專利名稱：豬wfikkn2基因作為胴體性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于豬的分子標(biāo)記制備領(lǐng)域，具體涉及一種作為豬標(biāo)記輔助選擇的與胴體性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的制備及應(yīng)用。

背景技術(shù)：
豬胴體性狀一直是豬遺傳改良的目標(biāo)性狀，是重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一。胴體性狀主要有背膘厚度、胴體長(zhǎng)度、眼肌面積、腿臀比例、胴體瘦肉率等。屠宰率和胴體瘦肉率高的豬能帶來(lái)更高的經(jīng)濟(jì)效益。由于胴體性狀無(wú)法進(jìn)行活體測(cè)定，常規(guī)育種方法對(duì)這類性狀的改良無(wú)法實(shí)施個(gè)體選擇，往往采用同胞選擇進(jìn)行改良，其改良效果往往不佳。近年來(lái)隨著豬QTL和分子標(biāo)記的研究進(jìn)展以及標(biāo)記輔助選擇在育種中的應(yīng)用，豬胴體性狀的改良速度得到了很大的提高。但是豬的胴體性狀是一類數(shù)量性狀是受多基因控制的，目前的研究還僅僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)控制胴體性狀的基因和分子標(biāo)記，大量的候選基因和分子標(biāo)記還有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。
目前與豬胴體性狀相關(guān)的QTL幾乎分布于豬的所有染色體，通過(guò)功能候選基因法或位置克隆的策略篩選了一些與胴體性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。目前已發(fā)現(xiàn)許多與胴體性狀存在顯著關(guān)聯(lián)的基因瘦素受體(Leptinreceptor，LEPR)基因和心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(Heart fatty acid binding protein，H-FABP)是豬6號(hào)染色體上影響背膘厚度，肌內(nèi)脂肪含量和眼肌面積等QTL區(qū)域候選基因，連鎖分析表明H-FABP和LEPR基因位于SSC685.4cM和107cM位置，PCR-RFLP分析表明H-FABP基因單核苷酸多態(tài)與肌內(nèi)脂肪和眼肌面積顯著相關(guān)，LEPR基因單核苷酸多態(tài)與背膘厚和肌內(nèi)脂肪是顯著相關(guān)的(G.Muz et al，J.Anim.Sci.，2009，87459-468；Cristina

et al.，Genet.Sel.Evol.，2002，34465-479)。Lpin1，Lpin2和Lpin3是與脂肪代謝相關(guān)的三個(gè)基因，屬于一個(gè)基因家族，豬上分別位于3q21-27，6q24-(1/2)q31和17(1/2)q21-q23，PCR-RFLP表明Lpin1基因第二外顯子的C93T單核苷酸突變與板油率和肌內(nèi)脂肪這兩個(gè)胴體性狀相關(guān)(Bang Liuet al，Investigation of Lpin1as a candidate gene for fat deposition in pigs.Mol.Biol.Rep，2009，361175-1180；Bang Liu et al，Molecular characterization，chromosomal localization andassociation analysis with back-fat thickness of porcine LPIN2and LPIN3.Mol.Biol.Rep.，2008Nov 7，DOI 10.1007/s11033-008-9385-2)。原發(fā)性心肌癥相關(guān)蛋白1和4(cardiomyopathy-associated 1and1，CMYA1和CMYA4)基因定位于豬SSC13和SSC12分別SW344與SW62微衛(wèi)星標(biāo)記緊密相連的區(qū)域。CMYA1基因編碼區(qū)一個(gè)同義突變c.1053C＞T和三個(gè)錯(cuò)義突變c.1394A＞G(p.His 465Arg)，c.1751A＞G(p.Asp582Gly)和c.3290C＞A(p.Thr1097Asp)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明與不同背膘后存在顯著相關(guān)；CMYA4基因第十五內(nèi)含子上A558G單核苷酸突變產(chǎn)生一個(gè)MspI酶切位點(diǎn)，性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果與六七肋骨背膘厚和肩膘厚存在顯著相關(guān)(BangLiu et al，Molecular characterization，expression and association analysis of the porcine CMYA4gene with carcass traits.J.Anim.Breed Genet.，2008Aug，125(4)234-239；Bang Liu et al.，Porcineskeletal muscle differentially expressed gene CMYA1isolation，characterization，mapping，expression and association analysis with carcass traits.Anim.Genet.，2009Jun，40(3)255-261)。
WFIKKN2(又名growth and differentiation factor-associated serum proein-1，Gasp1)基因編碼蛋白是通過(guò)親和純化和質(zhì)譜的方法在正常的老鼠和人的血清中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與內(nèi)源肌肉生長(zhǎng)抑制素(Myostatin)相關(guān)的蛋白，在鼠的骨骼肌和心臟中表達(dá)最高，在肝臟和腎臟中表達(dá)相對(duì)較低，在腦、脾、肺、睪丸等組織也有表達(dá)，該基因編碼的蛋白具有5個(gè)保守蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域，能通過(guò)抑制對(duì)堿性蛋白酶活性來(lái)阻止Myostatin的加工，使Myostatin處于失活的前體狀態(tài)，而Myostatin是肌肉發(fā)育負(fù)調(diào)控因子。豬中該基因定位在12p11，與微衛(wèi)星SSC8F12(LOD＝9.86，43cR)和SW874(LOD＝6.74，59cR)緊密連鎖，目前已經(jīng)報(bào)道很多豬12號(hào)染色體上與背膘厚，眼肌面積等胴體性狀相關(guān)QTL，根據(jù)位于該區(qū)域的QTL有眼肌面積，肌纖維數(shù)目，肌纖維直徑，胸腰椎間背膘厚，脂肪比率等與胴體性狀相關(guān)的QTL。由上述資料我們不難發(fā)現(xiàn)WFIKKN2基因在肌肉發(fā)育過(guò)程中具有重要作用，因此我們開(kāi)展豬WFIKKN2基因的克隆和SNP篩查、檢測(cè)及與性狀關(guān)聯(lián)分析等相關(guān)工作。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克隆一種作為豬標(biāo)記輔助選擇的與胴體性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，為豬標(biāo)記輔助選擇育種提供有用的分子標(biāo)記。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 從豬WFIKKN2基因片段中克隆得到一種作為豬標(biāo)記輔助選擇的與胴體性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，在序列表的第109bp處有一個(gè)G109-A109的突變，導(dǎo)致Eco72I-RFLP多態(tài)性。
申請(qǐng)人:制備了擴(kuò)增如序列表SEQ ID NO1所述G109-A109的堿基突變的引物對(duì)，該引物對(duì)的DNA序列如下所示 正向引物5′-CTATGAGAAGTGCTGTCCCAACG-3′， 反向引物5′-CAGGGTGATGCCTTTGGAGC-3′。
申請(qǐng)人:設(shè)計(jì)了四對(duì)克隆豬WFIKKN2基因組序列的引物，這四對(duì)引物擴(kuò)增的DNA序列拼接結(jié)果如附圖3所示。
申請(qǐng)人:提供了一種制備上述分子標(biāo)記的方法，它按照以下步驟實(shí)施 用人和鼠WFIKKN2基因mRNA進(jìn)行序列比對(duì)，用獲得的保守序列作為模版，根據(jù)該模版設(shè)計(jì)引物，用成年中國(guó)地方豬“通城豬”血樣提取總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和克隆測(cè)序，進(jìn)行序列分析，獲得如序如圖2所示的cDNA序列和圖3所示的基因組核苷酸序列。
應(yīng)用常規(guī)的PCR-RFLP的方法對(duì)序列SEQ ID NO1所示的第109位堿基突變進(jìn)行了檢測(cè)，并初步進(jìn)行其基因型與豬胴體性狀之間的關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用，為豬的分子標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)新的分子標(biāo)記。
更詳細(xì)的技術(shù)方案參見(jiàn)《具體實(shí)施方式
》。



序列表SEQ ID NO1是本發(fā)明制備的豬基因WFIKKN2與胴體性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的核苷酸序列； 圖1是本發(fā)明的分子標(biāo)記的制備流程圖； 圖2是本發(fā)明中獲得豬WFIKKN2基因用于克隆的CDS片段； 圖3本發(fā)明用于篩查SNP的DNA片段； 圖4本發(fā)明篩查SNP的測(cè)序峰圖； 圖5是本發(fā)明中豬WFIKKN2基因Eco72I-RFLP的三種基因型(GG AG AA)電泳結(jié)果。圖中MarkerDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000ladder)。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1、WFIKKN2基因的克隆 1、引物設(shè)計(jì) 用人(GenBank收錄號(hào)NM_175575.4)和鼠(GenBank收錄號(hào)NM_181819.1)WFIKKN2基因mRNA用DNAstar進(jìn)行兩序列比對(duì)獲得一保守序列，利用獲得保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增WFIKKN2基因第二外顯子序列，該引物對(duì)的DNA序列如下所示 WFIKKN2W2-F15′-AGGGCTCTGAGTGTGACATCTGG-3′ W2-R15′-TCCTTGAGGACGTCACAGGTCTT-3′ 2、PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序 將純化后的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體(購(gòu)自Promega公司)在4℃水浴過(guò)夜連接；無(wú)菌狀態(tài)下取100-120μl感受態(tài)細(xì)胞于1.5ml Ependorff管中，將7μl的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min，42℃熱激90s，后冰浴3-4min，加入450μl無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45min。取100μl涂布于帶有氨芐抗生素平板，37℃平放1h后倒置培養(yǎng)。挑取平板上的單菌落，接種于1ml LB中，37℃220r/min培養(yǎng)過(guò)夜。取1μl菌液PCR擴(kuò)增驗(yàn)證后，用雙脫氧末端終止法在DNA自動(dòng)測(cè)序儀上對(duì)重組質(zhì)粒采進(jìn)行測(cè)序，序列測(cè)定由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。用DNASTAR軟件中的Seqman程序進(jìn)行拼接，得到一條長(zhǎng)度為1357bp的CDs序列。
DNA序列同源性檢索鑒定 通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)軟件，將測(cè)序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的已知生理功能基因進(jìn)行序列同源性比較，以鑒定和獲得該CDs序列的功能信息。檢索結(jié)果表明所測(cè)序列與人WFIKKN2基因mRNA(GenBank收錄號(hào)NM_175575.5)的部分序列同源性達(dá)90％。
3、基因組序列獲得 利用人鼠保守序列和已經(jīng)獲得CDs序列信息，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增得到包含唯一內(nèi)含子和部分第一外顯子的序列，引物對(duì)的DNA序列如下 WFIKKN2W2-F25′-ACGACATGAATCCCAACCTCT-3′ W2-R25′-TGCTTCTCCCAAGTGATCTCT-3′ 將純化后PCR產(chǎn)物進(jìn)行上述克隆測(cè)序以及生物信息學(xué)分析鑒定，再用已經(jīng)獲得基因組序列在NCBI豬記HTG基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，獲得了一條同源性達(dá)98％的未注釋的豬基因組序列(GenBank收錄號(hào)CU929570.2)，將獲得序列，進(jìn)行內(nèi)含子外顯子分析，并找到相應(yīng)讀碼框架。利用該序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物獲得了WFIKKN2基因完整編碼區(qū)(見(jiàn)圖2所示)。相應(yīng)引物對(duì)的DNA序列如下 WFIKKN2W2-F35′-GATACGCCGCCTAAACTGCTTCC-3′ W2-R35′-GGCTTCCAGATTCGCACTCACC-3′ W2-F45′-GATACGCCGCCTAAACTGCTTCC-3′ W2-R45′-GGCTTCCAGATTCGCACTCACC-3′ 實(shí)施例2、WFIKKN2基因SNP的篩查和PCR-RFLP診斷方法的建立 1、SNP的篩查 運(yùn)用W2-F1/W2-R1和W2-F2/W2-R2引物分離豬基因組片段，通過(guò)在不同豬種(包括中國(guó)地方豬種和國(guó)外豬種)的基因組中擴(kuò)增，通過(guò)回收獲得PCR產(chǎn)物pool送北京奧科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在該基因編碼區(qū)(見(jiàn)附圖2)的第342位堿基處有一個(gè)G-A的堿基突變(即與序列表SEQ ID NO的G109-A109的突變相同)，導(dǎo)致Eco72I-RFLP多態(tài)性。測(cè)序結(jié)果如圖4所示。
基因組測(cè)序的引物對(duì)的DNA序列如下 WFIKKN2W2-F15′-AGGGCTCTGAGTGTGACATCTGG-3′/W2-R15′-TCCTTGAGGACGTCACAGGTCTT-3′ W2-F25′-ACGACATGAATCCCAACCTCT-3′/W2-R25′-TGCTTCTCCCAAGTGATCTCT-3′ 2、PCR-RFLP診斷方法的建立 (1)、擴(kuò)增SEQ ID NO1的引物對(duì)的DNA序列如下 WFIKKN2WSNP2-F5′-CTATGAGAAGTGCTGTCCCAACG-3′ WSNP2-R5′-CAGGGTGATGCCTTTGGAGC-3′ (2)、PCR擴(kuò)增條件 PCR反應(yīng)總體積10μl，其中豬基因組DNA約100ng，含1×buffer(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，TaKaRa)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP終濃度為150μmol/L，引物終濃度為0.4μmol/L，0.5U TaqDNA聚合酶(TaKaRa)。PCR擴(kuò)增程序是94℃3min，循環(huán)38次94℃30s，61℃30s，然后72℃15s，最后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。得到289bp特異擴(kuò)增片段，該片段位于第二外顯子內(nèi)(如圖2)。測(cè)序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該289bp片段中存在一個(gè)Eco72I酶切位點(diǎn)(CA↓CGTG)，其中第109bp處為多態(tài)性切點(diǎn)，位于第二外顯子中。
(3)、PCR-RFLP檢測(cè)條件 PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR產(chǎn)物3-5μl，限制性內(nèi)切酶Eco72I為0.1μl(10U)，用H2O補(bǔ)足10μl，將樣品混勻后離心，37℃水浴4h，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，凝膠成像系統(tǒng)中拍照。對(duì)該位點(diǎn)兩個(gè)純合子的測(cè)序結(jié)果顯示，當(dāng)?shù)?09bp位置是A109時(shí)，則該Eco72I酶切位點(diǎn)不存在，Eco72I酶切后檢測(cè)結(jié)果只有1個(gè)片段，長(zhǎng)度是289bp(定為等位基因A)；但存在A109→G109的替換時(shí)，其結(jié)果導(dǎo)致第109bp處一個(gè)Eco72I酶切位點(diǎn)的產(chǎn)生，得到2個(gè)片段，長(zhǎng)度分別為109bp和181bp(定為等位基因G)，三種基因型GG，GA，AA如圖5所述。
(4)、本發(fā)明的分子標(biāo)記在豬肉質(zhì)性狀標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用 試驗(yàn)共檢測(cè)了153個(gè)豬個(gè)體中國(guó)地方豬“通城純種”31頭，外來(lái)豬“大白純種”32頭，“長(zhǎng)白純種”27頭，中國(guó)地方豬與外來(lái)豬的雜交豬“大長(zhǎng)通”(大白×(長(zhǎng)白×通城))31頭、“長(zhǎng)大通”(長(zhǎng)白×(大白×通城))32頭的多態(tài)，確定其基因型，并進(jìn)行基因型與生產(chǎn)性狀(出生至上市平均日增重、胴體直長(zhǎng)、胴體斜長(zhǎng)、腿臀比率、腿臀肉骨率、板油率、皮脂重、失水率、滴水損失、肌肉pH值、肌內(nèi)脂肪含量、肉色、眼肌面積、臀部膘厚)的關(guān)聯(lián)分析。建立如下所述的最小二乘模型 yijk＝μ+Gi+Cj+Pk+Bj+εijk 其中，yijk是性狀觀察值，μ為總體均數(shù)，Gi為基因型效應(yīng)，Cj為品種效應(yīng)，Pk為父本效應(yīng)，Bj為批次效應(yīng)，εijk為隨機(jī)誤差，假定εijk相互獨(dú)立，服從N(0，σ2)分布。基因型檢測(cè)結(jié)果表明在153個(gè)個(gè)體中AA基因型有29個(gè)個(gè)體，AG基因型有70個(gè)個(gè)體，GG基因型有54個(gè)個(gè)體。基因型與性狀關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果是WFIKKN2基因與屠宰率，內(nèi)脂率和眼肌面積呈顯著相關(guān)，見(jiàn)表1。
由表1可知，WFIKKN2基因SNP位點(diǎn)對(duì)屠宰率，內(nèi)脂率和眼肌面積有顯著影響(P＜0.05)，此位點(diǎn)對(duì)其它胴體性狀沒(méi)有顯著影響。
表1WFIKKN2基因Eco72I-RFLP多態(tài)不同基因型與部分肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析
對(duì)屠宰率，內(nèi)脂率和眼肌面積有顯著影響(P＜0.05)的WFIKKN2基因的SNP位點(diǎn)基因型的最小二乘均數(shù)如表2所示。
表2SNP位點(diǎn)(WFIKKN2)基因型滴水損失和失水率的最小二乘均數(shù)
注**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
表2表明，GG基因型個(gè)體的屠宰率，內(nèi)脂率和眼肌面積都顯著高于GA、AA基因個(gè)體的對(duì)應(yīng)值，因此可以看出GG基因型個(gè)體的屠宰率，內(nèi)脂率和眼肌面積較高。
<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>豬WFIKKN2基因作為胴體性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用
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<221>gene
<222>(1)..(289)
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<220>
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<223>
<400>1
ctatgagaag tgctgtccca acgtgtgcgg gaccaagagc tgtgtggcag cccgctacat 60
ggacgtgaag gggaagaagg gccctgtggg catgcccaag gaggccacgt gcgaccactt120
catgtgtctg cagcagggct ccgagtgtga cacctgggat ggccagcccg tgtgcaagtg180
cagagaccgc tgcgagaagg agcccagctt tacctgcgcc tccgacggcc ttacctacta240
taaccgctgc tacatggacg ccgaggcctg ctccaaaggc atcaccctg289
權(quán)利要求
1、豬WFIKKN2基因作為胴體性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO1所述，在序列表SEQ ID NO1的109bp處有1個(gè)G109-A109的堿基突變，導(dǎo)致Eco72I-RFLP的多態(tài)性。
2、檢測(cè)權(quán)利要求1所述堿基突變的引物對(duì)的DNA序列如下所示
正向引物5′-CTATGAGAAGTGCTGTCCCAACG-3′，
反向引物5′-CAGGGTGATGCCTTTGGAGC-3′。
3、權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在豬分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與豬胴體性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的制備及應(yīng)用，所述的豬胴體性狀涉及屠宰率，內(nèi)脂率和眼肌面積相等相關(guān)性狀。本發(fā)明制備的分子標(biāo)記從豬WFIKKN2基因中克隆得到，所述的分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，在序列表SEQ ID NO1的第109bp處有一個(gè)G109-A109的堿基突變，導(dǎo)致Eco72I-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明為豬的標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)新的分子標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101586164SQ20091006266
公開(kāi)日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2009年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月16日
發(fā)明者榜 劉, 玲 孫, 斌 樊, 徐學(xué)文, 梅 余, 趙書(shū)紅, 朱猛進(jìn), 彭中鎮(zhèn) 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)