豬背膘厚與肌內(nèi)脂肪性狀相關(guān)基因svep1的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及豬分子標(biāo)記制備領(lǐng)域，具體地指一種豬背膘厚與肌內(nèi)脂肪性狀相關(guān)基因SVEP1的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明利用SVEP1基因序列中包含一個(gè)SNP位點(diǎn)，位于核苷酸序列SEQ ID NO.1的第44581bp處，該位點(diǎn)為A/G的堿基突變，導(dǎo)致Sfc Ⅰ?RFLP多態(tài)性。這個(gè)堿基突變位于SVEP1基因第3內(nèi)含子中，不改變其翻譯的氨基酸序列。故在SVEP1基因序列的SNP位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)引物，得到分子標(biāo)記序列SEQ ID NO.2，從而鑒定豬背膘厚和肌內(nèi)脂肪性狀。本發(fā)明利用現(xiàn)有的PCR?RFLP技術(shù)，在SVEP1基因第44581bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)A/G突變，且發(fā)現(xiàn)此多態(tài)位點(diǎn)與背膘厚和肌內(nèi)脂肪性狀(極)顯著相關(guān)，對(duì)豬生長性狀和肉質(zhì)性狀的研究有一定幫助。
【專利說明】
豬背膘厚與肌內(nèi)脂肪性狀相關(guān)基因 SVEP1的分子標(biāo)記及其 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及豬分子標(biāo)記制備領(lǐng)域，具體地指一種豬背膘厚與肌內(nèi)脂肪性狀相關(guān)基 因 SVEP1的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 畜牧業(yè)在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中占據(jù)著非常重要的地位，其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中所占有的比值 通常用來衡量一個(gè)國家和地區(qū)發(fā)展程度的重要指標(biāo)。豬肉作為我國最主要的肉類來源，生 豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)在我國畜牧業(yè)中占據(jù)著舉足輕重的地位。在20世紀(jì)80年代中期，我國肉類產(chǎn)量 約2000萬噸，豬肉約占85%，2012年豬肉產(chǎn)量達(dá)到了5335萬噸，約占肉類總量63.63%。雖然 豬肉所占比重逐漸下降，但其始終占據(jù)主導(dǎo)地位。
[0003] 隨著社會(huì)的發(fā)展和消費(fèi)水平的提高，消費(fèi)者對(duì)豬肉品質(zhì)的要求日益增高，使豬肉 生產(chǎn)者和豬育種者要更加關(guān)注胴體品質(zhì)和肉質(zhì)性狀的改良。背膘薄、肌內(nèi)脂肪含量高一直 以來都是豬育種工作中的重點(diǎn)目標(biāo)性狀，隨著百年來的育種工作進(jìn)展，肉品質(zhì)優(yōu)良成為我 國地方豬種的優(yōu)良特性之一。
[0004] 我國地方豬種甚至含地方豬種血統(tǒng)的培育品種及雜交品系都因其優(yōu)良的肉品質(zhì)， 廣受消費(fèi)者歡迎。但是這些豬種多數(shù)都為脂肪型豬，其顯著特點(diǎn)是背膘厚度大，我國地方豬 種及含有地方豬血統(tǒng)的品種背膘厚平均在3厘米以上。背膘沉積過多不僅導(dǎo)致生長緩慢，同 時(shí)也不符合當(dāng)前形勢(shì)對(duì)于節(jié)糧的要求。此外，肌內(nèi)脂肪會(huì)顯著影響豬肉風(fēng)味，高的肌內(nèi)脂肪 含量的豬肉具有更好的風(fēng)味(黃業(yè)傳，賀稚非等.皮下脂肪和肌內(nèi)脂肪對(duì)豬肉風(fēng)味的作用： [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011,44(10): 2118-2130)。然而絕大多數(shù)胴體性狀和肉質(zhì)性狀只能依 靠屠宰法進(jìn)行性能測(cè)定，傳統(tǒng)選育方法很難取得較大遺傳進(jìn)展，分子標(biāo)記輔助育種是肉質(zhì) 改良的有效途(劉欣.豬胴體性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析及背膘厚主要基因篩選研究：[D].北 京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014)。盡管目前A超、B超在測(cè)定活體豬背膘厚方面有一定應(yīng)用，但該測(cè) 定結(jié)果易受到各方面影響，如:豬只無法完全保定、易受測(cè)量環(huán)境影響而產(chǎn)生應(yīng)激等等，而 且劉煒等研究已明確發(fā)現(xiàn)該方法測(cè)定豬背膘厚的擴(kuò)展不確定度高達(dá)11.8%，因此在規(guī)?；?育種工作中利用此類方法會(huì)引入大量不準(zhǔn)確因素，最終影響選育效果(楊秀娟，鄧斌等.豬 背膘厚與眼肌厚活體A超測(cè)量技術(shù)研究：[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2014,42(5):23-27; 劉煒，吳昊昊等.豬活體背膘厚和眼肌面積不確定度評(píng)定：[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2013，6: 77)。此外，肌內(nèi)脂肪性狀更是只能通過屠宰法進(jìn)行測(cè)定，給育種工作帶來了極大的工作量。
[0005] SVEP1基因在2006年被Shur I等發(fā)現(xiàn)在骨骼組織、骨膜、骨髓以及骨髓間葉基質(zhì)細(xì) 胞中表達(dá)，在肌肉和軟骨中表達(dá)很低或不表達(dá)，可作為CAMs的組分調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附作用 (Shur I,Socher R,Hameiri M,Fried A,Benayahu D.Molecular and cellular characterization of SEL-〇B/SVEPlin osteogenic cells in vivo and in vitro[J].J Cell Physiol ,2006Feb;206(2) :420-7)。隨后，Glait-Santar C等發(fā)現(xiàn)SVEP1 基因參與間葉 細(xì)胞的粘附過程，可以傳導(dǎo)微環(huán)境中與細(xì)胞活性相關(guān)的信號(hào)，該基因在肌原細(xì)胞融合和肌 管形成過程中表達(dá)，表達(dá)量隨著肌管成熟而減少(Shefer G，Benayahu D.SVEPlis a novel marker of activated pre-determined skeletal muscle satellite cells[J]. Stem CellRev·2010Mar;42-9)。2012年，Glait-SantarC等發(fā)現(xiàn)SVEPlmodule在骨骼組織和各種 乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)，參與調(diào)控骨骼微環(huán)境的交互網(wǎng)絡(luò)，是骨小生境中生理病理交互的調(diào)節(jié) 因子（Glait-Santar C，Pasmanik-Chor Μ , Benayahu D . Expression pattern of SVEPlalternatively-spliced forms[J] .Gene · 2012Aug; 137-45)。最新研究表明，SVEP1 基 因參與到脂肪酸儲(chǔ)存以及葡萄糖代謝過程(Kokosar M，Benrick A，Perfilyev A，F(xiàn)ornes R,Nilsson E,Maliqueo M,Behre CJ,Sazonova A,0hlsson C,Ling C,Stener-Victorin E.Epigenetic and Transcriptional Alterations in Human Adipose Tissue of Polycystic Ovary Syndrome[J].Sci Rep.2016Mar 15;6:22883)，推測(cè)SVEP1 可能通過調(diào) 節(jié)脂肪酸和葡萄糖代謝進(jìn)而影響脂肪沉積等過程。由于脂肪酸及葡萄糖代謝與背膘厚和肌 內(nèi)脂肪性狀密切相關(guān)，因此可以研究SVEP1基因是否對(duì)豬生長和肉質(zhì)性狀產(chǎn)生影響，這對(duì)改 良豬的經(jīng)濟(jì)性狀和分子標(biāo)記輔助育種有重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種豬背膘厚與肌內(nèi)脂肪性狀相關(guān)基因 SVEP1的分子標(biāo)記及 其應(yīng)用。隨著分子標(biāo)記輔助育種的發(fā)展，越來越多的分子標(biāo)記被用于大群體中目標(biāo)性狀的 選擇，該方法具有快速、準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件干擾的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)SVEP1基因中 的一個(gè)SNP位點(diǎn)，該位點(diǎn)與豬背膘厚以及肌內(nèi)脂肪含量顯著相關(guān)，因此可以用作群體育種的 分子標(biāo)記，提高育種效率。本發(fā)明利用該分子標(biāo)記可迅速預(yù)測(cè)不同基因型群體豬之間背膘 厚以及肌內(nèi)脂肪含量的差別，同時(shí)在豬育種工作中，該分子標(biāo)記可作為背膘厚與肌內(nèi)脂肪 性狀的可靠標(biāo)記。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種豬背膘厚與肌內(nèi)脂肪性狀相關(guān)基因 SVEP1的 分子標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，其中，該分子標(biāo)記的核苷酸序列的340bp處還 有一個(gè)SNP位點(diǎn)G/A。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種用于獲得上述分子標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于:所述引物對(duì) 為：
[0009] 正向引物：5 ' -TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3 ' ；
[0010] 反向引物：
[0011] 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種上述分子標(biāo)記的獲得方法，以具有SVEP1基因的豬基因組DNA 為模板，采用以下引物對(duì)：
[0013]正向引物：5'-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3' ；
[0014]反向引物：
[0015] 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '；
[0016]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其所獲得的分子標(biāo)記為SEQ ID N0.2。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種利用分子標(biāo)記鑒定豬高的背膘厚和肌內(nèi)脂肪性狀的方法，以 待測(cè)豬的基因組DNA為模板，采用以下引物對(duì)：
[0018] 正向引物：5'-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3' ；
[0019] 反向引物：
[0020] 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '；
[0021] 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，具有579bp條帶的豬，其具有SVEP1基因，如SEQ ID N0.1。
[0022] 上述具體方法如下：
[0023] -種與豬背膘厚以及肌內(nèi)脂肪性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的獲得：
[0024] 1)豬SVEP1基因的引物設(shè)計(jì)與部分DNA序列擴(kuò)增
[0025] 用豬SVEP1基因序列信息(GenBank收錄號(hào):ENSSSCG00000005455)作為引物設(shè)計(jì)的 模板序列，利用生物學(xué)引物設(shè)計(jì)軟件01ig〇7.0設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：
[0026] 正向引物：5'-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3' ；
[0027]反向引物：
[0028] 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '；
[0029] 2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)：
[0030] 利用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒（購自美國invitrogen公司）從純種美系大 白閹割豬實(shí)驗(yàn)群體(該群體來源于湖北金林育種場(chǎng)，）（屠宰測(cè)定與采樣分成21個(gè)批次進(jìn)行， 測(cè)定個(gè)體數(shù)量共計(jì)201頭，全部為美系純種大白閹割公豬)耳組織中提取基因組DNA，具體操 作方法參照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒說明書進(jìn)行。
[0031] PCR反應(yīng):PCR反應(yīng)總體積1 Ομ 1，其中豬基因組DNA模板1 μ 1，正反向引物各0.2nmo 1 / yl，PCRmix 5μ1，最后加入去離子水至總體積10yl;PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min后，循 環(huán)31次95°C變性3〇8、60°(：退火3〇8、72°(：延伸368;最后72°(：延伸51^11;?0?產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂 糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得了部分SVEPl片段，長度為579bp，其序列為SEQINN0.2所示。
[0032] 3)PCR產(chǎn)物的純化、測(cè)序
[0033] PCR產(chǎn)物的純化:在紫外燈下從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入 1.5ml離心管中，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購自北京百泰克公司）純化PCR產(chǎn)物。將純化后 的DNA溶液送至鉑尚生物技術(shù)有限公司正反向測(cè)序。
[0034]用引物擴(kuò)增豬基因組DNA得到了 579bp特異性擴(kuò)增片段，如圖2所示，正反向測(cè)序結(jié) 果發(fā)現(xiàn)該片段所在的SVEP1基因 （SEQ ID N0.1所示）的第44581位置發(fā)現(xiàn)一個(gè)A-G轉(zhuǎn)換(如圖 3所示），造成一個(gè)Sfcl酶切位點(diǎn)WTRY_AG
[0035]本發(fā)明還提供了一種上述分子標(biāo)記在豬背膘厚與肌內(nèi)脂肪性狀相關(guān)分子標(biāo)記輔 助育種中的應(yīng)用，具體應(yīng)用方法如下：
[0036]采集樣品的背膘厚、失水率、PH1均值、肌內(nèi)脂肪、平均日增重及剩余采食量6項(xiàng)指 標(biāo)。根據(jù)采集樣品的群體結(jié)構(gòu)，運(yùn)用混合模型來統(tǒng)計(jì)分析SVEP1基因 SNP位點(diǎn)的基因型效應(yīng) 及其與上述6項(xiàng)性狀之間的關(guān)系：
[0037] Yij = y+genotypei+eij+G
[0038]其中，Yij為處理后性狀值，μ為總體均值，eij為隨機(jī)誤差，G為批次效應(yīng)，假定服從N (0,〇2)分布。即可分析出基因型效應(yīng)，完成基因型效應(yīng)的多重性比較。采用R語言軟件 (vers ion: 3.2.3)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。
[0039]統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)該基因的A>G突變基因型，其中AA型與GG型的不同、AG型與GG型的不 同均與背膘厚極顯著相關(guān)(？ = 〇.〇〇497，？ = 0.00133)4六型與66型的不同與肌內(nèi)脂肪顯著 相關(guān)(P = 〇. 0276)，與失水率、PH1均值、平均日增重及剩余采食量不顯著相關(guān)。通過最小二 乘均數(shù)對(duì)基因型為AA、GG、AG的個(gè)體進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果表明GG型基因型個(gè)體背膘厚極顯著 高于AA型和AG型基因型個(gè)體，AA型基因型與AG型基因型之間無顯著差異，且GG型基因型個(gè) 體肌內(nèi)脂肪顯著高于AA型基因型個(gè)體，AG型基因型個(gè)體與其他兩種基因型個(gè)體之間無顯著 差異。
[0040] 本發(fā)明還提供了一種上述分子標(biāo)記的引物對(duì)在豬背膘厚與肌內(nèi)脂肪性狀相關(guān)分 子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0041] 本發(fā)明還提供了一種鑒定含有SVEP1基因的豬的方法，其特征在于，包括以下步 驟:1)引物對(duì)：
[0042] 正向引物：5 ' -TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3 ' ；
[0043]反向引物：
[0044] 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '；
[0045] 2)PCR擴(kuò)增條件
[0046] PCR反應(yīng)總體積10μ1，其中待測(cè)豬基因組DNA模板ΙμL，正反向引物各0.2nmolAU， PCRmix 5μ1，最后加入去離子水至總體積10μ1;
[0047] 3)PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min后，循環(huán)31次95°C變性30s、60°C退火30s、72°C 延伸36s;最后72 °C延伸5min; PCR產(chǎn)物經(jīng)2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；
[0048] 4)RFLP 檢測(cè)
[0049] PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是10μ1，其中PCR產(chǎn)物2μ1，去離子水6.6μ1，10 X buf f er 1μ 1，限制性內(nèi)切酶Sfcl為0.4μ1，將樣品混勻后離心，36°C培養(yǎng)箱放置2h，用2%的瓊脂糖凝膠 電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照；
[0050] SEQ ID N0.2序列中存在兩個(gè)酶切位點(diǎn)，一個(gè)固有酶切位點(diǎn)位于178bp處，另外一 個(gè)由于SNP突變產(chǎn)生的酶切位點(diǎn)位于340bp處。酶切產(chǎn)生三種基因型，AA基因型有178bp和 401bp兩條帶，雜合子AG基因型有162匕？、178匕？、23%?和40比？四條帶（由于162匕?和178匕？片 段長度相差很小，這兩條帶會(huì)混合在一起，所以在紫外燈下拍照只顯示出三條帶，但不影響 分辨基因型），GG基因型有162bp、178bp和239bp三條帶（由于162bp和178bp片段長度相差很 小，這兩條帶會(huì)混合在一起，所以在紫外燈下拍照只顯示出兩條帶，但不影響分辨基因型）。 [0051 ] 本發(fā)明原理SVEP1基因序列中包含一個(gè)SNP位點(diǎn)，位于核苷酸序列SEQ ID N0.1的 第44581bp處，該位點(diǎn)為A/G的堿基突變，導(dǎo)致SfcI-RFLP多態(tài)性。這個(gè)堿基突變位于SVEP1基 因第3內(nèi)含子中，不改變其翻譯的氨基酸序列。故在SVEP1基因序列的SNP位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)引 物，得到分子標(biāo)記序列SEQ ID N0.2,從而鑒定豬背膘厚和肌內(nèi)脂肪性狀。
[0052]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0053] 本發(fā)明利用現(xiàn)有的PCR-RFLP技術(shù)，在SVEP1基因第44581bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)A/G突變，且 發(fā)現(xiàn)此多態(tài)位點(diǎn)與背膘厚和肌內(nèi)脂肪性狀顯著相關(guān)，對(duì)豬生長性狀和肉質(zhì)性狀的研究有一 定幫助。
【附圖說明】
[0054]圖1為本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
[0055]圖2為豬SVEP1基因基因組擴(kuò)增電泳結(jié)果示意圖。
[0056] M:DL2000分子量標(biāo)記。
[0057]圖3為本發(fā)明中豬SVEP1基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)的A>G突變。
[0058] 圖4為豬SVEP1基因外顯子的SfcI-RFLP的三種基因型（AA GG AG)電泳結(jié)果示意 圖。
[0059] M:2000bp DNA分子量標(biāo)記。
【具體實(shí)施方式】
[0060] 為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但 本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。
[0061 ] 實(shí)施例1:
[0062] -種與豬背膘厚和肌內(nèi)脂肪性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的獲得：
[0063] 1)豬SVEP1基因的引物設(shè)計(jì)與部分DNA序列擴(kuò)增
[0064] 用豬SVEP1基因序列信息(GenBank收錄號(hào):ENSSSCG00000005455)作為引物設(shè)計(jì)的 模板序列，利用生物學(xué)引物設(shè)計(jì)軟件01ig〇7.0設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：
[0065] 正向引物：5 ' -TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3 ' ；
[0066] 反向引物：
[0067] 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '；
[0068] 2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)：
[0069] 利用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒（購自美國invitrogen公司）從純種美系大 白閹割豬實(shí)驗(yàn)群體(該群體來源于湖北金林育種場(chǎng)）（屠宰測(cè)定與采樣分成21個(gè)批次進(jìn)行， 測(cè)定個(gè)體數(shù)量共計(jì)201頭，全部為美系純種大白閹割公豬)耳組織中提取基因組DNA，具體操 作方法參照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒說明書進(jìn)行。
[0070] PCR反應(yīng):PCR反應(yīng)總體積1 Ομ 1，其中豬基因組DNA模板1 μ 1，正反向引物各0.2nmo 1 / yl，PCRmix 5μ1，最后加入去離子水至總體積10yl;PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min后，循 環(huán)31次95°C變性3〇8、60°(：退火3〇8、72°(：延伸368;最后72°(：延伸51^11;?0?產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂 糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得了部分SVEPl片段，長度為579bp，其序列為SEQINN0.2所示。
[0071] 3)PCR產(chǎn)物的純化、測(cè)序
[0072] PCR產(chǎn)物的純化:在紫外燈下從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入 1.5ml離心管中，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購自北京百泰克公司）純化PCR產(chǎn)物，按照試劑 盒說明書操作，具體步驟是按照l〇〇mg膠塊加入400μ1 GS Buffer的比例加入GS Buffer，置 50°C溫育10min，使瓊脂糖膠塊完全溶化，每兩分鐘顛倒混勻一次;將溶化的膠液轉(zhuǎn)入到離 心吸附柱，并將離心吸附柱置于廢液收集管中，lOOOOrpm離心30s，棄去廢液;將離心吸附柱 置回廢液收集管中，加入500μ1 Wash Buffer于離心吸附柱中，lOOOOrpm離心30s，棄濾液。 以同樣的方法再用500yl Wash Buffer溶液洗滌一次;將離心吸附柱置會(huì)廢液收集管中，最 高速度離心lmin;小心取出離心吸附柱，將其套入一個(gè)無菌的1.5ml離心管中，在吸附膜中 央加入30μ1雙蒸水，室溫靜置2-10min后，最高速度離心lmin;取出離心吸附柱，將1.5ml離 心管(DNA溶液)置于-20°C保存?zhèn)溆?。將純化后的DNA溶液送至鉑尚生物技術(shù)有限公司正反 向測(cè)序。
[0073] 用引物擴(kuò)增豬基因組DNA得到了 579bp特異性擴(kuò)增片段，如圖2所示，正反向測(cè)序結(jié) 果發(fā)現(xiàn)該片段所在的SVEP1基因 （SEQ ID N0.1所示）的第44581位發(fā)現(xiàn)一個(gè)A-G轉(zhuǎn)換（如圖3 所示），造成一個(gè)Sf cI酶切位點(diǎn)(CTTRYA_G_):。
[0074] 實(shí)施例2
[0075] -種基于與豬背膘厚和肌內(nèi)脂肪性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，其步驟如下：
[0076] PCR-RFLP診斷方法建立
[0077] 1)引物序列
[0078] 正向引物：5'-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3' ；
[0079] 反向引物：
[0080] 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '；
[0081 ]該引物擴(kuò)增片段長度579bp，其序列為SEQIDN0.2所示。
[0082] 2)PCR擴(kuò)增條件
[0083] PCR反應(yīng)總體積10μ1，其中待測(cè)豬基因組DNA模板ΙμL，正反向引物各0.2nmolAU， PCRmix 5μ1，最后加入去離子水至總體積10μ1 WCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min后，循環(huán)31 次95°C變性3〇8、60°(：退火3〇8、72°(：延伸368;最后72°(：延伸51^11;?0?產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝 膠電泳檢測(cè)。
[0084] 3)RFLP 檢測(cè)
[0085] PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是10μ1，其中PCR產(chǎn)物2μ1，去離子水6.6μ1，10 X buf f er 1μ 1，限制性內(nèi)切酶Sfcl為0.4μ1，將樣品混勻后離心，36°C培養(yǎng)箱放置2h，用2%的瓊脂糖凝膠 電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照；
[0086] SEQ ID N0.2序列中存在兩個(gè)酶切位點(diǎn)，一個(gè)固有酶切位點(diǎn)位于178bp處，另外一 個(gè)由于SNP突變產(chǎn)生的酶切位點(diǎn)位于340bp處。酶切產(chǎn)生三種基因型，AA基因型有178bp和 401bp兩條帶，雜合子AG基因型有162匕？、178匕？、23%?和40比？四條帶（由于162匕?和178匕？片 段長度相差很小，這兩條帶會(huì)混合在一起，所以在紫外燈下拍照只顯示出三條帶，但不影響 分辨基因型），GG基因型有162bp、178bp和239bp三條帶（由于162bp和178bp片段長度相差很 小，這兩條帶會(huì)混合在一起，所以在紫外燈下拍照只顯示出兩條帶，但不影響分辨基因型）。 [0087] 實(shí)施例3
[0088] -種與豬背膘厚和肌內(nèi)脂肪性狀相關(guān)的分子標(biāo)記在不同豬群體多態(tài)性檢測(cè)中的 應(yīng)用，其步驟是：
[0089]利用PCR-SfcI-RFLP檢測(cè)了純種美系大白閹割豬實(shí)驗(yàn)群體(該群體來源于湖北金 林育種場(chǎng)）（201個(gè)美系純種大白閹割公豬群體）。該突變位點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)群體中的基因型和基因 頻率如表1所示，檢測(cè)結(jié)果顯示，SVEP1基因在實(shí)驗(yàn)群體中存在三種基因型，其中AA型個(gè)體有 71頭，AG型個(gè)體有97頭，GG型個(gè)體有33頭，酶切分型的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相符，本發(fā)明的 檢測(cè)方法可靠。此結(jié)果表明SVEP1基因在純種美系大白閹割豬實(shí)驗(yàn)群體中等位基因 A占優(yōu) 勢(shì)。
[0090] 實(shí)施例4
[0091] -種與豬背膘厚和肌內(nèi)脂肪性狀相關(guān)的分子標(biāo)記與部分生長性狀及肉質(zhì)性狀的 關(guān)聯(lián)分析
[0092] 本實(shí)施例的豬群來自本湖北金林育種場(chǎng)純種美系大白閹割豬，屠宰測(cè)定與采樣分 成21個(gè)批次進(jìn)行，測(cè)定個(gè)體數(shù)量共計(jì)201頭，全部為美系純種大白閹割公豬。
[0093] 所分析的性狀主要是部分生長性狀及與飼料轉(zhuǎn)化效率性狀相關(guān)的性狀，包括:背 膘厚、失水率、PHI均值、肌內(nèi)脂肪、平均日增重及剩余采食量6項(xiàng)指標(biāo)。根據(jù)采集樣品的群體 結(jié)構(gòu)，
【申請(qǐng)人】運(yùn)用混合模型來統(tǒng)計(jì)分析SVEP1基因 SNP位點(diǎn)的基因型效應(yīng)及其與部分生長和 肉質(zhì)性狀的關(guān)系：
[0094] Yi j =y+genotypei+￡ij+G
[0095]其中，Yi j為處理后性狀值，μ為總體均值，ε i j為隨機(jī)誤差，G為批次效應(yīng)，假定服從 N(0,〇2)分布。即可分析出基因型效應(yīng)，完成基因型效應(yīng)的多重性比較。采用R語言軟件 (vers ion: 3.2.3)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。
[0096]對(duì)豬SVEP1基因 SfcI-RFLP多態(tài)性位點(diǎn)與部分生長及飼料轉(zhuǎn)化效率性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián) 分析，由表1知:在201個(gè)個(gè)體中AA型個(gè)體有71頭，AG型個(gè)體有97頭，GG型個(gè)體有33頭。
[0097]本實(shí)施例采用R語言軟件中的廣義線性模型對(duì)豬SVEP1基因的A>G突變位點(diǎn)的多態(tài) 在美系大白閹割豬群體中對(duì)部分生長及肉質(zhì)性狀進(jìn)行了初步的關(guān)聯(lián)分析。初步分析結(jié)果見 表1。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)該基因的A>G突變基因型，其中AA型與GG型的不同、AG型與GG型的不同均 與背膘厚極顯著相關(guān)(？ = 〇.〇〇497，？ = 0.00133)4六型與66型的不同與肌內(nèi)脂肪顯著相關(guān) (P = 0.0276)，與失水率、PH1均值、平均日增重及剩余采食量不顯著相關(guān)。通過最小二乘均 數(shù)對(duì)基因型為AA、GG、AG的個(gè)體進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果表明GG型基因型個(gè)體背膘厚極顯著高于 AA型和AG型基因型個(gè)體，AA型基因型與AG型基因型之間無顯著差異，且GG型基因型個(gè)體肌 內(nèi)脂肪顯著高于AA型基因型個(gè)體，AG型基因型個(gè)體與其他兩種基因型個(gè)體之間無顯著差 異。
[0098]表1 SVEP1基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型與部分生長性狀及肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析檢測(cè) [0099]
[0100]注:表中的性狀均值為平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差。
[0101] RFI:剩余采食量。
[0102] 其它未詳細(xì)說明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出了詳盡的描 述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，人們還可以根據(jù)本實(shí)施例在不經(jīng) 創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí)施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種豬背膘厚與肌內(nèi)脂肪性狀相關(guān)基因 SVEP1的分子標(biāo)記，其特征在于:其核苷酸序 列如SEQIDN0.2所示，其中，該分子標(biāo)記的核苷酸序列的340bp處還有一個(gè)SNP位點(diǎn)G/A。2. 用于獲得權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于:所述引物對(duì)為： 正向引物：5 ' -TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3 ' ； 反向引物： 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '。3. 按權(quán)利要求1或2所述分子標(biāo)記的獲得方法，其特征在于：以具有SVEP1基因的豬基因 組DNA為模板，采用以下引物對(duì)： 正向引物：5 ' -TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3 ' ； 反向引物： 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '； 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其所獲得的分子標(biāo)記為SEQ ID NO.2。4. 按照權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記鑒定豬背膘厚與肌內(nèi)脂肪性狀的方法，以待測(cè)豬的 基因組DNA為模板，采用以下引物對(duì)： 正向引物：5 ' -TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3 ' ； 反向引物： 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '； 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，具有579bp條帶的豬，其具有SVEP1基因，如SEQ ID N0.1。5. 權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在豬部分生長性狀及肉質(zhì)性狀相關(guān)分子標(biāo)記輔助育種中 的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記的引物對(duì)在豬部分生長性狀及肉質(zhì)性狀相關(guān)分子標(biāo)記輔 助育種中的應(yīng)用。7. -種鑒定含有SVEP1基因的豬的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 引物對(duì)： 正向引物：5 ' -TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3 ' ； 反向引物： 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '； 2. PCR擴(kuò)增條件 PCR反應(yīng)總體積10μ1，其中待測(cè)豬基因組DNA模板ΙμL，正反向引物各0.2nmol/yl， PCRmix 5μ1，最后加入去離子水至總體積10μ1; 3. PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min后，循環(huán)31次95°C變性3〇8、60°(：退火3〇8、72°(：延伸 36s;最后72°C延伸5min;PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)； 4. RFLP檢測(cè) PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是10μ1，其中PCR產(chǎn)物2μ1，去離子水6.6μ1，10 X buf f er ΙμL，限 制性內(nèi)切酶Sfcl為0.4μ1，將樣品混勻后離心，36°C培養(yǎng)箱放置2h，用2%的瓊脂糖凝膠電泳 檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照； SEQ ID NO.2序列中存在兩個(gè)酶切位點(diǎn)，一個(gè)固有酶切位點(diǎn)位于178bp處，另外一個(gè)由 于SNP突變產(chǎn)生的酶切位點(diǎn)位于340bp處，酶切產(chǎn)生三種基因型，AA基因型有178bp和401bp 兩條帶，雜合子AG基因型有162匕？、178匕？、23%?和40訃？四條帶，66基因型有162匕？、178匕?和
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105838795SQ201610268426
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年4月27日
【發(fā)明人】李長春, 鄒成, 羅文哲, 李菁璇, 張皓源, 吳宇, 胡岸, 趙書紅, 余梅, 李新云
【申請(qǐng)人】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)