng)基(又叫MEM培養(yǎng)基，Minimum Essential Medium)、DMEM-高糖培養(yǎng)基、DMEM-低糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM/F12 培養(yǎng)基或M-199培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述常用細(xì)胞培養(yǎng)基為α-MEM培養(yǎng)基、DMEM-高糖培養(yǎng)基、DMEM-低糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基或M-199培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述木犀草素的終濃度為10ug/ml。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)液是以DMEM/F12培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加有DMEM/F12培養(yǎng)基1/9(v/v)的FBS和終濃度為10ug/ml的木犀草素。

本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法，包括如下步驟：

a、取間充質(zhì)干細(xì)胞；

b、置于前述的誘導(dǎo)液中培養(yǎng)，即可。

步驟a中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

步驟b中，培養(yǎng)的時(shí)間為6天。

本發(fā)明還提供了前述方法得到的細(xì)胞

根據(jù)公知常識(shí)，干細(xì)胞分化需要經(jīng)過(guò)標(biāo)志基因表達(dá)模式改變、細(xì)胞形態(tài)變化、最終成形等階段。若分化為神經(jīng)細(xì)胞，標(biāo)志基因表達(dá)模式改變的具體表現(xiàn)就是神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志基因的高表達(dá)，這個(gè)階段是整個(gè)分化過(guò)程最為重要的階段之一，此階段相當(dāng)于給干細(xì)胞的分化定下了軌跡，在后期只要給予合適的條件，就能最終分化得到神經(jīng)細(xì)胞。

本發(fā)明木犀草素可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志基因高表達(dá)，而且還可以誘導(dǎo)其形態(tài)特征向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，說(shuō)明其可以誘導(dǎo)木犀草素向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，后期再經(jīng)過(guò)一定的刺激，可以分化為神經(jīng)細(xì)胞。

本發(fā)明木犀草素可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向定向分化，分化得到的細(xì)胞具有明顯的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，同時(shí)高表達(dá)nestin、GFAP、MAP2、NEFH等神經(jīng)細(xì)胞特異性基因，可以作為治療神經(jīng)損傷的原材料，臨床應(yīng)用前景良好。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說(shuō)明

圖1 hUC MSCs原代培養(yǎng)細(xì)胞照片

圖2木犀草素對(duì)hUC MSCs的形態(tài)學(xué)影響

圖3誘導(dǎo)之后神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況，GFAP用綠色熒光標(biāo)記，細(xì)胞核用藍(lán)色熒光標(biāo)記

圖4誘導(dǎo)之后神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況，GFAP用綠色熒光標(biāo)記，細(xì)胞核用藍(lán)色熒光標(biāo)記

具體實(shí)施方式

以下是通過(guò)藥效實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的有益效果。

實(shí)驗(yàn)例1 本發(fā)明誘導(dǎo)液誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞

1材料

健康足月剖腹產(chǎn)的臍帶1根,經(jīng)產(chǎn)婦同意用于科學(xué)研究。胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibcol),胰蛋白酶、木犀草素：成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制備(純度99％),鼠抗nestin、GFAP多克隆抗體、FITC羊抗鼠二抗(Santa cruz),Hoechst 33258(碧云天)。cDNA合成試劑盒(Fermentas公司，K1632)，qPCR試劑盒(Roche公司，04913850001)。hUC MSCs培養(yǎng)基組成:90％DMEM/F12+10％FBS

2.方法

2.1hUC MSCs的原代培養(yǎng)、傳代及擴(kuò)增:

無(wú)菌條件下取出剖宮產(chǎn)出生的健康足月新生兒臍帶組織，將其置于含有1％雙抗(青鏈霉素)無(wú)菌生理鹽水中50ml離心管中。將臍帶組織放入超凈臺(tái)中的無(wú)菌彎盤里，以無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗臍帶組織數(shù)次后，將其切成長(zhǎng)約1cm的小段，剔除血管，放入培養(yǎng)皿，用滅菌剪刀快速將臍帶組織剪碎，約lmm×lmm×lmm左右。將組織碎塊攤開，使其均勻分布于培養(yǎng)皿的底部，向培養(yǎng)皿里輕輕加入含10％FBS的DMEM(F12)培養(yǎng)液，使其淹沒(méi)組織小塊，靜置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)第3天，補(bǔ)加培養(yǎng)液，培養(yǎng)第七天，半換培養(yǎng)液。待培養(yǎng)皿里出現(xiàn)4-5個(gè)比較明顯的克隆，去掉組織繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80％-90％時(shí)，用0.25％胰蛋白酶EDTA消化，按1:2比例傳代擴(kuò)增。

2.2木犀草素誘導(dǎo)hUC MSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期P3代細(xì)胞,0.05％胰蛋白酶EDTA消化,調(diào)整細(xì)胞密度1*10⁴/cm²,接種于24孔板。待細(xì)胞達(dá)80％融合時(shí),進(jìn)行誘導(dǎo)分化(誘導(dǎo)分化的時(shí)間為6天)，實(shí)驗(yàn)組：90％DMEM/F12、10％FBS和木犀草素10ug/ml(0.5‰)，對(duì)照組：90％DMEM/F12、10％FBS和0.5‰DMSO。倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察臍帶MSC s誘導(dǎo)前后形態(tài)學(xué)變化。

2.3向神經(jīng)細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化鑒定：(1)用PBS洗滌培養(yǎng)板細(xì)胞2次；(2)加入4％多聚甲醛固定15min；(3)用1‰PBS Triton洗滌2次；(4)加入封閉液封閉1h；(5)分別滴加適當(dāng)濃度的一抗(nestin、GFAP)，37℃孵育1h； (6)PBS Triton洗2次；(7)加FITC標(biāo)記的山羊抗鼠(150:1)，室溫孵育1h；(8)加入Hoechst 33258 5min；(9)PBS沖洗2次；加入抗淬滅劑；(8)熒光顯微鏡下觀察，拍照。

2.3神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)記基因的檢測(cè)：

誘導(dǎo)結(jié)束后，用Trizol提取兩組細(xì)胞的RNA，按cDNA合成說(shuō)明書合成cDNA,qPCR試劑盒進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)與神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)的NSE、nestin、GFAP、MAP2、NEFH 5種基因的表達(dá)情況，選人Gapdh基因?yàn)閮?nèi)參基因。針對(duì)上述基因的引物信息如表1。

表1針對(duì)5種標(biāo)識(shí)基因及內(nèi)參基因的引物信息

3數(shù)據(jù)分析：

所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS19.0分析所有數(shù)據(jù)。P＜0.05認(rèn)定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1本實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)觀察顯示原代培養(yǎng)的臍帶hUC MSCs呈成纖維樣細(xì)胞,平行排列或旋渦狀生長(zhǎng)(圖1)。

4.2誘導(dǎo)6天后：與對(duì)照組比較，終質(zhì)濃度為10ug/ml的木犀草素誘導(dǎo)hESCs后，胞核增大，細(xì)胞呈分叉狀改變，細(xì)胞伸出較多細(xì)長(zhǎng)的突起，類似于神經(jīng)細(xì)胞的樹突和軸突，呈現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞樣改變(圖2)；細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組大部分細(xì)胞神經(jīng)標(biāo)記物nestin、GFAP表達(dá)陽(yáng)性，平均熒光分別強(qiáng)度為2.64、4.72，對(duì)照組有少量細(xì)胞nestin、GFAP表達(dá)陽(yáng)性，平均熒光強(qiáng)度分別為0.24、0.46(圖3和圖4)。

4.3木犀草素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物的影響

運(yùn)用EXCEL軟件計(jì)算出各組各基因2^-△ct，經(jīng)SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)可得，所有數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布與方差齊性，故采用表示，兩組比較選用配對(duì)T檢驗(yàn)。

木犀草素對(duì)nestin、GFAP、MAP2、NEFH基因表達(dá)有明顯影響(P＜0.05),對(duì)NSE的影響不明顯。實(shí)驗(yàn)組nestin、GFAP、MAP2、NEFH mRNA為分別為對(duì)照組的2.08倍、1.64倍、1.93倍和6.76倍(表2)。

表2木犀草素對(duì)hUC MSCs的多個(gè)神經(jīng)分化標(biāo)識(shí)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響(n＝4)

注：木犀草組組與對(duì)照組比較，其中“△”表示P＜0.05，“*”表示P＜0.01

5討論

木犀草素誘導(dǎo)hUC MSCs后可以出現(xiàn)比較明顯的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。nestin為神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物，GFAP是神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白,是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗原。誘導(dǎo)6天之后實(shí)驗(yàn)組大部分細(xì)胞神經(jīng)標(biāo)志蛋白nestin、GFAP表達(dá)陽(yáng)性，nestin、GFAP、MAP2、NEFH等神經(jīng)細(xì)胞特異性基因表達(dá)明顯上調(diào)。

綜上，木犀草素可以誘導(dǎo)hUC MSCs出現(xiàn)比較明顯的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，同時(shí)高表達(dá)nestin、GFAP、MAP2、NEFH等神經(jīng)細(xì)胞特異性基因，說(shuō)明木犀草素可以誘導(dǎo)hUC MSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向定向分化，誘導(dǎo)制備得到的細(xì)胞，可以做為治療神經(jīng)損傷的原材料，臨床應(yīng)用前景良好。