專利名稱：一種與綿羊背膘性狀相關(guān)的snp及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中一種利用單核苷酸多態(tài)性預(yù)測綿羊背膘性狀的方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)一個(gè)物種已知的基因序列設(shè)計(jì)簡并引物是獲得另一個(gè)物種未知基因的一種 發(fā)法。獲得基因后可以利用生物信息學(xué)手段對(duì)新基因進(jìn)行功能預(yù)測，并通過半定量RT-PCR 和熒光定量PCR對(duì)該基因進(jìn)行組織表達(dá)分析，通過多態(tài)性分析進(jìn)行驗(yàn)證。鈣蛋白酶抑制 蛋白(Calpastatin，CAST)基因在小鼠、人、兔和牛等物種存在不同的轉(zhuǎn)錄本，而且不同 的轉(zhuǎn)錄本在不同組織中的表達(dá)存在差異(Emori et al. ,1987, Proc Natl Acad Sci USA 84(11) 3590-3594 ；Killefer andKoohmaraie, 1994, J Anim Sci 72(3) 606-614 ；Takano et al. ,2000, JBiochem 128(1) :83_92)。Zhu等人發(fā)現(xiàn)CAST在睪丸組織中存在一新的亞 型，克隆了新基因，并推測可能與精子的發(fā)生與關(guān)(Zhu, H. et al.，2002，Acta Pharmacol Sin 23(5) :450_454)。單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(singlenucleotide polymorphism, SNP)是 1996 年被美 國MIT的Ε. Lander提出的，被稱為“第二代DNA遺傳標(biāo)記〃。其基本原理是對(duì)于一個(gè)經(jīng) PCR擴(kuò)增后具有固定長度的DNA片斷，其分子構(gòu)象是由堿基序列所決定的，因此單個(gè)堿基的 改變能夠引起DNA分子單鏈或等位基因間形成的錯(cuò)配異源雙鏈在變性條件下存在微小的 構(gòu)象差別，這些不同的構(gòu)象體在電泳或高效液相檢測中因移動(dòng)性的差異而得以區(qū)分。SNP的 檢測可以通過PCR-SSCP、PCR-RFLP、測序及SNP芯片等多種技術(shù)實(shí)現(xiàn)。目前知道牛的CAST基因存在四種轉(zhuǎn)錄本，但在羊上CAST基因的研究較少，而且 GenBank上的序列不能清楚知道它屬于CAST基因的那種轉(zhuǎn)錄本。有關(guān)羊CAST基因SNP的 檢測及功能驗(yàn)證研究還是一個(gè)空白，對(duì)于羊的標(biāo)記輔助選擇及育種帶來很大的障礙。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種綿羊單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，自SEQID No 1所示序列 的5’端起第162位堿基為G或者T。本發(fā)明還提供上述的綿羊單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記在綿羊背膘性狀預(yù)測中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用單核苷酸多態(tài)性預(yù)測綿羊背膘性狀的引物，其序 列如 SEQ ID No 2 和 SEQ ID No 3 所示。本發(fā)明提供的綿羊單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記在綿羊背膘性狀預(yù)測中的應(yīng)用，具體是用 上述的引物對(duì)綿羊的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后再對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢 測，確定自序列表中SEQID No 1的5’端第162位堿基為G還是T，GT基因型的個(gè)體的背膘 厚度顯著性的大于GG基因型的個(gè)體。所述單核苷酸多態(tài)性檢測的方法為DNA測序、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)_限制性酶切位點(diǎn) 長度多態(tài)性、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)_單鏈構(gòu)象多態(tài)性或等位基因特異的寡核苷酸雜交。優(yōu)選為 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)_限制性酶切位點(diǎn)長度多態(tài)性。其中限制性內(nèi)切酶選用Hinfl。
3
本發(fā)明還提供含有SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所述引物的用于單核苷酸多態(tài)性 預(yù)測綿羊背膘性狀的試劑盒。該試劑盒還包括PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶、dNPTs、滅菌雙 蒸水。該試劑盒還可包括限制性內(nèi)切酶HinfI及其緩沖液。本發(fā)明利用綿羊的CAST基因的SNP突變位點(diǎn)進(jìn)行基因型快速分型。不同的綿羊群 體存在這些多態(tài)位點(diǎn)上的基因型頻率和基因頻率存在顯著差異。利用一般線性模型對(duì)CAST 基因的CAST-S3的g. G162T與綿羊的生產(chǎn)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，通過SASvS. 02軟件進(jìn)行線性 模型分析發(fā)現(xiàn)，CAST-S3的g. G162T突變與背膘厚度間存在關(guān)聯(lián)，GT型的背膘厚度顯著高于 GG型(P<0.05)。該多態(tài)位點(diǎn)的檢出，不僅為分子育種提供了新的素材，同時(shí)為綿羊背膘 厚度的標(biāo)記輔助選擇提供科學(xué)依據(jù)。


圖1為CAST-S3擴(kuò)增片段的SSCP結(jié)果。圖2為CAST-S3擴(kuò)增片段的測序峰圖。圖3為CAST-S3擴(kuò)增片段的RFLP結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1(1)用眼科手術(shù)剪將約0.3g肌肉組織塊充分剪碎，置于1.5ml離心管中，干燥 20mino(2)在上述離心管中加入500 μ 1組織DNA提取液。(3)在上述離心管中加入RNA酶溶液至終濃度為20μ g/ml，充分混勻，37°C消化 1 2小時(shí)。(4)在上述離心管中加入蛋白酶K至終濃度為150yg/ml，充分混勻，55°C消化 12 24小時(shí)。(5)在上述離心管中加入等體積的Tris飽和酚，緩慢顛倒離心管10分鐘使溶液的 兩相充分混勻4°C，12000rpm離心10分鐘，然后轉(zhuǎn)移上清液至一個(gè)干凈的離心管中。重復(fù)一次。(6)再加入用等體積的Tris飽和酚氯仿異戊醇(25 24 1)，混勻，4°C， 12000rpm離心10分鐘。(7)取出上清液，轉(zhuǎn)移入新的離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇(24 1)， 4°C, 12000rpm 離心 10 分鐘。(8)取上清，加入1/10體積的3M NaAc (pH5. 2)和2倍體積的冰凍無水乙醇沉淀 DNA。(9)將DNA沉淀挑出，置于新的干凈的1. 5ml離心管中，用90%乙醇洗滌兩次。(10)將DNA自然晾干后，加入適量TE或滅菌雙蒸水進(jìn)行溶解，-20°C保存。共檢測樣本676個(gè)，小尾寒羊純種個(gè)體36個(gè)，杜泊羊*湖羊雜交個(gè)體450個(gè)，陶賽特羊*湖羊雜交個(gè)體145個(gè)，薩福克羊*新疆細(xì)毛羊雜交個(gè)體45個(gè)。其中小尾寒羊純種個(gè) 體用于PCR-SSCP分析，檢測多態(tài)位點(diǎn)；三個(gè)雜種羊群體用于PCR-RFLP多態(tài)性大規(guī)模檢測。實(shí)施例2PCR-SSCP的PCR引物如下表所示。1、PCR 擴(kuò)增表1 5對(duì)特異性引物序列、退火溫度及目的片段長度
權(quán)利要求
一種綿羊單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，其特征在于，在SEQ ID No 1所示序列的自5’端起第162位堿基為G或者T。
2.權(quán)利要求1所述的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記在綿羊背膘性狀預(yù)測中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，用序列如SEQIDNo 2和SEQ ID No 3所 示的引物對(duì)綿羊的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后再對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測， 確定自序列表中SEQ ID No 1的5’端起第162位堿基為G還是T，GT基因型的背膘厚度顯 著厚于GG基因型。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述單核苷酸多態(tài)性檢測的方法選自DNA 測序、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性酶切位點(diǎn)長度多態(tài)性、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性或 等位基因特異的寡核苷酸雜交。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述單核苷酸多態(tài)性檢測的方法為聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)_限制性酶切位點(diǎn)長度多態(tài)性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)_限制性酶切位點(diǎn) 長度多態(tài)性所用的內(nèi)切酶為Hinfl。
7.用于檢測權(quán)利要求1所述的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記的試劑盒，其特征在于，包括序列 如SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示的引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，還包括PCR緩沖液、TaqDNA聚合酶、 dNPTs、滅菌雙蒸水。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，還包括限制性內(nèi)切酶Hinfl及其緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種利用單核苷酸多態(tài)性預(yù)測綿羊背膘性狀的方法。該方法用SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所述的引物對(duì)綿羊的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后再對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測，確定自序列表中SEQ ID No 1的5’端第162位堿基為G還是T，GT基因型的背膘厚度顯著厚于GG基因型。該多態(tài)位點(diǎn)的檢出，不僅為分子育種提供了新的素材，同時(shí)為綿羊背膘厚度的標(biāo)記輔助選擇提供科學(xué)依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101942438SQ20101027739
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者張莉, 張菊, 杜立新, 路國彬, 魏彩虹 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所