專利名稱：重組卡介苗rBCG::X的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程疫苗和結(jié)核病疫苗領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明提供了一種新型 的抗結(jié)核桿菌的重組卡介苗，即將結(jié)核桿菌或卡介苗的HspX蛋白的基因(acr，RV2031c)克 隆入卡介苗，在卡介苗中過表達，形成重組卡介苗rBCG: :X。
背景技術(shù)：
結(jié)核病(TB)是嚴重影響全球人類健康的重要公共衛(wèi)生問題之一。最近十幾年 來，TB的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢，每年約200萬人因TB而死亡。我國感染結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)的人數(shù)達到5. 5億，結(jié)核病的患病人數(shù)和死亡人數(shù)均居傳 染病之首?？ń槊缡悄壳敖Y(jié)核病唯一的預(yù)防疫苗，但其保護期短，對成人結(jié)核病保護效果不 穩(wěn)定。盡管卡介苗表達少量的HspX蛋白，但免疫后不能產(chǎn)生針對HspX顯著的細胞免疫應(yīng)答?？ń槊?M.bovis BCG, BCG)是臨床上用于嬰幼兒免疫接種預(yù)防結(jié)核病的唯一疫 苗，是在1921年通過體外反復(fù)傳代培養(yǎng)牛型結(jié)核分枝桿菌(Ebovis)獲得的減毒活疫苗， 目前在全球161個國家和地區(qū)使用，全球每年90%的嬰兒免疫接種。臨床研究證實，卡介苗 具有安全、價廉，以及可預(yù)防嬰幼兒重癥肺結(jié)核等優(yōu)勢；但卡介苗的保護期短，僅5-10年； 卡介苗對成人肺結(jié)核的預(yù)防效果不穩(wěn)定，效果介于0-80%之間；不能阻止體內(nèi)潛伏的細菌 復(fù)發(fā)。因此，研究更為有效的疫苗取代現(xiàn)有的卡介苗是結(jié)核病控制領(lǐng)域重要而且優(yōu)先的研 究方向，其中重組卡介苗的發(fā)展是最為重要和可實踐性最強的研制策略。目前國內(nèi)外研制重組卡介苗的策略主要包括過表達細胞因子，如IL-2、 IL-4、IL-6、IL-10、IL-IU IL-13、IFN- y , GM-CSF 和 TNF-α 等；表達重要免疫優(yōu)勢 抗原，如 Ag85A、Ag85B、38kDa、19kDa、ESAT-6、Ag85B-ESAT-6、ESAT-6-CFP10(或 RDl 區(qū))、Ag85B-MPT64-MTB8.4等；表達溶細胞素；或表達細胞因子與抗原嵌合蛋白，如 IL-2-ESAT-6, Ag85B-ESAT-6-IFN- γ 等。已證實 BCG 表達 Ag85B (rBCG30,美國加州大 學，Horwitz MA, Harth G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect Immun.2003Apr ；71 (4) 1672-9.)禾口 BCG 表 達 溶細胞素(德國柏林馬克思布蘭克傳染病研究所，Live antigen carriers as tools for improved anti-tuberculosis vaccines. Hess J, Kaufmann SH. FEMS Immunol Med Microbiol. 1999Feb ；23 (2) 165-73. Review.)在免疫動物的保護性強于BCG，并分別于 2005年和2007年進入I期臨床實驗。但未見將結(jié)核桿菌或卡介苗的HspX蛋白在卡介苗中 過表達的報道和專利申請。結(jié)核桿菌HspX，又叫熱休克蛋白 Hspl6. 3，Rv2031c，Acr，alpha-crystallin。HspX 是結(jié)核桿菌或卡介苗在正常有氧條件下表達水平極低，甚至難以檢測出；而在結(jié)核桿菌或 卡介苗休眠過程中顯著增加表達的一種蛋白質(zhì)，同時結(jié)核桿菌或卡介苗在此過程中細胞壁的形成增厚，有利于細菌在機體巨噬細胞內(nèi)的寄生和長期潛伏。因此認為HspX蛋白是結(jié)核 桿菌休眠的標志性蛋白之一。HspX蛋白由144個氨基酸組成，分子量16. 3kDa。HspX蛋白 具有非常強的免疫原性，但在新生兒免疫接種卡介苗后，不能產(chǎn)生針對HspX的細胞免疫應(yīng) 答。在慢性患者體內(nèi)HspX蛋白可以刺激機體產(chǎn)生強的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。結(jié)核病 患者的Thl⑶4和⑶8T細胞可以識別HspX蛋白，有效治療后，針對HspX蛋白的細胞免疫 應(yīng)答由ThO向Thl轉(zhuǎn)變。HspX基因免疫小鼠可誘導強的Thl細胞免疫應(yīng)答，且免疫的豚鼠 可提供抗結(jié)核桿菌的感染。因此，HspX蛋白是結(jié)核桿菌重要的T細胞免疫抗原和發(fā)展抗結(jié) 核疫苗的重要靶抗原，也是發(fā)展重組卡介苗抗結(jié)核病重要的靶抗原。但HspX蛋白大量獲取 較為困難，在前期工作中，我們建立了過表達HspX蛋白的大腸桿菌基因工程系統(tǒng)和純化技 術(shù)，并申請國家發(fā)明專利(國家發(fā)明專利申請?zhí)?00710051915. 5)，為本專利疫苗申請奠定 了前期基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種新的重組質(zhì)粒。本發(fā)明的另一個目的是提供一種重組卡介苗rBCG::X。本發(fā)明的又一個目的是提供這種重組卡介苗rBCG: :X的制備方法。實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)方案是本發(fā)明提供的新的重組質(zhì)粒，是將編碼結(jié)核桿菌HspX蛋白的基因克隆入大腸桿 菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)粒的序列中，構(gòu)建成本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒的特征在于 其中編碼HspX蛋白的基因包含自身啟動子序列、編碼序列和調(diào)節(jié)序列，可指導HspX蛋白的 過表達。由于具備HspX自身的啟動子和調(diào)節(jié)序列，因此HspX在卡介苗中的過表達不受大 腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)粒攜帶的啟動子和調(diào)節(jié)序列的影響；同時過表達的這種HspX蛋白 的性質(zhì)和原始卡介苗自身表達的HspX蛋白的性質(zhì)完全一致。編碼HspX蛋白的基因在構(gòu)建 重組質(zhì)粒時插入的方向為不定向。在本項目的一個實施例中，將編碼結(jié)核桿菌HspX蛋白的基因(aCr，Rv2031C)的全 長序列擴增后，插入到大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)粒PMV261中，插入位置為pMV261中的熱 休克蛋白啟動子PHsp60所在之處，即取代了熱休克蛋白啟動子PHsp60。由于該基因取代了 PMV261中的熱休克蛋白啟動子Hsp60，驗證了其可以不定向插入和具有自我啟動子的功能 特征。本發(fā)明的重組質(zhì)粒中HspX基因的基因序列，來源于美國NIH GenBank公開數(shù)據(jù) 庫。通過Blast同源性比較，結(jié)核桿菌HspX蛋白的編碼基因與卡介苗相應(yīng)基因的編碼序列 完全一致。因此，HspX蛋白的編碼基因的來源的策略，可以通過設(shè)計引物，利用PCR技術(shù)從 以下菌株的基因組中擴增獲得，菌種可以是結(jié)核桿菌的不同菌株，如H37Rv，H37Ra，Beijing 株或臨床分離株等，或牛型結(jié)核桿菌和卡介苗的不同菌株。我們自己通過將基因庫中這些 序列進行比對我們自己通過將基因庫中這些序列進行比對，證明了來源于這些菌株的HspX 蛋白的編碼基因是完全相同的。HspX蛋白的編碼基因還可以參照GenBank公開數(shù)據(jù)庫，通 過人工基因合成的方式進行。在本發(fā)明的一個實施例中，是從結(jié)核桿菌H37Rv菌株的基因 組擴增獲得的。本發(fā)明的重組質(zhì)粒制備過程中，所采用的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)?？梢允?br> 4pSMT3，pMV206，pMV261，pMV306*pMV361中的一種，但不限于此。大腸桿菌-分枝桿菌穿梭 質(zhì)粒的作用是攜帶外源的HspX蛋白的編碼基因進入到卡介苗中，進一步利用大腸桿菌-分 枝桿菌穿梭質(zhì)?？稍诳ń槊鐝?fù)制的能力，最終有利于HspX在卡介苗中的過表達。在本項目 的一個實施例中，采用的大腸桿菌_分枝桿菌穿梭質(zhì)粒是PMV261。本發(fā)明提供的抗結(jié)核桿菌的重組卡介苗rBCG: :X，是將上述含有編碼HspX蛋白的 基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于卡介苗，得到重組卡介苗rBCG: :X。本發(fā)明提供的重組卡介苗rBCG: :X的制備方法，包括以下步驟(1).擴增或人工合成編碼HspX蛋白的基因；(2).將編碼HspX蛋白的基因序列插入到大腸桿菌_分枝桿菌穿梭質(zhì)粒的序列中， 構(gòu)建含編碼HspX蛋白的基因的重組大腸桿菌_分枝桿菌穿梭質(zhì)粒；(3).將含有編碼HspX蛋白基因的重組大腸桿菌_分枝桿菌穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入卡介 苗中，即得到重組卡介苗rBCG: :X。上述制備方法中所述的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)?？刹捎玫痪窒抻赑SMT3， pMV206, pMV261, pMV306 或 pMV361。本發(fā)明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的卡介苗的菌株，可以是現(xiàn)用于臨床免疫接種的任何卡介苗 菌株，如卡介苗巴斯德株，卡介苗丹麥株，卡介苗哥本哈根株，卡介苗日本株，卡介苗Tice 株，卡介苗俄羅斯株，等等。本發(fā)明首先將HspX蛋白的全長基因(Rv2031c)克隆，構(gòu)建含編碼HspX蛋白基 因的重組大腸桿菌_分枝桿菌穿梭表達質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化入卡介苗中，形成重組卡介苗 rBCG: :X。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的這種重組卡介苗rBCG: :X實現(xiàn)了 HspX蛋白的過表 達，免疫動物后，重組卡介苗可顯著地誘導機體產(chǎn)生針對HspX蛋白的細胞免疫反應(yīng)，并產(chǎn) 生穩(wěn)定和持久的抗感染保護。用本發(fā)明提供的過表達HspX蛋白的重組卡介苗rBCG::X，免疫C57BL/6小鼠。同 時將卡介苗rBCG: 261 (BCG含空質(zhì)粒pMV261)和PBS分別作為陽性對照和陰性對照。結(jié)果 顯示，新型重組卡介苗rBCG: :X可提供免疫小鼠長期而且穩(wěn)定的抗結(jié)核桿菌感染的保護， 短期和長期的保護型均強于原始的卡介苗。這種增強的保護性經(jīng)證實，是與卡介苗增強了 表達HspX蛋白，以及免疫動物誘導了針對HspX蛋白的細胞免疫應(yīng)答密切相關(guān)。本發(fā)明重組卡介苗rBCG: :X具有以下優(yōu)勢1.安全性不變。與原始卡介苗相比，HspX蛋白也是卡介苗自身表達的蛋白之一， 因而過表達HspX蛋白的重組卡介苗的安全性未發(fā)生改變。2.過表達的HspX蛋白的性質(zhì)不變。HspX蛋白在重組卡介苗的表達策略是通過利 用其自身的啟動子和調(diào)節(jié)序列，從而不需要額外的溫度或其他特殊條件的誘導表達，充分 實現(xiàn)過表達的HspX蛋白與卡介苗自身的HspX蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上的完全一致。3.有利于人體應(yīng)用。HspX蛋白在重組卡介苗的表達策略是通過利用其自身的啟 動子和調(diào)節(jié)序列，從而不需要額外的溫度或其他特殊條件的誘導表達，有利于重組卡介苗 的人體應(yīng)用。4.表達穩(wěn)定性。在有和無卡那霉素抗生素存在的情況下，rBCG: :XB可穩(wěn)定表達 HspX蛋白，見附圖2。5.保護效果強。過表達HspX蛋白的新型的重組卡介苗rBCG: :X的短期和長期的免疫保護型均顯著強于原始卡介苗。


圖1為本發(fā)明的重組質(zhì)粒pMHspX和原始質(zhì)粒pMV261的結(jié)構(gòu)模式圖。圖2為Western blotting檢測重組卡介苗rBCG: :X細胞裂解物中高表達的HspX 蛋白。l，rBCG: :261(BCG 含空載體 pMV261) ；2，rBCG: X(BCG 含重組質(zhì)粒 pMHspX)。Gl 為第 一代培養(yǎng)物；G4為第四代培養(yǎng)物。圖3為免疫C57BL/6小鼠6周(短期)和24周(長期)后，ELISPOT分析分泌抗 原特異的IFN-Y的脾細胞數(shù)量變化。*P<0. 05vs. rBCG: :2610圖4為分別免疫BALB/c和C57BL/6小鼠6周后，尾靜脈感染IO6CFU結(jié)核桿菌4周 后，不同種小鼠肺臟的細菌負荷數(shù)(bacterial loads)。*P < 0. 05vs. rBCG: 261。圖5為分別免疫BALB/c和C57BL/6小鼠6周后，尾靜脈感染IO6CFU結(jié)核桿菌4周 后，不同種小鼠脾臟的細菌負荷數(shù)(bacterial loads)。*P < 0. 05vs. rBCG: 261。圖6為免疫C57BL/6小鼠6周后，尾靜脈感染IO6CFU結(jié)核桿菌4周，10周 和18周后，不同時間點小鼠肺臟的細菌負荷數(shù)(bacterial loads)的變化。rBCG: X vs. rBCG: 261 (3個時間點肺臟細菌數(shù)P < 0. 05)。圖7為免疫C57BL/6小鼠6周后，尾靜脈感染IO6CFU結(jié)核桿菌4周，10周 和18周后，不同時間點小鼠脾臟的細菌負荷數(shù)(bacterial loads)的變化。rBCG: X vs. rBCG: 261 (僅 4 周時間點脾臟 P < 0. 05)。
具體實施例方式實施例1重組質(zhì)粒pMHspX的構(gòu)建和鑒定分子生物學技術(shù)按照常規(guī)進行0. 8kb的HspX (acr，Rv2031c)基因，利用PCR技 術(shù)從結(jié)核桿菌H37Rv的基因組中被擴增。擴增條件分別為95°C 5min，然后94°C 45s, 60°C 45s，72°C 50s, 30個循環(huán)，最后72°C 5min。PCR產(chǎn)物用AxyPrep PCR產(chǎn)物回收試劑盒 (Axygen)回收。用BamHI和XbaI酶切0. 8kb的acr基因后，用AxyPr印DNA凝膠回收試 劑盒(Axygen)回收。然后acr基因與同樣酶切回收的pcDNA3. 1 (-)連接，后亞克隆入大 腸桿菌_分枝桿菌穿梭質(zhì)粒PMV261，形成重組質(zhì)粒pMHspX。進一步酶切鑒定和序列分析， 證明構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒完全正確。測序結(jié)果表明，克隆的acr(RV2031c)基因與美國NIH GenBanK中分別公布的結(jié)核桿菌和牛型結(jié)核桿菌全基因組序列中對應(yīng)的基因的編碼序列完 全一致?？蛰d體PMV261和表達HspX的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭重組質(zhì)粒質(zhì)粒(pMHspX) 的結(jié)構(gòu)模式圖見圖1。實施例2重組卡介苗rBCG: :X的建立重組卡介苗rBCG: :X的制備如下。首先制備卡介苗的感受態(tài)。取對數(shù)生長期的卡 介苗菌株lml，無菌接種于7H9液體培養(yǎng)基50ml中，37°C靜止培養(yǎng)2周。將培養(yǎng)基冰浴2 小時后，4°C離心收集細菌。加Iml 10%冰冷的甘油重懸，用粘磨器將細菌粘磨分散后。后 用原培養(yǎng)體積的1/2，1/10和1/50的體積冰冷的甘油洗滌3次，最后用Iml冰冷的甘油重
6懸，分裝為100 μ 1每管，-80°C保存?zhèn)溆?。其次是卡介苗的電轉(zhuǎn)化。先將100 μ 1的感受態(tài) 卡介苗菌株加入到預(yù)冷的2mm BiO-Rad電穿孔杯中，將純化的重組質(zhì)粒pMHspX (小于5 μ 1) 加入后混勻，冰浴lOmin，去掉杯中氣泡和杯外的水珠，用Bio-Rad電穿孔儀電穿。電穿參 數(shù)為電壓2kv，25 μ F，1000 Ω轉(zhuǎn)化。時間常數(shù)介于15-25ms為優(yōu)。轉(zhuǎn)化完成后，立即將細 菌轉(zhuǎn)移入10ml7H9液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)；次日離心收集細菌，接種于含25 μ g/ ml卡那霉素的7H11固體平板。37°C培養(yǎng)4周后，挑取抗性生長克隆，接種于7H9液體培養(yǎng) 基(含25 μ g/ml卡那霉素)37°C擴大培養(yǎng)4周后，分別離心收集細菌和上清，進行Western Blotting鑒定。抗Rv2031c鼠單克隆抗體來源于Abcam公司(ab64786，Abeam)?；瘜W發(fā)光 法進行顯色。結(jié)果證實細菌裂解液中有分子量約16kDa的蛋白特異性表達，并且重組疫苗 rBCG: :X過表達HspX蛋白的量顯著超過原始卡介苗。見圖2。含有空質(zhì)粒pMV261的重組 卡介苗(rBCG::261)同上制備，并作為實驗對照。實施例3重組卡介苗rBCG: :X的細胞免疫特性分別將IO6CFU重組疫苗rBCG: :X和rBCG: :261免疫C57BL/6小鼠，以PBS作對照。 免疫小鼠后6周和24周，無菌分離免疫小鼠的脾臟淋巴細胞，用ELISP0T技術(shù)檢測脾臟淋 巴細胞抗原特異的IFN-Y細胞的分泌數(shù)?？乖≒PD，Ag85B和HspX蛋白，抗原濃度為 2yg/ml，細胞數(shù)為106。見圖3，重組疫苗rBCG: :X誘導了短期和長期免疫小鼠脾臟淋巴細 胞針對HspX蛋白的特異IFN-Y細胞的分泌數(shù)增加。實施例4重組卡介苗rBCG: :X的短期和長期保護性為了評價鼠系對免疫效果的影響，分別將IO6CFU重組疫苗rBCG: :X和rBCG: :261 免疫BALB/c和C57BL/6小鼠，以PBS作對照。免疫6周后，用IO6CFU結(jié)核桿菌尾靜脈感染 免疫小鼠，4周后，不同種小鼠肺臟和脾臟的細菌負荷數(shù)(bacterial loads)見圖4。重組 疫苗rBCG: :X在兩種小鼠均產(chǎn)生了對脾臟和肺臟的強保護，其增強的保護不受小鼠品系的影響。為了進一步評價重組卡介苗rBCG: :X的短期和長期保護性，分別將IO6CFU重組疫 苗rBCG: :X和rBCG: 261免疫C57BL/6小鼠，以PBS作對照。免疫6周后，用IO6CFU結(jié)核 桿菌尾靜脈感染免疫小鼠，4周，10周和18周后，小鼠肺臟和脾臟的細菌負荷數(shù)(bacterial loads)見圖5。重組卡介苗rBCG: :X對免疫的小鼠肺臟和脾臟的短期保護性同上，并提供 了對肺臟的長期保護性。
權(quán)利要求
一種重組質(zhì)粒，其特征在于，它是將編碼HspX蛋白的基因序列插入到大腸桿菌 分枝桿菌穿梭質(zhì)粒的序列中構(gòu)成的重組質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，編碼HspX蛋白的基因(又叫 Rv2031c, Acr, Hspl6. 3，alpha-crystal 1 in)可來源于結(jié)核桿菌的不同菌株或卡介苗菌株， 或通過人工合成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，編碼HspX蛋白的基因包含HspX自身 啟動子序列、編碼序列和調(diào)節(jié)序列，可指導HspX蛋白的過表達。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所采用的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì) ?？梢允荘SMT3，pMV206, pMV261, pMV306和pMV361中的一種，但不限于此。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，它是將編碼HspX蛋白的基因序列插 入到大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)粒PMV261中，取代pMV261中的熱休克蛋白啟動子Hsp60 構(gòu)成的重組質(zhì)粒。
6.一種抗結(jié)核桿菌的重組卡介苗rBCG: :X，其特征在于，將權(quán)利要求1至5中任一響所 述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入卡介苗，得到重組卡介苗rBCG: :X。
7.一種重組卡介苗rBCG: :X的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1).擴增或人工合成編碼HspX蛋白的基因；(2).將編碼HspX蛋白的基因序列插入到大腸桿菌_分枝桿菌穿梭質(zhì)粒的序列中，構(gòu)建 含編碼HspX蛋白的基因的重組大腸桿菌_分枝桿菌穿梭質(zhì)粒；(3).將含有編碼HspX蛋白基因的重組大腸桿菌_分枝桿菌穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入卡介苗中， 即得到重組卡介苗rBCG: :X。
8.—種如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì) ?？刹捎玫痪窒抻?pSMT3，pMV206, pMV261, pMV306 或 pMV361。
9.一種如權(quán)利要求6所述的重組卡介苗的制備方法，其特征在于，該方法中使用的卡 介苗可采用現(xiàn)用于臨床免疫接種的任何卡介苗菌株。
10.一種如權(quán)利要求6所述的重組卡介苗的制備方法，其特征在于，該方法中使用的 卡介苗可采用卡介苗巴斯德株、卡介苗丹麥株、卡介苗哥本哈根株、卡介苗日本株、卡介苗 Tice株或卡介苗俄羅斯株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗結(jié)核桿菌的重組卡介苗，它是將含有編碼HspX蛋白基因的重組大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入卡介苗中形成的重組卡介苗rBCG::X。該重組卡介苗rBCG::X實現(xiàn)了HspX蛋白的過表達，免疫動物后，可顯著地誘導機體產(chǎn)生針對HspX蛋白的細胞免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生穩(wěn)定和持久的抗感染保護，克服了現(xiàn)有卡介苗保護期短和對成人結(jié)核病保護效果不穩(wěn)定等不足。
文檔編號C12R1/19GK101921801SQ20091006245
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月9日
發(fā)明者付瑞玲, 盧佳, 周志廣, 方正明, 王春, 石春薇, 范雄林, 陳振華, 陳玲霞 申請人:華中科技大學