專利名稱：豬背膘厚相關(guān)基因mac30的克隆及其在標(biāo)記輔助選擇上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于家畜基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及豬背膘厚相關(guān)基因MAC30的克隆及其在標(biāo)記輔助選擇上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中國(guó)是個(gè)養(yǎng)豬大國(guó)，也是豬種資源最豐富的國(guó)家，很早就開始將野豬馴化為家豬。經(jīng)過長(zhǎng)期選擇，形成了許多各具特色的地方品種，僅《中國(guó)豬品種志》(張仲葛，上海科技出版社，1986)記載的就有48個(gè)。與國(guó)外的商品豬相比，中國(guó)地方品種具有許多突出的優(yōu)點(diǎn)肉質(zhì)好，產(chǎn)仔數(shù)高、抗逆性好和適應(yīng)性強(qiáng)等等，但卻有著兩個(gè)共同的缺點(diǎn)，那就是瘦肉率低和增重慢。因此，增加胴體瘦肉率和提高生長(zhǎng)速度一直是我國(guó)家豬的遺傳改良工作的主要目標(biāo)。
胴體性狀主要包括以下兩個(gè)方面一方面是胴體各組分的度量值，如背膘厚度、眼肌面積、胴體長(zhǎng)、小腸長(zhǎng)度以及各種內(nèi)臟重等；另一方面是各組成的重量百分比，如屠宰率、腿臀比率、腿臀肉骨率、板油率和內(nèi)脂率等。
許多胴體性狀屬于數(shù)量性狀，由多基因控制、并存在主基因(major gene)效應(yīng)。由于胴體性狀表現(xiàn)晚且不便活體測(cè)量，采用常規(guī)育種方法對(duì)其進(jìn)行選擇周期長(zhǎng)，收效慢。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使人們可以在DNA水平尋找控制胴體性狀的主基因或與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，在育種過程中用于標(biāo)記輔助選擇(marker assisted selection，MAS)，以便提高選擇進(jìn)展，更好地改善胴體品質(zhì)，滿足人們的需要，同時(shí)獲得較大的經(jīng)濟(jì)效益。
通過候選基因法，已經(jīng)找到了一些影響豬的胴體品質(zhì)的基因。位于豬12號(hào)染色體上的生長(zhǎng)激素基因(Growth Hormon，GH)是神經(jīng)分泌內(nèi)生長(zhǎng)軸中調(diào)控動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的核心基因，其產(chǎn)物生長(zhǎng)激索具有調(diào)節(jié)新陳代謝、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育等作用，是與豬的生長(zhǎng)和胴體性狀相關(guān)的主要候選基因，中外學(xué)者對(duì)它的基因型與生產(chǎn)性狀的關(guān)系進(jìn)行了廣泛的研究。Knorr等(Knorr C等，Associations of GHgene variants with performance traits in F2 generations of European wild boar，Pietrain and Meishan pigs.Anim Genet，1997，28124-128)發(fā)現(xiàn)梅山豬與皮特蘭豬雜交的F2代群體中，不同的GH基因型與8個(gè)胴體性狀顯著相關(guān)。李加琪等(李加琪等，IFG-1基因?qū)﹂L(zhǎng)白×藍(lán)塘豬資源群生產(chǎn)性能的遺傳效應(yīng)分析，遺傳學(xué)報(bào)，2003，30(9)835-839)發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)白×藍(lán)塘豬構(gòu)建的資源群體中類胰島素生長(zhǎng)因子1(Insulin-like growth factor I，IGF-I)不同基因型對(duì)斷奶后日增重、骨率、胴體瘦肉量和皮脂率等性狀有顯著影響。劉桂蘭等(劉桂蘭等，IGF2基因PCR-RFLP多態(tài)性與脂肪沉積相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)分析，遺傳學(xué)報(bào)，2003，30(12)1107-1112)分析了類胰島素生長(zhǎng)因子2(Insulin-like growth factor II，IGF-II)基因第8內(nèi)含子兩個(gè)NciI酶切位點(diǎn)的多態(tài)性在大白豬×梅山豬構(gòu)成的F2代中的多態(tài)性分布情況，發(fā)現(xiàn)B位點(diǎn)B1B1基因型的個(gè)體顯著比B2B2基因型的個(gè)體背膘薄18.28％(P＜0.01)，瘦肉率高8.71％(P＜0.01)。垂體轉(zhuǎn)錄因子(Pituitan transcription factor 1，PIT1)是生長(zhǎng)激素、催乳素和促甲狀腺素重要的調(diào)節(jié)因子，Yu等(Yu TP等，Association of PIT1 polymorphisms with growth and carcass traits inpigs.J Anim Sci，1995，731282-1288)曾報(bào)道PIT1與平均背膘厚存在顯著相關(guān)，近年來Kuryland等(Kuryl J等，Association of POU1F1/RsaI genotypes with carcass traits in pigs.J Appl Genet，2001，42309-316)和Brunsch等(Brunsch C等，Analysis of associations of PIT1 genotypes with growth，meatquality and carcass composition traits in pigs.J Appl Genet，2002，4385-91)分別在不同的資源家系中檢測(cè)到PITI與數(shù)種胴體性狀相關(guān)。其它與胴體性狀相關(guān)的候選基因還包括生長(zhǎng)激素釋放素(GHRH)、瘦素(Leptin)、生長(zhǎng)素(Ghrelin)、肌細(xì)胞生成素(Myogenin)、生長(zhǎng)激素抑制素(somatostatin，SS)、黑素皮質(zhì)激素受體4(Melanocortin-4，MC4R)和生長(zhǎng)素受體(growth hormone receptor，GHR)(XiaD等，Developmental patterns of GHr and SS mRNA expression in porcine gastric tissue.World JGastroenterol，2003，91058-1062)、MSTN(Jiang YL等，Identification of three SNPs in the porcinemyostatin gene(MSTN).Anim Biotechnol，2002，13173-178)等基因。位于18號(hào)染色體上的瘦素基因(Leptin)被認(rèn)為是與生長(zhǎng)、胴體性狀相關(guān)的一個(gè)基因(Sasaki S等，Assignment of the porcine obese(leptin)gene to chromosome 18 by linkage analysis of a new PCR-based polymorphism.Mamm Genome，1996，7471-472)，但Jiang等(Jiang ZH等Genetic polymorphisms in the leptin gene and their associationwith fatness in four pig breeds.Mamm Genome，1999，10191-193)的研究卻沒有發(fā)現(xiàn)明顯的關(guān)聯(lián)。位于豬9號(hào)染色體上的肌細(xì)胞生成素(Myogenin)是MyoD基因家族的成員，主要功能是調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞分化為肌纖維。Te Pas等(te Pas MF等，Influences of myogenin genotypes on birth weight，growth rate，carcass weight，backfat thickness，and lean weight of pigs.J Anim Sci，1999，772352-2356)在兩個(gè)大白豬群中檢測(cè)了該基因的多態(tài)性，分析發(fā)現(xiàn)不同基因型的個(gè)體在出生重、生長(zhǎng)速度和瘦肉量等性狀上有顯著差異。對(duì)兩個(gè)選擇系肌肉的MyoD基因家族成員mRNA表達(dá)水平比較發(fā)現(xiàn)F-系(選擇生長(zhǎng)速度)中myogenin、myf-5、MyoDl的mRNA表達(dá)水平比L-系(選擇瘦肉率)高，在F-系中，背膘厚與成肌細(xì)胞的表達(dá)成負(fù)相關(guān)(te Pas MF等，Messenger ribonucleic acid expression of the MyoDgene family in muscle tissue at slaughter in relation to selection for porcine growth rate.J Anim Sci，2000，7869-77)。Kim等(Kim KS等，A missense variant of the porcine melanocortin-4receptor(MC4R)geneis associated with fatness，growth，and feed intake traits.Mamm Genome，2000，11131-135)在5個(gè)豬商品系中檢測(cè)到MC4R基因遺傳變異與背膘厚顯著相關(guān)。劉桂蘭等(劉桂蘭等，豬資源家系MC4R基因掃描及其與脂肪性狀的相關(guān)分析，遺傳學(xué)報(bào)，2002，29(6)497-501)對(duì)大白×梅山的F2代174個(gè)體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MC4R基因多態(tài)性與豬胸腰椎間膘厚(P＜0.05)、臀部膘厚(P＜0.02)、平均背膘厚(P＜0.04)、眼肌寬度(P＜0.003)、眼肌面積(P＜0.05)、皮率(P＜0.02)呈顯著相關(guān)。
采用基因組掃描法，研究者們還定位了一些影響胴體性狀的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)。影響背膘厚的主基因被定位于第2和7號(hào)染色體上(de Koning等，Detection of quantitative trait loci for backfatthickness and intramuscular fat content in pigs(Sus scrofa).Genetics，1999，1521679-1690)。Paszek等(Paszek AA等，Interval mapping of carcass and meat quality traits in a divergent swine cross.AnimBiotechnol，2001，12155-165)利用119個(gè)分子標(biāo)記對(duì)116個(gè)F2個(gè)體的胴體和肉質(zhì)性狀進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)在豬12號(hào)染色體上存在影響胴體長(zhǎng)、第10肋骨背膘厚、平均背膘厚、板油率、眼肌面積和肌內(nèi)脂肪含量等多個(gè)性狀的QTL。最近，Clop等(Clop A，等，Detection of QTL affecting fatty acidcomposition in the pig.Mamm Genome，2003，14650-656)對(duì)伊比利亞豬與長(zhǎng)白豬構(gòu)建的F2進(jìn)行基因組掃描，發(fā)現(xiàn)12號(hào)染色體上存在影響不飽和脂肪酸(亞麻酸)含量的QTL。Yue等(Yue G等，Linkageand QTL mapping for Sus scrofa chromosome 12.Journal of Animal Breeding and Genetics，2003，12095-102)以野豬、梅山豬和皮特蘭構(gòu)成的三個(gè)F2群體為研究對(duì)象，在12號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)影響13-14肋骨間的背膘厚、瘦肉切割率等性狀的QTL。據(jù)統(tǒng)計(jì)，除了SSC16和SSC17外，豬的所有染色體上均發(fā)現(xiàn)了影響背膘厚的QTL(Bidanel and Rothschild，2002)。
申請(qǐng)人長(zhǎng)期以來致力于豬12號(hào)染色體上重要功能基因的分離鑒定工作，并取得了一定的成果(Yu M等，Isolation，physical mapping and polymorphism of the porcine ferredoxin reductase(FDXR)gene.Anim Genet，2002，33394-395；Yu M等，Physical mapping of the rod cGMP-phosphodiesterase-subunit(PDE6G)gene to pig chromosome 12.Anim Genet，2003，3476-77)。
MAC30(meningioma associate protein 30，MAC30)基因是首先在腦膜瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的過度表達(dá)的基因之一，它是類胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白家族成員之一，參與對(duì)類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)的調(diào)節(jié)(Murphy M等，Identification and characterization of genes differentially expressed in meningiomas.Cell Growth Differ，1993，4715-722)。人和小鼠的基因組研究結(jié)果將MAC30基因分別定位于人的17(17q11)號(hào)染色體和鼠的11號(hào)染色體。申請(qǐng)人擴(kuò)增豬的MAC30的基因組DNA片段，并利用RH克隆板將它定位在豬的12號(hào)染色體上(12q13，未發(fā)表)，符合比較基因組學(xué)研究的結(jié)果(Goureau A等，Human and porcine correspondence of chromosome segments using bidirectional chromosomepainting.Genomics，1996，36252-262)。Malhotra等(Malhotra K等，Identification of differentiallyexpressed mRNAs in human fetal liver across gestation.Nucleic Acids Res，1999，27839-847)通過差異顯示技術(shù)(DDRT-PCR)發(fā)現(xiàn)MAC30基因在胚胎肝細(xì)胞和成體的肝細(xì)胞中有不同的表達(dá)模式，暗示它可能在機(jī)體的生長(zhǎng)和分化過程中起重要作用。但是到目前為止，仍沒見到全面研究MAC30基因功能的報(bào)導(dǎo)。研究突變位點(diǎn)在群體中的多態(tài)性，并進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析是研究基因功能的一個(gè)非常有力的手段。所以申請(qǐng)人對(duì)這個(gè)基因的部分的外顯子進(jìn)行了多態(tài)研究和關(guān)聯(lián)分析，以期能夠發(fā)現(xiàn)它的功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克隆豬MAC30基因的部分基因組DNA序列，尋找基因突變位點(diǎn)以及多態(tài)性的檢測(cè)方法，篩選豬背膘厚性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，作為豬遺傳育種的輔助選擇的應(yīng)用。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種豬背膘厚相關(guān)基因MAC30，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
PCR擴(kuò)增的MAC30基因組序列全長(zhǎng)為970bp，其中包含如附圖2所述的部分外顯子2和部分的外顯子3序列。
在序列表SEQ ID NO1的第848bp處有一個(gè)堿基突變(848G-848A)，導(dǎo)致其編碼的氨基酸由纈氨酸(GTC-ATC)變成異亮氨酸。
克隆以上所述的MAC30基因所用的引物的DNA序列如下所示5′-ATACCCAGGAGTTCAAAGACACT-3′(正向)，’5′-GAGAGGGATGAGAAAGTAGGGGA-3′(反向)，
檢測(cè)848G-848A堿基處突變的正、反同引物的DNA序列如下所示5’-GGGAGGAGTCTCTGTGTCGTGTGT-3’(正向引物)5′-GAGAGGGATGAGAAAGTAGGGGA-3′(反向引物)用于PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的引物的DNA序列如下所示5′-TAGTCGTTCGTGGAAAGTCGTAGGTC-3′(反向引物)一種篩選適用于豬背膘厚性狀的分子標(biāo)記的方法，按照以下步驟制備用人MAC30基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性90％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)；然后對(duì)EST進(jìn)行拼接；根據(jù)與人MAC30基因的基因組全長(zhǎng)DNA序列的比對(duì)結(jié)果大致得出外顯子的拼接位點(diǎn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物；從豬血液基因組提取DNA，PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化和克隆測(cè)序，獲得如序列表SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法檢測(cè)豬MAC30基因848G-848A位點(diǎn)的多態(tài)性，并進(jìn)行其基因型與豬的部分生產(chǎn)性狀之間的關(guān)聯(lián)分析。本發(fā)明為豬的分子育種提供了一個(gè)新的遺傳標(biāo)記。
依照本發(fā)明，豬背膘厚相關(guān)基因MAC30可以用于豬標(biāo)記輔助選擇中。
本發(fā)明的詳細(xì)技術(shù)細(xì)節(jié)如下所述1.MAC30基因部分DNA序列的克隆(1)引物設(shè)計(jì)用人MAC30基因cDNA(GenBank收錄號(hào)XM 031536)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫(kù)中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為90％以上的ESTs(片段長(zhǎng)度大于100bp)，將這些ESTs的收錄號(hào)在NCBI中用ENTREZ(文獻(xiàn)見http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查詢相應(yīng)序列，然后用序列分析軟件DNAStar中的SeqMan程序構(gòu)建豬EST-重疊群。根據(jù)EST拼接序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。序列如下5′-ATACCCAGGAGTTCAAAGACACT-3′(正向)，5′-GAGAGGGATGAGAAAGTAGGGGA-3′(反向)(2)PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測(cè)序PCR產(chǎn)物的純化在紫外燈下從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mlEpendorff管中，于70℃溫育至凝膠完全融化，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Promega)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟是在每300μl融化的凝膠中加入1ml Resin試劑，混勻20s，將Resin/DNA混合物裝入注射器，使?jié){液通過試劑盒中的Minicolumn擠出。再在注射器中加入80％的異丙醇2ml，輕推活塞使異丙醇通過Minicolumn擠出，取下Minicolumn裝入1.5ml Ependorff管中，10,000g離心2min以干燥Resin，將Minicolumn裝入另一個(gè)干凈的1.5ml Ependorff管中，加入30～50μl滅菌水，靜置1min，10,000g離心20s，以洗脫DNA存于Ependorff管中。
連接反應(yīng)將純化RACE產(chǎn)物與pGEM-T easy載體(購(gòu)自promega公司)連接，連接反應(yīng)總體積是5μl，其中包括2.5μl 2×buffer，0.5μl的T載體，1.5μl的純化PCR產(chǎn)物，0.5μl的T4連接酶，置16℃水浴過夜。
感受態(tài)細(xì)胞的制備從37℃培養(yǎng)了16～20h的新鮮平板上挑取一個(gè)DH5α單菌落接種于2ml LB中，于37℃振蕩培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)接1ml菌液于含有30ml LB的鹽水瓶中，繼續(xù)在37℃振蕩培養(yǎng)約4h，待OD600達(dá)到0.3～0.4時(shí)將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻10～15min，然后將菌液轉(zhuǎn)入離心管中于4℃4,000g離心10min以收集細(xì)胞，將離心管倒置以棄凈培養(yǎng)液，用10ml冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，冰浴30min，重復(fù)4℃4,000g離心10min一次，用4ml冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 轉(zhuǎn)化無菌狀態(tài)下取100～120μl感受態(tài)細(xì)胞于1.5ml Ependorff管中，將5μl的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min，42℃熱激90s，其間不要搖動(dòng)Ependorff管，取出后冰浴3～4min，加入400μl無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的瓊脂平板上，37℃平放1h后倒置培養(yǎng)。
質(zhì)粒的小量制備挑取平板上的單菌落，接種于2-3ml LB中，37℃300r/min培養(yǎng)過夜。用1.5mlEP管12000r/min離心數(shù)秒收集菌體。每管加入100μl用冰預(yù)冷的溶液I[50mM葡萄糖，25mM Tris.Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)]，渦旋振蕩至菌體充分懸浮。加入新配制的溶液II
200μl，快速顛倒混勻，冰浴5min，然后加入預(yù)冷的溶液III[5M乙酸鉀，冰乙酸11.5ml，H2O28.5ml]150μl，混勻后冰浴5min，12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)至另-EP管中，加入苯酚氯仿異戊醇500μl，渦旋振蕩，離心后小心吸取上層水相，加入2倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min離心5min，沉淀用70％乙醇洗滌2次，抽干，加入含有RNA酶的TE 20μl。
重組質(zhì)粒的酶切鑒定取3μl質(zhì)粒DNA與適量的雙蒸水混勻，使其總體積為10μl，加入5U限制性內(nèi)酶EcoRI及1μl相應(yīng)的10×限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，輕彈管壁混勻并離心，置37℃水浴1-2小時(shí)，取2-3μl反應(yīng)液于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，酶切結(jié)果與預(yù)計(jì)完全相同者，即為目的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒采用雙脫氧末端終止法在DNA自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序，序列測(cè)定由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。
(3)DNA序列同源性檢索鑒定通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http//www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)軟件，將測(cè)序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的已知生理功能基因進(jìn)行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。
2、標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析利用申請(qǐng)人與中國(guó)湖北省通城縣畜牧局種畜場(chǎng)合作組建的試驗(yàn)群體(含55個(gè)純繁通城豬、26個(gè)長(zhǎng)白♂×(大白×通城)♀和21個(gè)大白♂×(長(zhǎng)白×通城)♀三元雜交組合豬)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析.102個(gè)DNA樣品用于基因型檢測(cè)。
所分析的性狀有部分生長(zhǎng)性狀，部分胴體性狀和部分肉質(zhì)性狀。申請(qǐng)人建立了如下最小二乘模型yij＝μ+GENOTYPEi+SEXj+εij，其中，yij是性狀觀察值，μ為總體均數(shù)，GENOTYPEi為基因型效應(yīng)，SEXj為性別效應(yīng)，εij為隨機(jī)誤差，假定服從N(0，Iσ2)分布。
本發(fā)明的效果1、豬MAC30基因部分DNA序列的克隆PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示均為特異的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物回收純化后克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為970bp。其中包括部分外顯子2和部分的外顯子3的序列(如圖2、SEQ ID NO1所示)。所涉及的完整的內(nèi)含子2序列符合GT-AG規(guī)則。
測(cè)序結(jié)果表明在該片段的848bp處存在A、G兩個(gè)等位基因分別編碼異亮氨酸(Ile)和纈氨酸(Val)，測(cè)序峰圖見圖4。
2、標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析對(duì)豬MAC30基因848bp處(SEQ ID NO1)多態(tài)性與部分生產(chǎn)性狀之間的進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。測(cè)試群體由三個(gè)組合構(gòu)成，含55個(gè)純繁通城豬、26個(gè)長(zhǎng)白♂×(大白×通城)♀和21個(gè)大白♂×(長(zhǎng)白×通城)♀三元雜交組合豬，總共102個(gè)個(gè)體。對(duì)豬MAC30基因測(cè)序結(jié)果表明，在所有檢測(cè)的群體中GG基因型的個(gè)體有87個(gè)，AG基因型有15個(gè)個(gè)體，無AA基因型個(gè)體。由于A等位基因僅在通城豬群體中出現(xiàn)，在進(jìn)行與部分性狀關(guān)聯(lián)分析時(shí)，僅對(duì)55個(gè)通城豬進(jìn)行分析，其中GG基因型有40個(gè)體，AG基因型有15個(gè)個(gè)體。不同基因型之間性狀的性狀顯著差異的結(jié)果(最小二乘均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤分析)總結(jié)于表1，其它性狀在不同的基因型之間沒有顯著的差異。
由表可知，GG基因型的平均背膘厚、6-7肋骨處背膘厚度均極顯著地低于AG基因型的豬(P＜0.01)。根據(jù)結(jié)果申請(qǐng)人分析A等位基因可能是影響背膘厚的增效基因，大白、長(zhǎng)白等商品豬由于受到強(qiáng)的選擇壓力的影響，導(dǎo)致A等位基因丟失，僅存在G等位基因，而通城豬受到的選擇壓力相對(duì)較小，還存在少量A等位基因，長(zhǎng)白♂×(大白×通城)♀和大白♂×(長(zhǎng)白×通城)♀三元雜交組合豬的A等位基因也極少(未檢測(cè)到)。還可能是該基因與某個(gè)控制背膘厚的基因緊密連鎖。
表1豬Mac30基因848位點(diǎn)不同基因型與背膘厚性狀的關(guān)聯(lián)分析

序列表

序列表SEQ ID NO1是本發(fā)明克隆的豬背膘厚性狀相關(guān)基因MAC30的DNA序列；圖1是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
圖2是豬MAC30基因部分DNA序列。大寫字母分別為外顯子2，3。小寫字母為內(nèi)含子2。5’-和3’-拼接位點(diǎn)的兩個(gè)保守核苷酸(GT/AG)用黑體標(biāo)出，起始密碼子ATG以黑體字標(biāo)出，848bp處A/G多態(tài)位點(diǎn)以圓括號(hào)()標(biāo)出表示。引物的位置用方框顯示。
圖3是用于PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。
瓊脂糖膠濃度為2％。1-5泳道為PCR產(chǎn)物，長(zhǎng)度為766bp；M泳道DNA分子量標(biāo)記(100-1000bp ladder)圖4PCR產(chǎn)物測(cè)序的彩峰圖，箭頭所指的是多態(tài)位點(diǎn)。
圖5是本發(fā)明克隆的豬背膘厚性狀相關(guān)基因MAC30的部分DNA序列所推導(dǎo)出的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1豬標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析在一個(gè)通城豬群中對(duì)MAC30基因第3外顯子A848G多態(tài)性位點(diǎn)與部分生產(chǎn)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，所分析的性狀是部分胴體性狀和部分肉質(zhì)性狀。
基因型檢測(cè)結(jié)果表明在55個(gè)個(gè)體中占絕大多數(shù)的是GG基因型，有40個(gè)，AG基因型有15個(gè)個(gè)體。不同基因型之間性狀的性狀顯著差異的結(jié)果(最小二乘均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤分析)總結(jié)于表2，分析結(jié)果表明，GG基因型的平均背膘厚、6-7肋骨處背膘厚度均極顯著地低于AG基因型的豬(P＜0.01)，其它性狀在不同的基因型之間沒有顯著的差異。
表2豬Mac30基因848位點(diǎn)不同基因型與背膘厚性狀的關(guān)聯(lián)分析

**表示在0.01水平上差異極顯著。
實(shí)施例2豬MAC30基因848位點(diǎn)多態(tài)在各豬品種中的分布情況在6個(gè)豬品種中檢測(cè)豬MAC30基因第848位點(diǎn)的多態(tài)性，檢測(cè)結(jié)果如表3所述，表3的數(shù)據(jù)分析顯述，在所檢測(cè)的這幾個(gè)豬品種中，均是等位基因G的頻率占優(yōu)勢(shì)，而在國(guó)外商品豬種長(zhǎng)白和杜洛克中，沒有檢測(cè)到A等位基因存在。

對(duì)豬MAC30基因848位點(diǎn)多態(tài)性基因頻率在不同品種中的分布差異進(jìn)行檢驗(yàn)，差異顯著性結(jié)果表明該位點(diǎn)基因頻率在所檢測(cè)的這六個(gè)豬品種中存在較大程度的差異。
序列表<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>豬背膘厚相關(guān)基因MAC30的克隆及其在標(biāo)記輔助選擇上的應(yīng)用<130>
<141>2004-06-07<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>970<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
<221>gene<222>(1)..(970)<223>
<220>
<221>primer_bind<222>(948)..(970)<223>
<220>
<221>primer_bind
<222>(903)..(928)<223>
<220>
<221>primer_bind<222>(204)..(228)<223>
<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(23)<223>
<220>
<221>mutation<222>(848)..(848)<223>
<220>
<221>Intron<222>(124)..(776)<223>
<220>
<221>exon<222>(777)..(970)<223>
<220>
<221>exon<222>(1)..(123)<223>
<400>1ata ccc agg agt tca aag aca ctc tgc tcc aga gcc ccc cag cgt ggt 48Ile Pro Arg Ser Ser Lys Thr Leu Cys Ser Arg Ala Pro Gln Arg Gly1 5 10 15tta agg cct tcc tgt ttt gcg agc ttg tgt ttc agc tgc ctt tct ttc 96Leu Arg Pro Ser Cys Phe Ala Ser Leu Cys Phe Ser Cys Leu Ser Phe
20 25 30cct ttg caa cat atg cct ttt tca aag gttggtaaat ggtggggaaa143Pro Leu Gln His Met Pro Phe Ser Lys35 40tcccattttt gctctgaaac caggtcccag ggatcttttg ggaaagtttc accaacagag203agggaggagt ctctgtgtcg tgtgtgaggc gatacaggac ctggtgggcc gggctgggag263agatcttgcc aggaaacatt gatgtggccg agcctggtgt ctgtggtcgg ctggacgtcc323ctcgtacaca agaaatctga ggctgcttta aagattggac ttgctccttt cggtttcccc383cacagaattt ttgtgggttg ccttttgttt ttctgctttg ggtcgtgtca tagtggctta443taagcggcag cateaagctg attcctgaag cttaactttc aagtgcattt tagaccagcc503ggtttaatgg gtaatggcca ttttactgcc ctcgagtttt cctggattaa gttccgcccc563ccaccctgct cttcagcagc ccctgcgctg gggctccaac tgtcacgtgc gtgtgcacac623tggacactgt taatcacacc aagttttcca tttgtttcca cctgggaaag gaggcagaat683gaccgagcca gagggagccc gcagaggggg tggaggctct tggggagctc ggagcagatc743taacccttgt ctcttttcct cccctgacct cag gag gct gca agt gga tcc gca 797Glu Ala Ala Ser Gly Ser Ala45ccc ctg caa tca tct act cag ttc aca cca tga cta ctc tga ttc caa 845Pro Leu Gln Ser Ser Thr Gln Phe Thr Pro Leu Leu Phe Gln50 55 60tca tct cta cat ttc tgt tcg agg att tct cca aag cca gtt gtt tca 893Ser Ser Leu His Phe Cys Ser Arg Ile Ser Pro Lys Pro Val Val Ser65 70 75aag gac aag gac cta cga ctt tcc acg aac gac tac tcc ttc tgt ccg 941Lys Asp Lys Asp Leu Arg Leu Ser Thr Asn Asp Tyr Ser Phe Cys Pro80 85 90ttt aca tcc cct act ttc tca tcc ctc tc 970Phe Thr Ser Pro Thr Phe Ser Ser Leu95 100
權(quán)利要求
1.一種豬背膘厚相關(guān)基因MAC30，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
2.、根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于PCR擴(kuò)增的基因組序列全長(zhǎng)為970bp，其中包含如附圖2所述的部分外顯子2和部分的外顯子3序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于序列表SEQ ID NO1的第848bp處有一個(gè)堿基突變(848G-848A)，導(dǎo)致其編碼的氨基酸由纈氨酸(GTC-ATC)變成異亮氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，其中克隆MAC30基因所用的引物的DNA序列如下所示5′-ATACCCAGGAGTTCAAAGACACT-3′(正向)，’5′-GAGAGGGATGAGAAAGTAGGGGA-3′(反向)，
5.權(quán)利要求1所述的DNA序列，其中檢測(cè)848G-848A堿基處突變的正、反向引物的DNA序列如序列表如下所示5’-GGGAGGAGTCTCTGTGTCGTGTGT-3’(正向引物)5′-GAGAGGGATGAGAAAGTAGGGGA-3′(反向引物)用于PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的引物的DNA序列如下所示5′-TAGTCGTTCGTGGAAAGTCGTAGGTC-3′(反向引物)
6.一種篩選適用于豬背膘厚性狀的分子標(biāo)記的方法，按照以下步驟用人MAC30基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性90％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)；然后對(duì)EST進(jìn)行拼接；根據(jù)與人MAC30基因的基因組全長(zhǎng)DNA序列的比對(duì)結(jié)果大致得出外顯子的拼接位點(diǎn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物；從豬血液基因組提取DNA，PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化和克隆測(cè)序，獲得如序列表SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
7.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的豬背膘厚相關(guān)基因MAC30在豬標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與豬背膘厚相關(guān)基因MAC30單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)方法及其在豬遺傳傳育種中作為分子標(biāo)記輔助選擇的應(yīng)用。從豬背膘厚相關(guān)基因MAC30克隆到部分基因組基因，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所示，該序列全長(zhǎng)為970bp，其中包含如附圖2所述的部分外顯子2和部分的外顯子3序列。在該序列的848bp處有一個(gè)堿基突變(848G－848A)，導(dǎo)致其編碼的氨基酸由纈氨酸(GTC－ATC)變成異亮氨酸。應(yīng)用本發(fā)明分別對(duì)原產(chǎn)于中國(guó)地方豬種和歐洲血統(tǒng)的豬種進(jìn)行了相關(guān)檢測(cè)，肯定了本發(fā)明用于豬遺傳輔助選擇的效果。本發(fā)明還提出了制備上述基因和用于檢測(cè)應(yīng)用的方法。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1721532SQ20041001348
公開日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2004年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月16日
發(fā)明者李奎, 楊金娥, 余梅, 劉榜, 樊斌, 朱猛進(jìn), 熊統(tǒng)安 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)