專利名稱：人干細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞集落刺激因子雙功能蛋白及制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程制備多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域。
二.
背景技術(shù)：
干細(xì)胞因子(SCF，也叫Kit配體，Steel因子，肥大細(xì)胞生長因子等)是一種多功能細(xì)胞因子，能促進(jìn)早期造血干細(xì)胞的增殖而不誘導(dǎo)細(xì)胞的分化，能在多級造血水平與其他細(xì)胞因子協(xié)同作用促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞及各種造血細(xì)胞的存活和增殖。其受體廣泛分布于不同系列、不同世代的造血細(xì)胞，包括紅細(xì)胞系、單核粒巨細(xì)胞系及巨核細(xì)胞系等。SCF能增強(qiáng)這些細(xì)胞的增殖能力并激活這些細(xì)胞使之對相應(yīng)的各種造血細(xì)胞因子的刺激更為敏感。臨床主要應(yīng)用于放療，化療和骨髓移植后造血和免疫功能的重建和恢復(fù)。另外SCF對骨髓干細(xì)胞體外擴(kuò)增和干細(xì)胞移植及基因治療中也有應(yīng)用前景。SCF單獨(dú)能促進(jìn)肥大細(xì)胞的生長。并能活化成熟的肥大細(xì)胞，促進(jìn)其脫顆粒，釋放組胺。故在應(yīng)用時大多數(shù)病人的注射部位會出現(xiàn)瘙癢風(fēng)疹，少數(shù)病人還會發(fā)生變態(tài)樣反應(yīng)。這種副作用限制了SCF的臨床應(yīng)用。
天然的SCF是一種糖蛋白，在正常生理?xiàng)l件下90％以上以單體形式存在，在局部高濃度時可以形成離子型同源二聚體，二聚體形式SCF活性比單體高10-20倍。
巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)是一種多功能的細(xì)胞因子，也是一種免疫調(diào)節(jié)劑。它能刺激骨髓干細(xì)胞分化成單核巨噬細(xì)胞并促進(jìn)其增殖及成熟。它還能特異地促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌、真菌和腫瘤細(xì)胞，并刺激巨噬細(xì)胞分泌G-CSF、GM-CSF、TNF、IL-6、IL-8等多種造血細(xì)胞因子。另外，它也是骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長因子，參與造血微環(huán)境及骨髓重建。在臨床上，M-CSF能有效提高骨髓移植及腫瘤病人放化療后的免疫功能，顯著提高這些病人感染致死性白色念珠菌和曲霉菌的存活率。但長期和大劑量使用M-CSF，能抑制造血過程，并造成對多種器官的損傷。天然的M-CSF是一種通過鏈間二硫鍵共價連接的同源二聚體形式的糖蛋白。
SCF與M-CSF具有協(xié)同作用，尤其在無血清培養(yǎng)條件下，其協(xié)同作用更為明顯。
利用M-CSF在天然條件下能通過cys31-cys31形成共價同源二聚體，且SCF與M-CSF具有協(xié)同作用這些特點(diǎn)，通過基因重組技術(shù)構(gòu)建并在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)同源二聚體形式的干細(xì)胞因子-巨噬細(xì)胞集落刺激因子雙功能蛋白(SCF/M-CSF)，以顯著提高SCF與M-CSF的活性，克服在臨床上因大劑量使用SCF及M-CSF時的引起的副作用。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明專利需要解決的技術(shù)問題是設(shè)計出了能保證SCF與M-CSF各自天然活性不受影響的柔性連接肽，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建一種干細(xì)胞因子-巨噬細(xì)胞集落刺激因子雙功能蛋白基因(rhSCF/M-CSF)，使之在Sf9細(xì)胞(Invitrogen)中高效分泌表達(dá)，并從培養(yǎng)液中分離純化rhSCF/M-CSF，以達(dá)到可應(yīng)用水平。成為一種性能比SCF和M-CSF單體蛋白更好的恢復(fù)造血和調(diào)節(jié)免疫功能的藥物。
本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容包括1.重組人干細(xì)胞因子-巨噬細(xì)胞集落刺激因子雙功能蛋白基因(rhSCF/M-CSF)的設(shè)計與構(gòu)建。2.高效分泌表達(dá)的rhSCF/M-CSF重組苜蓿夜蛾核型多角體病毒AcNPV-SCF/M-CSF的構(gòu)建。3.rhSCF/M-CSF在Sf9細(xì)胞中的分泌表達(dá)及其分離純化和鑒定。
我們設(shè)計的rhSCF/M-CSF雙功能蛋白基因是含有SCF的25個氨基酸的完整信號肽及1-165位氨基酸、15個氨基酸的連接肽和M-CSF的1-149位氨基酸編碼序列及終止密碼子的DNA片段。
ATG AAG AAG ACA CAA-61Met Lys Lys Thr Gln-21ACT TGG ATT CTC ACT TGC ATT TAT CTT CAG CTG CTC CTA TTT AAT CCT CTC GTC AAA ACT-1Thr Trp Ile Leu Thr Cys Ile Tyr Leu Gln Leu Leu Leu Phe Asn Pro Leu Val Lys Thr-1GAA GGG ATC TGC AGG AAT CGT GTG ACT AAT AAT GTA AAA GAC GTC ACT AAA TTG GTG GCA 60Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala 20AAT CTT CCA AAA GAC TAC ATG ATA ACC CTC AAA TAT GTC CCC GGG ATG GAT GTT TTG CCA 120Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro 40AGT CAT TGT TGG ATA AGC GAG ATG GTA GTA CAA TTG TCA GAC AGC TTG ACT GAT CTT CTG 180Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu 60
GAC AAG TTT TCA AAT ATT TCT GAA GGC TTG AGT AAT TAT TCC ATC ATA GAC AAA CTT GTG 240Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val 80AAT ATA GTG GAT GAC CTT GTG GAG TGC GTG AAA GAA AAC TCA TCT AAG GAT CTA AAA AAA 300Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys 100TCA TTC AAG AGC CCA GAA CCC AGG CTC TTT ACT CCT GAA GAA TTC TTT AGA ATT TTT AAT 360Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn 120AGA TCC ATT GAT GCC TTC AAG GAC TTT GTA GTG GCA TCT GAA ACT AGT GAT TGT GTG GTT 420Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val 140TCT TCA ACA TTA AGT CCT GAG AAA GAT TCC AGA GTC AGT GTC ACA AAA CCA TTT ATG TTA 480Ser Ser Thr Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu 160CCC CCT GTT GCA GCC 540Pro Pro Val Ala Ala 180GAG GAG GTG TCG GAG TAC TGT AGC CAC ATG ATT GGG AGT GGA CAC CTG CAG TCT CTG CAG 600Glu Glu VaL Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu Gln Ser Leu Gln 200CGG CTG ATT GAC AGT CAG ATG GAG ACC TCG TGC CAA ATT ACA TTT GAG TTT GTA GAC CAG 660Leu Arg Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln 220GAA CAG TTG AAA GAT CCA GTG TGC TAC CTT AAG AAG GCA TTT CTC CTG GTA CAA GAC ATA 720Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile 240ATG GAG GAC ACC ATG CGC TTC AGA GAT AAC ACC CCC AAT GCC ATC GCC ATC GTG CAG CTG 780Met Glu Asp Thr Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 260CAG GAA CTC TCT TTG AGG CTG AAG AGC TGC TTC ACC AAG GAT TAT GAA GAG CAT GAC AAG 840Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu Glu His Asp Lys 280GCC TGC GTC CGA ACT TTC TAT GAG ACA CCT CTC CAG TTG CTG GAG AAG GTC AAG AAT GTC 900Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val 300TTT AAT GAA ACA AAG AAT CTC CTT GAC AAG GAC TGG AAT ATT TTC AGC AAG AAC TGC AAC 960Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn 320AAC AGC TTT GCT GAA TGC TCC AGC CAA TAA TAGAsn Ser Phe Ala Glu Cys Ser Ser Gln1.1.SCF/M-CSF的構(gòu)建A.以pUC18-SCF為模板，用引物1，2經(jīng)PCR法合成5’端帶Xba I酶切位點(diǎn)，3’端缺失終止密碼子但帶柔性連接肽(GGGGS)編碼序列和BamH I位點(diǎn)的含有SCF25個氨基酸的完整信號肽及第1-165位氨基酸編碼序列，并將其克隆入pUC18質(zhì)粒載體(市售)中，得到pUC18-5’SCF質(zhì)粒引物15’GGTCTAGATGAAGAAGACACAAACT-3’引物25’CCGGATCCTCCTCCTCCGGCTGCAACAGGGGGTAA-3’B.以pUC18-M-CSF為模板，用引物3，4經(jīng)PCR法合成5’端帶BamH I酶切位點(diǎn)，柔性連接肽(GSGGGGSGGSIT)編碼序列及3’端帶有兩個連續(xù)終止密碼子和KpnI位點(diǎn)的含有M-CSF第1-149位氨基酸編碼序列，得到pUC18-3’M-CSF質(zhì)粒引物35’-GGGGATCCGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGCAGTATCACCGAGGAGGTGTCG-3’引物45’-GCGGTACCGGGCTATTATTGGCTGGAGCATTC-3’C.用Xba I和BamH I從pUC18-5’-SCF質(zhì)粒中切下SCF基因片段，插入pUC18-3’M-CSF質(zhì)粒的Xba I和BamH I之間，得到重組質(zhì)粒pUC18-SCF/M-CSF。在該重組質(zhì)粒中，SCF信號肽及N端1-165aa的編碼序列與M-CSF N端1-149aa編碼序列及兩個終止密碼子通過15個氨基酸(GGGGSGGGGSGGSIT)這段柔性連接肽連接在一起，從而獲得SCF/M-CSF雙功能蛋白基因，全長1068bp。
1.2.重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及重組病毒的純化A.用Xba I和KpnI從pUC18-SCF/M-CSF質(zhì)粒中切下帶信號肽的SCF/M-CSF雙功能蛋白基因片段，插入AcNPV轉(zhuǎn)移載體pVL1392(Invitrogen)的Xba I與KpnI位點(diǎn)之間，得到重組轉(zhuǎn)移載體pVL1392-SCF/M-CSF。
B.將重組轉(zhuǎn)移載體pVL1392-SCF/M-CSF與野生型苜蓿夜蛾核型多角體病毒DNA用脂質(zhì)體介導(dǎo)法共轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞Sf9，經(jīng)胞內(nèi)同源重組和4輪有限稀疏法篩選并結(jié)合TF-1細(xì)胞MTT法測活篩選出高效分泌表達(dá)SCF/M-CSF的重組病毒AcNPV-SCF/M-CSF。
2.將重組SCF/M-CSF病毒以合適的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染生長狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞，感染后在無血清培養(yǎng)基Sf900或不加血清的TMN-FH中培養(yǎng)，表達(dá)72小時后收集培養(yǎng)液經(jīng)M-CSF抗體柱親和層析分離純化得到SCF/M-CSF雙功能蛋白。
本發(fā)明構(gòu)建的rhSCF/M-CSF基因?yàn)閷⒁粋€SCF單體基因(25個氨基酸信號肽及1-165位氨基酸)和一個M-CSF單體基因(1-149位氨基酸)用柔性的15肽(GGGGSGGGGSGGSIT)編碼序列以頭尾連接方式連接而形成的新型人干細(xì)胞因子-巨噬細(xì)胞集落刺激因子雙功能蛋白基因。在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)物經(jīng)TF-1細(xì)胞MTT法(SCF活性)及人骨髓巨噬細(xì)胞集落形成(CFU-M，M-CSF活性)測活分析，結(jié)果顯示，在SCF活性檢測中rhSCF/M-CSF比E.coli中表達(dá)的單體rhSCF(純度＞98％)比活高5.3倍，而在促人骨髓巨噬細(xì)胞集落形成活性(M-CSF活性)檢測中rhSCF/M-CSF比家蠶中表達(dá)的純品rhM-CSF高出5倍。因此可以在臨床應(yīng)用時減少用量，降低其副作用。
構(gòu)建的重組病毒按本發(fā)明所述方法感染單層Sf9細(xì)胞，收集細(xì)胞上清液，上清液中累積的重組蛋白表達(dá)量約為1mg/L。
按本發(fā)明提供的分離純化方法可以從Sf9細(xì)胞培養(yǎng)液中獲得的SCF/M-CSF比活為1.0×106units/mg。非還原條件SDS-PAGE后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色檢測，rhSCF/M-CSF呈分子量約84KD的一條帶，而還原條件下SDS-PAGE后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色檢測，rhSCF/M-CSF呈分子量約42KD的一條帶。純度約為90％。
本發(fā)明所述人干細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞集落刺激因子雙功能蛋白可用于促進(jìn)病人放療、化療及骨髓移植后造血與免疫功能重建和恢復(fù)，并增強(qiáng)其抗真菌感染的能力，也可用于干細(xì)胞的體外擴(kuò)增研究。
四.


圖1rhSCF/M-CS基因的構(gòu)建流程2rhSCF/M-CSF基因的測序結(jié)果圖(5’端測序結(jié)果)圖3rhSCF/M-CSF基因的測序結(jié)果圖(3’端測序結(jié)果)圖4rhSCF/M-CSF與rhSCF單體的活性比較5rhSCF/M-CSF SDS-PAGE及Westen-blot圖譜五.具體實(shí)施方式
1.1.以pUC18-SCF為模板，用引物1，2經(jīng)PCR法合成SCF基因片段并將其克隆入pUC18質(zhì)粒載體，得到pUC18-5’SCF質(zhì)粒，以pUC18-M-CSF為模板，用引物3，4經(jīng)PCR法合成M-CSF基因片段，并將其克隆入pUC18質(zhì)粒載體得到pUC18-3’M-CSF質(zhì)粒，將SCF基因片段克隆到pUC18-3’M-CSF得pUC18-SCF/M-CSF。
1.2.將pUC18-SCF/M-CSF酶切得SCF/M-CSF基因片段，并插入AcNPV轉(zhuǎn)移載體的Xba I與KpnI位點(diǎn)之間，得到重組轉(zhuǎn)移載體pVL1392-M-CSF/SCF。將pVL1392-SCF/M-CSF與AcNPV DNA共轉(zhuǎn)染Sf9，經(jīng)篩選并結(jié)合TF-1細(xì)胞測活選出不含野生型病毒的重組病毒AcNPV-SCF/M-CSF。
2.取倍增時間為21小時，活細(xì)胞占90％，密度為1×106細(xì)胞/mLSf9細(xì)胞，按感染復(fù)數(shù)(MOI)＝10感染重組病毒1小時后，傾去病毒液，換成無血清的TMN-FH培養(yǎng)基。27℃培養(yǎng)72小時后，用TF-1細(xì)胞測培養(yǎng)液重組蛋白SCF/M-CSF，得到SCF/M-CSF表達(dá)上清液的活性為1000units/mL。低速離心收集的細(xì)胞凍融后細(xì)胞抽提液中未分泌的重組蛋白活性僅為50units/6×106cells，說明重組蛋白分泌完全。表達(dá)量約為1mg/L。將40mL細(xì)胞培養(yǎng)上清液對1×PBS(pH7.4)透析12小時，以1mL/min流速上樣至0.5mL的M-CSF單抗抗體柱親和層析柱，層析柱預(yù)先用1×PBS平衡。上樣后，先用1×PBS洗至基線，再用含0.8％Triton X-100的1×PBS洗滌，再次用1×PBS洗至基線后，用洗脫液(pH 8.0，50mM Tris-Cl，0.5Mol/L NaCl)以2mL/min的流速洗脫，收集洗脫峰15mL。洗脫液對蒸餾水透析并凍干，得到SCF/M-CSF雙功能蛋白精品。測定蛋白含量和活性。結(jié)果顯示，在SCF活性檢測中rhSCF/M-CSF比活為1.0×106units/mg，比E.coli中表達(dá)的單體rhSCF(純度＞98％)比活高6；在促人骨髓巨噬細(xì)胞集落形成活性(M-CSF活性)檢測中rhSCF/M-CSF比活為7×106CFU/mg，比家蠶中表達(dá)的rhM-CSF純品高出5倍。非還原條件下SDS-PAGE后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色檢測，rhSCF/M-CSF呈分子量約84KD的一條帶，而還原條件下SDS-PAGE后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色檢測，rhSCF/M-CSF呈分子量約42KD的一條帶。純度約為90％。免疫印跡(Westernblot)分析結(jié)果與其一致(見附圖5)。
人干細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞集落刺激因子雙功能蛋白基因序列表.txt人干細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞集落刺激因子雙功能蛋白基因序列表<110>南京大學(xué)<120>人干細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞集落刺激因子雙功能蛋白及制備<210>1<211>1068<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1atgaagaaga cacaaacttg gattctcact tgcatttatc ttcagctgct cctatttaat 60cctctcgtca aaactgaagg gatctgcagg aatcgtgtga ctaataatgt aaaagacgtc 120actaaattgg tggcaaatct tccaaaagac tacatgataa ccctcaaata tgtccccggg 180atggatgttt tgccaagtca ttgttggata agcgagatgg tagtacaatt gtcagacagc 240ttgactgatc ttctggacaa gttttcaaat atttctgaag gcttgagtaa ttattccatc 300atagacaaac ttgtgaatat agtggatgac cttgtggagt gcgtgaaaga aaactcatct 360aaggatctaa aaaaatcatt caagagccca gaacccaggc tctttactcc tgaagaattc 420tttagaattt ttaatagatc cattgatgcc ttcaaggact ttgtagtggc atctgaaact 480agtgattgtg tggtttcttc aacattaagt cctgagaaag attccagagt cagtgtcaca 540aaaccattta tgttaccccc tgttgcagcc ggaggaggag gatccggagg aggaggctcc 600ggcggcagta tcaccgagga ggtgtcggag tactgtagcc acatgattgg gagtggacac 660ctgcagtctc tgcagcggct gattgacagt cagatggaga cctcgtgcca aattacattt 720gagtttgtag accaggaaca gttgaaagat ccagtgtgct accttaagaa ggcatttctc 780ctggtacaag acataatgga ggacaccatg cgcttcagag ataacacccc caatgccatc 840gccatcgtgc agctgcagga actctctttg aggctgaaga gctgcttcac caaggattat 900gaagagcatg acaaggcctg cgtccgaact ttctatgaga cacctctcca gttgctggag 960aaggtcaaga atgtctttaa tgaaacaaag aatctccttg acaaggactg gaatattttc 1020agcaagaact gcaacaacag ctttgctgaa tgctccagcc aataatag人干細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞集落刺激因子雙功能蛋白基因DNA序列Met Lys Lys Thr Gln Thr Trp Ile Leu Thr Cys Ile Tyr Leu Gln Leu Leu Leu Phe Asn5 10 15 20Pro Leu Val Lys Thr Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val25 30 35 40Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly45 50 55 60Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser65 70 75 80Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile85 90 95 100Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser105 110 115 120Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe125 130 135 140Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr145 150 155 160Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr165 170 175 180Lys Pro Phe Met Leu Pro Pro Val Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser185 190 195 200Gly Gly Ser Ile Thr Glu Glu VaL Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His205 210 215 220Leu Gln Ser Leu Gln Leu Arg Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln Ile Thr Phe225 230 235 240Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu245 250 255 260Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile265 270 275 280Ala Ile Val Gln Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr285 290 295 300Glu Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln Leu Leu Glu305 310 315 320Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe325 330 335 340Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala Glu Cys Ser Ser Gln345 350人干細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞集落刺激因子雙功能蛋白氨基酸序列
權(quán)利要求
1.一種干細(xì)胞因子-巨噬細(xì)胞集落刺激因子雙功能蛋白基因(rhSCF/M-CSF)，其特征是設(shè)計并構(gòu)建含有SCF的25個氨基酸的完整信號肽及1-165位氨基酸、15個氨基酸GGGGSGGGGSGGSIT的連接肽和M-CSF的1-149位氨基酸編碼序列及終止密碼的DNA片段。重組rhSCF/M-CSF雙功能蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列為ATG AAG AAG ACA CAA-61Met Lys Lys Thr Gln-21ACT TGG ATT CTC ACT TGC ATT TAT CTT CAG CTG CTC CTA TTT AAT CCT CTC GTC AAA ACT-1Thr Trp Ile Leu Thr Cys Ile Tyr Leu Gln Leu Leu Leu Phe Asn Pro Leu Val Lys Thr-1GAA GGG ATC TGC AGG AAT CGT GTG ACT AAT AAT GTA AAA GAC GTC ACT AAA TTG GTG GCA 60Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala 20AAT CTT CCA AAA GAC TAC ATG ATA ACC CTC AAA TAT GTC CCC GGG ATG GAT GTT TTG CCA 120Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro 40AGT CAT TGT TGG ATA AGC GAG ATG GTA GTA CAA TTG TCA GAC AGC TTG ACT GAT CTT CTG 180Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu 60GAC AAG TTT TCA AAT ATT TCT GAA GGC TTG AGT AAT TAT TCC ATC ATA GAC AAA CTT GTG 240Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val 80AAT ATA GTG GAT GAC CTT GTG GAG TGC GTG AAA GAA AAC TCA TCT AAG GAT CTA AAA AAA 300Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys 100TCA TTC AAG AGC CCA GAA CCC AGG CTC TTT ACT CCT GAA GAA TTC TTT AGA ATT TTT AAT 360Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn 120AGA TCC ATT GAT GCC TTC AAG GAC TTT GTA GTG GCA TCT GAA ACT AGT GAT TGT GTG GTT 420Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val 140TCT TCA ACA TTA AGT CCT GAG AAA GAT TCC AGA GTC AGT GTC ACA AAA CCA TTT ATG TTA 480Ser Ser Thr Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu 160CCC CCT GTT GCA GCC 540Pro Pro Val Ala Ala 180GAG GAG GTG TCG GAG TAC TGT AGC CAC ATG ATT GGG AGT GGA CAC CTG CAG TCT CTG CAG 600Glu Glu VaL Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu Gln Ser Leu Gln 200CGG CTG ATT GAC AGT CAG ATG GAG ACC TCG TGC CAA ATT ACA TTT GAG TTT GTA GAC CAG 660Leu Arg Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln 220GAA CAG TTG AAA GAT CCA GTG TGC TAC CTT AAG AAG GCA TTT CTC CTG GTA CAA GAC ATA 720Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile 240ATG GAG GAC ACC ATG CGC TTC AGA GAT AAC ACC CCC AAT GCC ATC GCC ATC GTG CAG CTG 780Met Glu Asp Thr Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu 260CAG GAA CTC TCT TTG AGG CTG AAG AGC TGC TTC ACC AAG GAT TAT GAA GAG CAT GAC AAG 840Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu Glu His Asp Lys 280GCC TGC GTC CGA ACT TTC TAT GAG ACA CCT CTC CAG TTG CTG GAG AAG GTC AAG AAT GTC 900Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val 300TTT AAT GAA ACA AAG AAT CTC CTT GAC AAG GAC TGG AAT ATT TTC AGC AAG AAC TGC AAC 960Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn 320AAC AGC TTT GCT GAA TGC TCC AGC CAA TAA TAGAsn Ser Phe Ala Glu Cys Ser Ser Gln
2.根據(jù)權(quán)利要求1所提供的基因構(gòu)建了一種能在昆蟲Sf9中高效分泌表達(dá)的重組苜蓿夜蛾核型多角體病毒(AcNPV-rhSCF/M-CSF)。其特征是將rhSCF/M-CSF基因克隆于桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1392的BamHI和SmaI位點(diǎn)之間，得到重組轉(zhuǎn)移載體pVL1392rhSCF/M-CSF，整個融合基因處于AcNPV的多角體蛋白啟動子控制之下。將重組pVL1392 rhSCF/M-CSF載體DNA與野生型AcNPV DNA共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，經(jīng)4輪有限稀釋法純化并結(jié)合重組蛋白的體外活性測定，篩選出重組病毒AcNPV-rhSCF/M-CSF。
3.一種干細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞集落刺激因子雙功能蛋白(rhSCF/M-CSF)的制備方法。其特征是用權(quán)利要求1所構(gòu)建的重組病毒感染貼壁的Sf9細(xì)胞，27℃在無血清培養(yǎng)基中表達(dá)72小時，收集細(xì)胞表達(dá)液。經(jīng)M-CSF單抗抗體柱親和層析分離純化可獲得純度約90％的SCF/M-CSF雙功能蛋白精品。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中的基因工程制備多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域。其目的是構(gòu)建一種人干細(xì)胞因子－巨噬細(xì)胞集落刺激因子雙功能蛋白基因，并在昆蟲細(xì)胞中高效分泌表達(dá)和制備生物活性更高副作用更小的重組干細(xì)胞因子－巨噬細(xì)胞集落刺激因子雙功能蛋白(rhSCF/M－CSF)。rhSCF/M－CSF基因?yàn)橐来魏蠸CF完整的信號肽及1－165位氨基酸、15個氨基酸的連接肽和M－CSF的1－149位氨基酸編碼序列及終止密碼子的DNA片段。它可用于促進(jìn)病人放療、化療及骨髓移植后造血與免疫功能重建和恢復(fù)，并增強(qiáng)其抗真菌感染的能力，也可用于干細(xì)胞的體外擴(kuò)增研究。
文檔編號C12N15/33GK1556114SQ20041001384
公開日2004年12月22日 申請日期2004年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月8日
發(fā)明者秦浚川, 陳濤, 朱潔, 臧宇輝 申請人:南京大學(xué)