專利名稱：組織型纖溶酶原激活劑突變體的復(fù)性分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)重組蛋白分離純化技術(shù)領(lǐng)域。
二.
背景技術(shù)：
瑞替普酶是一種用基因定點(diǎn)突變技術(shù)，在大腸桿菌中表達(dá)生產(chǎn)的基因重組人組織型纖溶酶原激活劑突變體。屬于單鏈無(wú)糖基化多肽，含355個(gè)氨基酸，具有天然人組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，t-PA)的1～3，176～527號(hào)氨基酸編碼序列。只攜帶野生型t-PA的kringle2結(jié)構(gòu)域和蛋白酶結(jié)構(gòu)域的瑞替普酶，以其16～20分鐘較長(zhǎng)的半衰期，更快更徹底的溶栓作用和較少顱內(nèi)出血危險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)成為較為理想的溶血栓藥物。
由于瑞替普酶含有10對(duì)二硫鍵，在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)形成包涵體形式，溶解變性后用常規(guī)方法復(fù)性很難正確折疊和復(fù)性成活性狀態(tài)。這是由于組成十對(duì)二硫鍵的20個(gè)半胱氨酸在復(fù)性時(shí)錯(cuò)誤配對(duì)造成的。而用還原型和氧化型谷胱甘肽與其它復(fù)性試劑按一定比例復(fù)性瑞替普酶雖能獲得成功，但成本卻十分昂貴。
三.

發(fā)明內(nèi)容
為了提高變性瑞替普酶的復(fù)性率，降低瑞替普酶的生產(chǎn)成本，我們發(fā)明了設(shè)計(jì)含有(His)6和factor Xa切割位點(diǎn)的上游引物以擴(kuò)增瑞替普酶，六個(gè)組氨酸為純化標(biāo)簽與瑞替普酶融合表達(dá)，兩段之間加有factor Xa以除去純化標(biāo)簽獲得正確的目的蛋白。然后把瑞替普酶插入合適的表達(dá)載體中進(jìn)行融合表達(dá)。如此融合表達(dá)的瑞替普酶在適當(dāng)?shù)臈l件下在Ni2+-HiTrap柱上，可以復(fù)性、分離純化一步完成。所用試劑都是普通級(jí)別的，而且步驟簡(jiǎn)單。本發(fā)明不但簡(jiǎn)化了復(fù)性分離純化的程序，還能提高復(fù)性率，最終提高瑞替普酶的產(chǎn)率，大大降低生產(chǎn)成本，并能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明需要解決的問(wèn)題是用低廉的普通的一些試劑在適當(dāng)?shù)臈l件下，促進(jìn)瑞替普酶形成正確配對(duì)的二硫鍵，完成分子結(jié)構(gòu)重排，形成正確活性形式，達(dá)到復(fù)性目的。同時(shí)設(shè)計(jì)了(His)6純化標(biāo)簽以簡(jiǎn)化后續(xù)的分離純化，(His)6純化標(biāo)簽與瑞替普酶之間的factor Xa切割位點(diǎn)，用factor Xa在瑞替普酶復(fù)性后去掉(His)6純化標(biāo)簽，獲得正確的目的蛋白。這樣就簡(jiǎn)化了瑞替普酶的下游工藝，節(jié)約生產(chǎn)成本。
技術(shù)方案本發(fā)明用尿素變性包涵體的溶解液中加入一定量的咪唑和2-巰基乙醇，以促進(jìn)瑞替普酶的復(fù)性。
設(shè)計(jì)含有(His)6和factor Xa切割位點(diǎn)的上游引物擴(kuò)增瑞替普酶→大腸桿菌表達(dá)瑞替普酶→收集菌體，超聲破碎→分離包涵體→尿素變性溶解，變性液中有低濃度咪唑和2-巰基乙醇→在Ni2+-HiTrap柱上復(fù)性與分離純化一步完成。經(jīng)上述步驟，即可制備得到純度大于96％，有活性的瑞替普酶。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供了一種快速而低廉的促進(jìn)瑞替普酶復(fù)性的新型工藝方法，它與現(xiàn)有的瑞替普酶生產(chǎn)工藝相比具有以下優(yōu)點(diǎn)；(1)變性的瑞替普酶復(fù)性率高。(2)復(fù)性體系中的瑞替普酶蛋白濃度提高，復(fù)性體積減少，節(jié)約時(shí)間。(3)所用試劑均為常用、低廉的普通級(jí)別，大大節(jié)省復(fù)性成本。(4)復(fù)性、分離純化都在柱上一步完成，極大限度的減少瑞替普酶的損失，提高瑞替普酶產(chǎn)率。這些優(yōu)勢(shì)使本發(fā)明具有十分明顯的技術(shù)性和工藝先進(jìn)性。而成本的降低，使瑞替普酶更適合于工業(yè)化生產(chǎn)，為瑞替普酶后續(xù)的普及應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
四.


圖1.瑞替普酶柱上復(fù)性純化后的活性測(cè)定。
五.
具體實(shí)施例方式
瑞替普酶制備方法如下將表達(dá)后的瑞替普酶工程菌菌體收集，懸浮于20mM Tris-HclPH8.0，超聲破碎并在4℃ 12000rpm，離心15分鐘，收集包涵體。包涵體用溶液I，其組分為6～8M尿素、10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、1～100mM咪唑、0～5mM 2-巰基乙醇PH8.0，室溫?cái)噭?dòng)，充分溶解后，4℃ 12000rpm，離心15分鐘，取上清，用0.22um或0.45um的濾膜過(guò)濾，就可以獲得變性的瑞替普酶溶液。
變性的瑞替普酶通過(guò)過(guò)柱前已用溶液I平衡的Ni2+-HiTrap柱，上樣后，先用兩倍柱體積的溶液I和溶液II，溶液II的組分為6～8M尿素、10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、20～500mM咪唑、0～100mM 2-巰基乙醇PH7～10，各洗滌一次，再以六倍柱體積的不含尿素的溶液III，溶液III的組分為10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、1～100mM咪唑、0～100mM2-巰基乙醇PH7～10洗滌。這一步驟之后，可加兩倍到四倍柱體積的溶液IV，其組分為10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、50mM～1M咪唑、0～5mM 2-巰基乙醇PH7～10，洗脫已折疊有活性的瑞替普酶。或在洗滌完后加入factor Xa，使之在柱上切割(His)6。最后用適當(dāng)濃度的NaCl洗脫有活性的瑞替普酶，得到正確的有活性的目的蛋白。
權(quán)利要求
1.一種組織型纖溶酶原激活劑重組突變體39KD瑞替普酶的復(fù)性方法，其特征在于用尿素變性包涵體的溶解液中加入一定量的咪唑和2-巰基乙醇，以促進(jìn)瑞替普酶的復(fù)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，組織型纖溶酶原激活劑重組突變體39KD的瑞替普酶的復(fù)性分離純化方法，其特征在于設(shè)計(jì)含有(His)6和factor Xa切割位點(diǎn)的上游引物擴(kuò)增瑞替普酶→大腸桿菌誘導(dǎo)融合表達(dá)瑞替普酶→收集菌體，超聲破碎→分離包涵體→尿素變性溶解(有低濃度咪唑和2-巰基乙醇)→在Ni2+-HiTrap柱上分離純化與復(fù)性一步完成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述，組織型纖溶酶原激活劑重組突變體39KD瑞替普酶的變性，其特征是以尿素為變性劑，變性溶液中含6～8M尿素，10～50mMTris-Hcl、0.5M NaCl、1～100mM咪唑、0～100mM 2-巰基乙醇PH7～10。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述，組織型纖溶酶原激活劑重組突變體39KD瑞替普酶的復(fù)性，其特征在于復(fù)性的過(guò)程是咪唑和尿素量的變化過(guò)程。咪唑的濃度逐漸加大，而尿素的量逐漸減少，直至沒有。上樣后復(fù)性是分三步洗滌，溶液的先后順序?yàn)閮杀吨w積的溶液I，溶液組分為6～8M尿素、10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、1～100mM咪唑、0～5mM 2-巰基乙醇PH7～10→兩倍柱體積的溶液II，溶液組分為6～8M尿素、10～100mMTris-Hcl、0.5M NaCl、20～500mM咪唑、0～100mM 2-巰基乙醇PH7～10→六倍體積的溶液III，溶液組分為10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、1～100mM咪唑、0～100mM 2-巰基乙醇PH7～10。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述溶液I、II、III洗滌完畢后，用兩到四倍柱體積的溶液IV，其溶液組分為10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、50mM～1M咪唑、0～100mM 2-巰基乙醇PH7～10，洗脫折疊復(fù)性的組織型纖溶酶原激活劑重組突變體39KD的瑞替普酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述溶液I、II、III洗滌完畢后，加入factor Xa，使之在柱上切割(His)6。最后用適當(dāng)濃度的NaCl洗脫有活性的瑞替普酶。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)重組蛋白分離純化技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種用低廉、普通級(jí)別的常用試劑咪唑和尿素，以它們的濃度梯度在合適的條件下，使在大腸桿菌中與(His)
文檔編號(hào)C12N9/00GK1556206SQ200410013849
公開日2004年12月22日 申請(qǐng)日期2004年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月8日
發(fā)明者沈子龍, 廖建民, 孫石靜, 張新元 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)