本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領域：
中定點突變ApoE基因的方法。
背景技術(shù)：
：CRISPR/Cas是細菌和古細菌中一種有效的獲得性免疫機制，CRISPR簇是一個廣泛存在于細菌和古生菌基因組中的特殊DNA重復序列家族，根據(jù)Cas位點基因組織源性、參與的Cas蛋白質(zhì)的不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)分為I型、II型和III型。II型CRISPR/Cas系統(tǒng)僅存在于細菌中，以Cas9蛋白以及向?qū)NA(gRNA)為核心組成，當機體抵御噬菌體等外源DNA入侵時，在前導區(qū)的調(diào)控下，CRISPR被轉(zhuǎn)錄為長的RNA前體(pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重復序列和間隔區(qū)的成熟crRNA，crRNA以及與crRNA重復序列互補的反式激活crRNA(tracrRNA)和Cas9三者組成復合體，最終識別、結(jié)合到與其互補的外源DNA序列上發(fā)揮剪切作用。II型CRISPR/Cas系統(tǒng)在各物種如：小鼠、大鼠、豬、牛、羊、狒狒、水稻、小麥、擬南芥等均得到了較為廣泛的運用。其編輯效率較同源重組、ZFNs、TALEN等前幾代基因編輯手段有較大的提高，并且實驗環(huán)節(jié)少、周期短、費用更低。ApoE蛋白是一種載脂蛋白，存在于極低密度脂蛋白(verylow-densitylipoprotein,VLDL)、乳糜微粒(chylomicrons,CM)、中間密度脂蛋白(Intermediate-densitylipoprotein，IDLs)和高密度脂蛋白(high-densitylipoprotein,HDL)中，為富含甘油三酯的脂蛋白成分的正常代謝所必需的。人類ApoE基因缺陷或基因變異與心血管疾病、老年癡呆等疾病有關(guān)，是高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化的主效基因。制備ApoE基因突變動物模型具有重要科研及醫(yī)學價值。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何對ApoE基因進行定點突變。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了定點突變ApoE基因的方法，所述方法為采用CRISPR/Cas9方法進行定點突變，所述CRISPR/Cas9方法中使用的ApoE基因靶序列為如下A1)、A2)或A3)：A1)序列表中序列1的核苷酸序列；A2)與A1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由A1)衍生的DNA序列；A3)在嚴格條件下與A1)限定的DNA序列雜交的由A1)衍生的DNA序列。這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發(fā)明的序列1的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。上述方法中，所述嚴格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述定點突變ApoE基因的方法可包括向離體的受體動物細胞中導入靶向ApoE基因靶序列的gRNA的編碼基因與Cas9的編碼基因，得到ApoE基因被定點突變的動物細胞。上述方法中，所述靶向ApoE基因靶序列的gRNA的編碼基因可通過表達載體1導入所述受體動物細胞中，所述表達載體1為含有所述靶向ApoE基因靶序列的gRNA的編碼基因的表達盒的表達載體。在本發(fā)明的一個實施例中，所述表達載體1為U6-sgRNA-ApoE2，U6-sgRNA-ApoE2為在pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin的序列中插入可識別序列1的寡核苷酸二聚體得到的重組載體。上述方法中，所述Cas9的編碼基因可通過表達載體2導入所述受體動物細胞中，所述表達載體2為含有所述Cas9的編碼基因的表達盒的表達載體。在本發(fā)明的一個實施例中，所述表達載體2為Addgene的貨號為#44758的Cas9表達載體。上述方法中，所述靶向ApoE基因靶序列的gRNA的序列可為將序列表中序列2中的T替換為U得到的序列；所述靶向ApoE基因靶序列的gRNA的編碼基因為序列表中序列2所示的DNA分子。上述方法中，所述受體動物細胞可為哺乳動物細胞。所述哺乳動物細胞具體可為豬細胞，如豬胎兒成纖維細胞。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述任一產(chǎn)品：P1、所述gRNA；P2、所述gRNA的編碼基因；P3、含有所述gRNA的編碼基因的表達盒；P4、含有所述gRNA的編碼基因的重組載體。上述產(chǎn)品中，P3所述的含有所述gRNA的編碼基因的表達盒，是指能夠在宿主細胞中表達所述gRNA的DNA，該DNA不但可包括啟動所述gRNA的編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止所述gRNA的編碼基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。可用現(xiàn)有的表達載體構(gòu)建含有所述gRNA的編碼基因表達盒的重組載體。所述表達載體具體可為pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了定點突變ApoE基因的成套試劑，所述成套試劑由所述產(chǎn)品和下述M1-M3中的任一種組成；M1、Cas9的編碼基因；M2、含有Cas9的編碼基因的表達盒；M3、含有Cas9的編碼基因的表達載體。上述成套試劑中，M2所述的含有Cas9的編碼基因的表達盒，是指能夠在宿主細胞中表達Cas9的DNA，該DNA不但可包括啟動Cas9的編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止Cas9的編碼基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。可用現(xiàn)有的表達載體構(gòu)建含有Cas9的編碼基因表達盒的重組載體。所述含有Cas9的編碼基因的表達載體具體可為Addgene的貨號為#44758的Cas9表達載體。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述任一應用：X1、所述ApoE基因靶序列在定點突變ApoE基因中的應用；X2、所述產(chǎn)品在定點突變ApoE基因中的應用；X3、所述成套試劑在定點突變ApoE基因中的應用；X4、所述ApoE基因靶序列在制備ApoE基因定點突變動物模型中的應用；X5、所述產(chǎn)品在制備ApoE基因定點突變動物模型中的應用；X6、所述成套試劑在制備ApoE基因定點突變動物模型中的應用。上述應用中，所述動物可為哺乳動物。所述哺乳動物具體可為豬。本發(fā)明中，pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin為addgene的貨號為#51133的產(chǎn)品。實驗證明，本發(fā)明的ApoE-gRNA能高效識別ApoE基因，在CAS9酶作用下實現(xiàn)準確切割，在cas9切割位點附近出現(xiàn)的突變類型有：單堿基插入、多堿基插入、單堿基刪除和多堿基刪除四種突變類型，對ApoE基因平均編輯效率達86％，其中，平均單等位基因(APOE-/+)編輯效率為72％，平均雙等位基因(APOE-/-)編輯效率為14％，可以制造大量的ApoE基因突變類型，為后期對豬ApoE基因的突變及功能分析提供了實驗基礎。本發(fā)明的定點突變ApoE基因的方法可以用來定點突變ApoE基因，還可以用來制備ApoE基因缺陷疾病動物模型。附圖說明圖1為轉(zhuǎn)染U6-sgRNA-ApoE248h后細胞混池PCR測序。圖中黑色區(qū)域所示為gRNA設計位點。圖2為細胞單克隆突變類型分析。圖3為轉(zhuǎn)染U6-sgRNA-LDLR1與U6-sgRNA-LDLR248h后細胞混池PCR測序。A：CAS9/U6-sgRNA-LDLR1轉(zhuǎn)染后混池PCR測序峰圖；B：CAS9/U6-sgRNA-LDLR2轉(zhuǎn)染后混池PCR測序峰圖；圖中LDLR-E2-1與LDLR-E2-2分別表示LDLR1-gRNA與LDLR2-gRNA的識別位點。圖4為轉(zhuǎn)染U6-sgRNA-LDLR1與U6-sgRNA-LDLR2后細胞單克隆突變類型分析。其中，LDLR-e2-1與LDLR-e2-2分別表示轉(zhuǎn)染U6-sgRNA-LDLR1與U6-sgRNA-LDLR2；“+”表示插入；“△”表示刪除；“wt”表示野生型。圖5為轉(zhuǎn)染U6-sgRNA-LDLR1與U6-sgRNA-LDLR2以及U6-sgRNA-ApoE248h后細胞混池PCR測序。圖中APOE-E2、LDLR-E2-1與LDLR-E2-2分別表示APOE-gRNA、LDLR1-gRNA與LDLR2-gRNA的識別位點。A與B分別為轉(zhuǎn)染U6-sgRNA-ApoE2/U6-sgRNA-LDLR1后細胞混池APOE和LDLR基因PCR測序峰圖；C與D分別為轉(zhuǎn)染U6-sgRNA-ApoE2/U6-sgRNA-LDLR1后細胞混池APOE和LDLR基因PCR測序峰圖。圖6為細胞單克隆突變類型分析，其中，A為轉(zhuǎn)染U6-sgRNA-ApoE2/U6-sgRNA-LDLR1的結(jié)果，B為轉(zhuǎn)染U6-sgRNA-ApoE2/U6-sgRNA-LDLR2后的結(jié)果；APOE-e2表示ApoE基因的突變結(jié)果；LDLR-e2-1與LDLR-e2-2分別表示轉(zhuǎn)染U6-sgRNA-LDLR1與U6-sgRNA-LDLR2LDLR基因的突變情況；“+”表示插入；“△”表示刪除；“wt”表示野生型；“#”為克隆編號。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的豬胎兒成纖維細胞(porcineembryonicfibroblast，PEF)按照如下方法制備：將巴馬小型豬37日齡胚胎，去除胎兒的頭、尾、四肢、內(nèi)臟和骨頭，并將血液清理干凈。用彎頭眼科剪持續(xù)剪切胎兒30min保證充分剪碎，將剪碎的胎兒組織用剪頭的藍槍頭吸取到15mL離心管中，加入5mL全培養(yǎng)基，自然沉降數(shù)分鐘后除去上面溶液，并在下層組織塊中加入幾滴FBS，用尖端1cm處彎曲的15cm玻璃巴氏管吸出，平鋪于兩個T75培養(yǎng)瓶中，瓶底朝上放置，并在對側(cè)加入15mL全培養(yǎng)液，于6-8h后小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，將組織塊浸入培養(yǎng)液中，每兩天換一次液，待細胞長滿T75培養(yǎng)瓶后凍存?zhèn)溆谩Ｆ渲?，巴馬小型豬為中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所天津基地豬場飼養(yǎng)的豬。實施例1、ApoE基因的定點突變本實施例所提供的特異識別豬ApoE基因gRNA(將其命名為ApoE-gRNA)從5’端到3’端依次為：19nt的堿基(與ApoE基因靶序列特異結(jié)合的序列，ApoE基因靶序列為序列表中序列1)，一個長42nt的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(負責與Cas9蛋白結(jié)合引導Cas9核酸酶對DNA進行切割)，3’端一個長40nt的轉(zhuǎn)錄終止子。ApoE-gRNA的序列為將序列表中序列2中的T替換為U得到的序列，ApoE-gRNA由序列表中序列2所示的DNA分子編碼。在成熟的ApoE-gRNA的引導作用下Cas9結(jié)合到ApoE基因，并對其進行切割，引入雙鏈斷裂(DSB)，誘發(fā)DNA損傷修復，在靶位點附近引入突變，制造多種ApoE基因突變體。一、表達載體構(gòu)建所用骨架載體為pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin(addgene產(chǎn)品，貨號為#51133，以下簡稱U6-sgRNA)，gRNA表達載體具體構(gòu)建過程如下：1、骨架載體制備U6-sgRNA骨架載體酶切回收：50μl酶切體系如下：10μgU6-sgRNA，5μlBbsI(NEB)，5μlcutsmartbuffer(NEB)，ddH2O補至50μl。2、寡核苷酸二聚體形成及去磷酸化反應體系如下：ApoE-e2-F與ApoE-e2-R的引物序列如表1所示。表1、ApoE-gRNA構(gòu)建引物序列名稱序列(5’-3’)ApoE-e2-FACCGgaggtgcacgtgtggtgggApoE-e2-RAAACcccaccacacgtgcacctc混勻上述體系，使用PCR儀進行退火反應，程序如下：3、U6-sgRNA-ApoE2的制備將步驟2得到的寡核苷酸二聚體與步驟1得到的骨架載體進行連接，16℃連接1h，得到重組載體。具體反應體系如下：50ng步驟1得到的骨架載體，步驟2得到的寡核苷酸二聚體(1:200稀釋)，1μl10×T4LigaseBuffer(TKARA)，1μlT4Ligase(TKARA)，ddH2O補至11μl。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并測序驗證得到序列正確的表達ApoE-gRNA的重組載體，將其命名為U6-sgRNA-ApoE2。二、轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞及驗證實驗重復三次，每次重復實驗的具體步驟如下：采用核轉(zhuǎn)染的方法將步驟一得到的U6-sgRNA-ApoE2以及Cas9表達載體(Addgene產(chǎn)品，貨號為#44758)各5μg轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞(約1×106個)，核轉(zhuǎn)染嚴格按照試劑盒(CatalogNumber：VPI-1002，Lonza)和細胞核轉(zhuǎn)染儀(Amaxa公司)說明書操作，選用T-016程序。核轉(zhuǎn)染后48h，利用細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(bioteke，DP1901)提取細胞基因組DNA。以上述提取的DNA為模板，擴增包含ApoE-gRNA結(jié)合位點的ApoE基因，擴增引物如下表，回收約698bpPCR產(chǎn)物。擴增條件如下：預變性98℃3min，98℃10s，63℃15s，72℃40s，循環(huán)33次72℃5min再延伸。表2、ApoE擴增引物名稱序列(5’-3’)ApoE-FGCAGGGCGTGAGCATTAGATApoE-RAGGACGGCAAGACTGACCCA對PCR產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果如圖1所示，在cas9核酸酶切割位點下游開始出現(xiàn)套峰，證明cas9核酸酶成功對豬ApoE基因進行切割。圖中黑色方框中所示為ApoE-gRNA結(jié)合位置，套峰顯示該位點有多個堿基類型。三、克隆形成能力及克隆突變類型分析實驗重復三次，每次重復實驗的具體步驟如下：采用核轉(zhuǎn)染的方法將步驟一得到的U6-sgRNA-ApoE2以及Cas9表達載體(Addgene產(chǎn)品，貨號為#44758)各5μg轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞(約1×106個)，核轉(zhuǎn)染嚴格按照試劑盒和核轉(zhuǎn)儀說明書操作，選用T-016程序。核轉(zhuǎn)染后24h，加入1μg/mL嘌呤霉素處理，36h后用0.1％胰酶消化，收集細胞，接種到3個100mm細胞培養(yǎng)皿中(1×104個/皿)，細胞培養(yǎng)皿中含有DMEM培養(yǎng)基(ThermoFisherScientific)，培養(yǎng)15天至單克隆形成，每兩天更換新鮮培養(yǎng)基。挑取單克隆細胞，提取單克隆基因組，擴增ApoE基因并測序(PCR擴增條件同步驟二)。對挑取的單克隆做突變類型分析，在cas9切割位點附近出現(xiàn)單堿基插入、多堿基插入、單堿基刪除和多堿基刪除四種突變類型(圖2)。圖中綠色短線示意ApoE-gRNA識別序列在ApoE基因中的位置，紅色短線示意PAM序列，序列對比圖顯示詳細的突變類型情況，其中首行序列為野生型ApoE基因序列。表3、平均敲除效率單等位基因敲除效率雙等位基因敲除效率敲除效率總計72％14％86％結(jié)果顯示，本發(fā)明的ApoE-gRNA能高效識別豬ApoE基因第二外顯子，在CAS9酶作用下實現(xiàn)準確切割，結(jié)果(表3)顯示，CAS9/U6-sgRNA-ApoE2系統(tǒng)對豬ApoE基因平均編輯效率為86％(即豬細胞兩條染色體上的ApoE基因均被編輯(基因型為APOE-/-)的單克隆占總單克隆數(shù)的比例與一條染色體上的ApoE基因被編輯(基因型為APOE-/+)的單克隆占總單克隆數(shù)的比例之和)，其中，平均單等位基因編輯效率為72％(即豬細胞中只有一條染色體上的ApoE基因被編輯(基因型為APOE-/+)的單克隆占總單克隆數(shù)的比例)，平均雙等位基因(基因型為APOE-/-)編輯效率為14％(即豬細胞中的兩條染色體上的ApoE基因均被編輯的單克隆占總單克隆數(shù)的比例)。同時制造了大量的基因突變類型，為后期對豬ApoE基因的突變及功能分析提供了實驗基礎。實施例2、LDLR基因的定點突變本實施例提供提供了兩個特異識別豬LDLR基因的gRNA，分別為LDLR1-gRNA與LDLR2-gRNA，LDLR1-gRNA與LDLR2-gRNA從5’端到3’端均依次為：19nt或20nt的堿基(與LDLR基因靶序列特異結(jié)合的序列，LDLR1-gRNA在LDLR基因中的靶序列為序列表中序列3，LDLR2-gRNA在LDLR基因中的靶序列為序列表中序列4)，一個長42nt的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(負責與Cas9蛋白結(jié)合引導Cas9核酸酶對DNA進行切割)，3’端一個長40nt的轉(zhuǎn)錄終止子。LDLR1-gRNA的序列為將序列表中序列5中的T替換為U得到的序列，LDLR1-gRNA由序列表中序列5所示的DNA分子編碼；LDLR2-gRNA的序列為將序列表中序列6中的T替換為U得到的序列，LDLR2-gRNA由序列表中序列6所示的DNA分子編碼。在成熟的LDLR1-gRNA或LDLR2-gRNA的引導作用下Cas9結(jié)合到LDLR基因，并對其進行切割，引入雙鏈斷裂(DSB)，誘發(fā)DNA損傷修復，在靶位點附近引入突變，制造多種LDLR基因突變體。一、表達載體構(gòu)建所用骨架載體為pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin(addgene產(chǎn)品，貨號為#51133，以下簡稱U6-sgRNA)，gRNA表達載體具體構(gòu)建過程如下：1、骨架載體制備同實施例1步驟一中1。2、寡核苷酸二聚體形成及去磷酸化按照實施例1步驟一中2的方法，將ApoE-e2-F與ApoE-e2-R替換為LDLR-e2-1-F與LDLR-e2-1-R，其他步驟均不變，得到LDLR1寡核苷酸二聚體。按照實施例1步驟一中2的方法，將ApoE-e2-F與ApoE-e2-R替換為LDLR-e2-2-F與LDLR-e2-2-R，其他步驟均不變，得到LDLR2寡核苷酸二聚體。LDLR-e2-1-F與LDLR-e2-1-R、LDLR-e2-2-F與LDLR-e2-2-R的序列如表4所示。表4、gRNA構(gòu)建引物序列3、U6-sgRNA-LDLR1與U6-sgRNA-LDLR2的制備將步驟2得到的LDLR1寡核苷酸二聚體與步驟1得到的骨架載體進行連接，16℃連接1h，得到重組載體。具體反應體系如下：50ng步驟1得到的骨架載體，步驟2得到的LDLR1寡核苷酸二聚體(1:200稀釋)，1μl10×T4LigaseBuffer(TKARA)，1μlT4Ligase(TKARA)，ddH2O補至11μl。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并測序驗證得到序列正確的表達LDLR1-gRNA的重組載體，將其命名為U6-sgRNA-LDLR1。將步驟2得到的LDLR2寡核苷酸二聚體與步驟1得到的骨架載體進行連接，16℃連接1h，得到重組載體。具體反應體系如下：50ng步驟1得到的骨架載體，步驟2得到的LDLR2寡核苷酸二聚體(1:200稀釋)，1μl10×T4LigaseBuffer(TKARA)，1μlT4Ligase(TKARA)，ddH2O補至11μl。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并測序驗證得到序列正確的表達LDLR1-gRNA的重組載體，將其命名為U6-sgRNA-LDLR2。二、轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞及驗證實驗重復三次，每次重復實驗的具體步驟如下：按照實施例1步驟二中的核轉(zhuǎn)染的方法將步驟一得到的U6-sgRNA-LDLR1以及Cas9表達載體(Addgene產(chǎn)品，貨號為#44758)各5μg轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞(約1×106個)。核轉(zhuǎn)染后48h，利用細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取細胞基因組DNA。以上述提取的DNA為模板，擴增包含LDLR1-gRNA結(jié)合位點的LDLR基因，擴增引物如下表5，回收約850bpPCR產(chǎn)物。擴增條件如下：預變性98℃3min，98℃10s，63℃15s，72℃40s，循環(huán)33次72℃5min再延伸。表5、LDLR擴增引物名稱序列(5’-3’)LDLR-FCCTCCACGATGTTGTTGGTTLDLR-RGACCAGTTGGTAAGGGCTAT按照實施例1步驟二中的核轉(zhuǎn)染的方法將步驟一得到的U6-sgRNA-LDLR2以及Cas9表達載體(Addgene產(chǎn)品，貨號為#44758)各5μg轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞(約1×106個)。核轉(zhuǎn)染后48h，利用細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取細胞基因組DNA。利用LDLR-F與LDLR-R進行PCR擴增，擴增條件同上。測序結(jié)果如圖3顯示，轉(zhuǎn)染U6-sgRNA-LDLR1在cas9核酸酶切割位點下游開始出現(xiàn)套峰(圖3中A)，證明本實驗成功對豬LDLR基因進行切割。gRNA結(jié)合位置和PAM序列如圖所示，套峰顯示該位點有多個堿基類型。其中U6-sgRNA-LDLR2套峰幾乎不可見，圖3中B。回收上述PCR產(chǎn)物，分別與PMD-18T載體(寶生物工程(大連)有限公司，D101A)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，每組挑取40個克隆進行測序，根據(jù)陽性克隆數(shù)計算突變效率，轉(zhuǎn)染U6-sgRNA-LDLR1的平均突變率為26.7％，轉(zhuǎn)染U6-sgRNA-LDLR2的平均突變率為9.7％。三、克隆形成能力及克隆突變類型分析實驗重復三次，每次重復實驗的具體步驟如下：按照實施例1步驟二中的核轉(zhuǎn)染的方法將步驟一得到的U6-sgRNA-LDLR1或U6-sgRNA-LDLR2與Cas9表達載體轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞，核轉(zhuǎn)染后24h，加入1μg/mL嘌呤霉素處理，36h后用0.1％胰酶消化，收集細胞，接種到3個100mm細胞培養(yǎng)皿中(1×104個/皿)，細胞培養(yǎng)皿中含有DMEM培養(yǎng)基(ThermoFisherScientific)，培養(yǎng)15天至單克隆形成，每兩天更換新鮮培養(yǎng)基。挑取單克隆細胞，提取單克隆基因組，擴增ApoE基因并測序(PCR擴增條件同步驟二)。對挑取的單克隆做突變類型分析(圖4)，在cas9切割位點附近出現(xiàn)單堿基插入、多堿基插入、單堿基刪除和多堿基刪除四種突變類型。圖中下劃線示意gRNA或gRNA的識別序列在LDLR基因中的位置，序列對比圖顯示詳細的突變類型情況，其中首行序列為野生型LDLR基因序列。表6、平均敲除效率名稱單等位基因敲除效率雙等位基因敲除效率敲除效率總計LDLR119％31％50％LDLR232％14％46％結(jié)果顯示，本發(fā)明的LDLR1-gRNA與LDLR2-gRNA均能高效識別豬LDLR基因第二外顯子，在CAS9酶作用下實現(xiàn)準確切割，其中CAS9/U6-sgRNA-LDLR1系統(tǒng)對豬LDLR基因平均編輯效率為50％(即豬細胞兩條染色體上的LDLR基因均被編輯的單克隆占總單克隆數(shù)的比例與一條染色體上的LDLR基因被編輯的單克隆占總單克隆數(shù)的比例之和)，其中，平均單等位基因編輯效率為19％(即豬細胞中只有一條染色體上的LDLR基因被編輯的單克隆占總單克隆數(shù)的比例(基因型為LDLR-/+))，平均雙等位基因編輯效率為31％(即豬細胞中的兩條染色體上的LDLR基因均被編輯的單克隆占總單克隆數(shù)的比例(基因型為LDLR-/-))；CAS9/U6-sgRNA-LDLR2系統(tǒng)對豬LDLR基因平均編輯效率為46％(即豬細胞兩條染色體上的LDLR基因均被編輯的單克隆占總單克隆數(shù)的比例與一條染色體上的LDLR基因被編輯的單克隆占總單克隆數(shù)的比例之和)，其中，平均單等位基因編輯效率為32％(即豬細胞中只有一條染色體上的LDLR基因被編輯的單克隆占總單克隆數(shù)的比例)，平均雙等位基因編輯效率為14％(即豬細胞中的兩條染色體上的LDLR基因均被編輯的單克隆占總單克隆數(shù)的比例)。同時制造了大量的基因突變類型，為后期對豬LDLR基因的突變及功能分析提供了實驗基礎。實施例3、ApoE基因與LDLR基因的定點突變本實施例利用實施例1的ApoE-gRNA與實施例2的LDLR1-gRNA或LDLR2-gRNA對ApoE基因與LDLR基因同時進行定點突變。實驗重復三次，每次重復實驗的具體步驟如下：一、轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞及驗證采用核轉(zhuǎn)染的方法將實施例1的U6-sgRNA-ApoE2(2.5μg)與實施例2的U6-sgRNA-LDLR1(2.5μg)混合后分別與5μgCas9表達載體(Addgene產(chǎn)品，貨號為#44758)共轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞(約1×106個)，核轉(zhuǎn)染嚴格按照試劑盒和核轉(zhuǎn)儀說明書操作，選用T-016程序。核轉(zhuǎn)染后48h，利用細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(bioteke，DP1901)提取細胞基因組，將得到的基因組命名為基因組1。按照上述方法，將U6-sgRNA-LDLR1替換為U6-sgRNA-LDLR2，其他步驟不變，得到細胞基因組，將得到的基因組命名為基因組2。利用實施例1的ApoE-F與ApoE-R以及實施例2的LDLR-F與LDLR-R分別對基因組1與基因組2進行PCR擴增，條件同實施例1與實施例2。分別回收約698bp和850bpPCR產(chǎn)物進行測序。測序結(jié)果如圖5顯示，轉(zhuǎn)染U6-sgRNA-ApoE2/U6-sgRNA-LDLR1在cas9核酸酶切割位點下游，APOE基因和LDLR基因均出現(xiàn)套峰(圖5中A和B)，證明本實驗成功對豬APOE基因與LDLR基因進行定點切割，gRNA結(jié)合位置和PAM序列如圖所示，套峰顯示該位點有多個堿基類型。轉(zhuǎn)染U6-sgRNA-ApoE2/U6-sgRNA-LDLR2中LDLR基因的套峰幾乎不可見，圖5中C和D。二、克隆形成能力及克隆突變類型分析采用核轉(zhuǎn)染的方法將實施例1的U6-sgRNA-ApoE2(2.5μg)與實施例2的U6-sgRNA-LDLR1(2.5μg)混合后分別與5μgCas9表達載體(Addgene產(chǎn)品，貨號為#44758)共轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞，核轉(zhuǎn)染嚴格按照試劑盒和核轉(zhuǎn)儀說明書操作，選用T-016程序。核轉(zhuǎn)染后24h，加入1μg/mL嘌呤霉素處理，36h后用0.1％胰酶消化，收集細胞，收集細胞，接種到3個100mm細胞培養(yǎng)皿中(1×104個/皿)，細胞培養(yǎng)皿中含有DMEM培養(yǎng)基(ThermoFisherScientific)，培養(yǎng)15天至單克隆形成，每兩天更換新鮮培養(yǎng)基。挑取單克隆細胞，提取單克隆基因組，利用實施例1的ApoE-F與ApoE-R以及實施例2的LDLR-F與LDLR-R進行PCR擴增，條件同實施例1與實施例2。按照上述方法，將U6-sgRNA-LDLR1替換為U6-sgRNA-LDLR2，其他均不變，對轉(zhuǎn)染的得到的單克隆細胞進行檢測。對挑取的單克隆做突變類型分析(圖6)，在cas9切割位點附近出現(xiàn)單堿基插入、多堿基插入、單堿基刪除和多堿基刪除四種突變類型。圖中下劃線示意gRNA序列在APOE和LDLR基因中的位置，序列對比圖顯示詳細的突變類型情況，其中首行序列為對應基因野生型序列。結(jié)果顯示，本發(fā)明所述gRNA能同時高效識別豬APOE和LDLR基因第二外顯子，在CAS9酶作用下實現(xiàn)準確切割，其中CAS9/U6-sgRNA-ApoE2/U6-sgRNA-LDLR1系統(tǒng)對豬APOE/LDLR兩個基因同時完成編輯的雙等位基因編輯效率為31％(即豬細胞的兩條染色體上的APOE基因均被編輯以及兩條染色體上的LDLR基因均被編輯的效率(基因型為APOE-/-/LDLR-/-))；CAS9/U6-sgRNA-ApoE2/U6-sgRNA-LDLR2系統(tǒng)對豬APOE/LDLR基因平均雙等位基因編輯效率為14％(基因型為APOE-/-/LDLR-/-)。同時獲得了攜帶多種突變類型的LDLR基因與APOE基因均突變的細胞，為后期對豬APOE基因/LDLR基因的突變及功能分析提供了實驗基礎。當前第1頁1 2 3