亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

一種提高基因打靶的效率的方法及β?球蛋白基因位點的堿基原位修復(fù)方法與流程

文檔序號:12457217閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種提高基因打靶的效率的方法,其特征在于:包括以下步驟:

S10:確定基因原位修復(fù)的位點;

S20:引入CRISPR/Ca系統(tǒng)對編輯位點DNA進行切割造成DNA損傷,同時提供修復(fù)模板片段。

2.一種β-球蛋白基因位點的堿基原位修復(fù)方法,其特征在于:包括以下步驟:

(1)在人類地中海貧血的β-球蛋白基因缺陷的多能干細胞中對β-球蛋白基因位點的堿基進行原位修復(fù);

(2)靶向人β-球蛋白基因缺陷的載體誘導(dǎo)性多能干細胞的構(gòu)建;

(3)多能干細胞基因矯正效率的檢測;

(4)單鏈寡核苷酸ssODNs、spCas9-HF1載體β-地中海貧血的β-鏈球蛋白基因位點進行基因打靶修飾;

(5)提取DNA進行PCR分析。

3.如權(quán)利要求2所述的β-球蛋白基因位點的堿基原位修復(fù)方法,其特征在于:所述步驟(5)之后還包括測序進行驗證基因確定克隆的正確性的過程。

4.如權(quán)利要求2所述的β-球蛋白基因位點的堿基原位修復(fù)方法,其特征在于:所述步驟(5)中引物序列為:

F:5’ACGGCTGTCATCACTTAGACCT3’

R:5’TCCCCTTCCTATGACATGAACT3’

Rwt(5’TCCCCAAAGGACTCAAAGAACC3’)

RΔ(5’AGATCCCCAAAGGACTCAACC3’)。

5.如權(quán)利要求3所述的β-球蛋白基因位點的堿基原位修復(fù)方法,其特征在于:所述測序為高通量測序。

6.如權(quán)利要求2所述的β-球蛋白基因位點的堿基原位修復(fù)方法,其特征在于:所述步驟(2)中,具體過程為:從確診為中海貧血β-41/42球蛋白基因純合外顯子的患者獲取皮膚;從皮膚中分離成纖維細胞;對所得到的成纖維細胞進行轉(zhuǎn)染;轉(zhuǎn)染后的成纖維細胞接種在基質(zhì)膠鋪墊的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng);再將誘導(dǎo)性多能干細胞接種于基質(zhì)膠鋪墊的組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng),并每3~4天利用干細胞技術(shù)傳代一次。

7.如權(quán)利要求2所述的β-球蛋白基因位點的堿基原位修復(fù)方法,其特征在于:所述步驟(3)中,具體過程為:使用慢病毒pwpsld構(gòu)建EGFP表達雙熒光報告載體:pef1α-mcherry-2a-Δ41/42-egfp。

8.如權(quán)利要求2所述的β-球蛋白基因位點的堿基原位修復(fù)方法,其特征在于:所述步驟(4)中,具體過程為:

①取多能干細胞,spCas9/HF1載體,ssODN4進行轉(zhuǎn)染;

②轉(zhuǎn)染后放入Y-27632抑制劑12~48小時,加入小分子化合物L(fēng)755507;

③轉(zhuǎn)染后36~72小時,分選表達綠色熒光的細胞。

9.如權(quán)利要求8所述的β-球蛋白基因位點的堿基原位修復(fù)方法,其特征在于:所述步驟①中取多能干細胞1×106個,spCas9/HF1載體8ug,ssODN4 2μg進行轉(zhuǎn)染。

10.如權(quán)利要求8所述的β-球蛋白基因位點的堿基原位修復(fù)方法,其特征在于:所述步驟②中轉(zhuǎn)染后放入10μM Y-27632抑制劑24小時。

當(dāng)前第2頁1 2 3 
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1