專利名稱：一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的鎖式探針及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)，特別是涉及一種基于鎖式探針的滾環(huán)擴(kuò)增與基因芯片相結(jié)合的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
1983 年第一例轉(zhuǎn)基因作物(Genetically Modified Organism,GM0)面世，標(biāo)志著人類利用基因工程技術(shù)改良作物的開始。轉(zhuǎn)基因作物在抗蟲、抗病害、抗除草劑及品質(zhì)改良方面較常規(guī)育種周期更短，更具備優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益，商業(yè)種植面積迅速增加。隨著轉(zhuǎn)基因作物的在全球內(nèi)種植比例不斷升高，其安全性也受到廣泛關(guān)注。各國(guó)都對(duì)轉(zhuǎn)基因作物在環(huán)境安全、對(duì)人體健康影響、標(biāo)簽貼示及知識(shí)產(chǎn)權(quán)方面給予重視。轉(zhuǎn)基因大豆在轉(zhuǎn)基因作物中種植面積最廣，而Round up ready (RRS)在轉(zhuǎn)基因大豆中所占比例最高。國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆Round up ready的檢測(cè)方法都進(jìn)行了大量的研究，主要采用多重PCR，多重實(shí)時(shí)熒光PCR、PCR-基因芯片等檢測(cè)方法。傳統(tǒng)的多重常規(guī)PCR檢測(cè)方法在平臺(tái)擴(kuò)展方法具有一定的局限性，隨著待檢目標(biāo)的增加，需要對(duì)體系中的每套引物的用量及比例重新進(jìn)行優(yōu)化，并且兼顧擴(kuò)增效率等因素，工作量較大。而多重實(shí)時(shí)熒光PCR 雖然在檢測(cè)靈敏度等方面較多重常規(guī)PCR檢測(cè)方法有優(yōu)勢(shì)，但是由于目前儀器自身及熒光染料研制的限制，僅能同時(shí)提供互不干擾的4個(gè)熒光通道，也限制了該技術(shù)在檢測(cè)通量擴(kuò)展。常規(guī)的多套PCR-基因芯片檢測(cè)方法，需要多套引物進(jìn)行擴(kuò)增，操作步驟繁瑣，并不適合大規(guī)模的高通量檢測(cè)。1994年Nilsson在《Science》雜志報(bào)道的Padlock Probe (簡(jiǎn)稱PLP，中文譯名鎖式探針)，給多重檢測(cè)方法提供新的選擇，帶來了革命性的改變(Nilsson et al.，1994)。 鎖式探針是長(zhǎng)約陽(yáng)-130個(gè)堿基的單鏈DNA。PLP主要由5部分組成特異性5’端檢測(cè)區(qū) Tl (5’帶有P04基團(tuán))、通用擴(kuò)增引物P1、通用擴(kuò)增引物P2、特異性標(biāo)簽(Zip)、特異性3’端檢測(cè)區(qū)T2。在滾環(huán)擴(kuò)增中利用一對(duì)通用引物可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多條探針的同時(shí)擴(kuò)增，并且通過固定在基因芯片上的與鎖式探針中Zip標(biāo)簽互補(bǔ)的cZip對(duì)滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交及信號(hào)分析，該方法對(duì)多重目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)只需更換其中的檢測(cè)臂區(qū)和Zip標(biāo)簽，完全避免了多重PCR 檢測(cè)的每條引物濃度比例等優(yōu)化調(diào)節(jié)，并且降低了引物之間的互相競(jìng)爭(zhēng)，使基因芯片檢測(cè)不再受到常規(guī)多重PCR的限制，實(shí)現(xiàn)了真正意義的高通量檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)目前轉(zhuǎn)基因大豆多靶標(biāo)檢測(cè)中存在的問題，提供一種特異性好的鎖式探針。本發(fā)明的另一目的是針對(duì)上述問題，提供一種基于上述鎖式探針的操作簡(jiǎn)便、擴(kuò)展性能好、靈敏、可靠的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了一種用于轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)的鎖式探針，所述探針的序列從5’端到3’端依次包括Tl、PI、P2、Zip、T2區(qū)段，所述Tl和T2為與檢測(cè)目標(biāo)序列匹配的檢測(cè)區(qū)域， Pl和P2為通用引物結(jié)合區(qū)域，Zip為特異性標(biāo)簽，所述Tl含有kq ID No. 1所示序列，T2含有kq ID No. 2所示序列；或者Tl含有kq ID No. 3所示序列，T2含有kq ID No. 4所示序列；或者Tl含有Seq ID No. 5所示序列，T2含有Seq ID No. 6所示序列；或者Tl含有Seq ID No. 7所示序列，T2含有Seq ID No. 8所示序列；Seq ID No.1 :5，-CGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTG-3，Seq ID No. 2 5' -GATAAAGGAAAGGCCAT-3，Seq ID No. 3 5' -TTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAA-3’Seq ID No. 4 :5，-TTCTTAAGATTGAATCCTG-3，Seq ID No. 5 5' -GGCACAAGGGATACAAACCCTTAATCC-3，Seq ID No. 6 5' -TGGCACAAATTAACAACAT-3，Seq ID No. 7 5' -TTTGGGTTCCCTATGTTTATTTTAACCTGTATGTATG-3’Seq ID No. 8 5' -CCACCTTCCTTTTCCA-3‘ 所述鎖式探針的Zip區(qū)段選自kq ID No. 9_12所示序列中的一條序列；Seq ID No. 9 5' -TCGTTGCGCTGCAGTACGCC-3，Seq ID No. 10 :5’ -TGCGTGTAGCACGGCCTCCT-3’Seq ID No. 11 :5’ -TCCGTTAGCGGTCCAGCTCG-3’Seq ID No. 12 :5’ -TATCTCGCTCGCACGGTGGC-3，。所述鎖式探針的Pl含有kq ID No. 13所示序列，P2含有kq ID No. 14所示序列；Seq ID No. 13 :5’ -GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-3，Seq ID No. 14 :5’ -GTCGACCAGACTGTGTATCGT-3，。所述鎖式探針分別含有kq ID No. 15-18中任一所示的序列；Seq ID No. 15 :5，-CGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTG-Seq ID No. 1GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-Seq ID No. 13Seq ID No. 14TCGTTGCGCTGCAGTACGCC-GATAAAGGAAAGGCCAT-3’Seq ID No. 9Seq ID No. 2Seq ID No. 16 :5，-TTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAA-Seq ID No. 3GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-Seq ID No. 13Seq ID No. 14TGCGTGTAGCACGGCCTCCT-TTCTTAAGATTGAATCCTG-3’Seq ID No. 10Seq ID No. 4Seq ID No. 17 :5，-GGCACAAGGGATACAAACCCTTAATCC-Seq ID No. 5GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
Seq ID No. 13Seq ID No. 14TCCGTTAGCGGTCCAGCTCG-TGGCACAAATTAACAACAT-3>Seq ID No. 11Seq ID No. 6Seq ID No. 18 :5，-TTTGGGTTCCCTATGTTTATTTTAACCTGTATGTATG-Seq ID No. 7GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-Seq ID No. 13Seq ID No. 14TATCTCGCTCGCACGGTGGC-CCACCTTCCTTTTCCA-3’。Seq ID No. 12Seq ID No. 8本發(fā)明還公開了一種轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)方法，所述方法包括，采用上述的鎖式探針
以轉(zhuǎn)基因大豆DNA為模板進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。所述方法還包括進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增時(shí)加入內(nèi)控參照鎖式探針進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增；所述內(nèi)控參照鎖式探針Tl含有kq ID No. 19所示序列，T2含有kq ID No. 20所示序列，Zip含有 Seq ID No. 21所示序列；Seq ID No. 19 :5’ -GACGTCTTGGGATTTGGCCAACAATA-3’Seq ID No. 20 :5，-CTATCAGATCCATCAAAAC-3，Seq ID No. 21 :5，-TACGTGCTGTACCGCTCCGG-3，。上述內(nèi)控參照鎖式探針具有kq ID No. 22所示序列；Seq ID No. 22 5' -GACGTCTTGGGATTTGGCCAACAATA-Seq ID No. 19GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-Seq ID No. 13Seq ID No. 14TACGTGCTGTACCGCTCCGG-CTATCAGATCCATCAAAAC-3’Seq ID No. 21Seq ID No. 20所述方法包括采用kq ID No. 15-18所示序列的鎖式探針中的至少一條以及Seq ID No. 22所示序列的內(nèi)控參照鎖式探針以轉(zhuǎn)基因大豆DNA為模板，在同一個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。所述方法還包括以滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，所述基因芯片上設(shè)置有能與所述鎖式探針Zip區(qū)段特異匹配的探針序列。由于采用以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明利用具有特殊結(jié)構(gòu)的鎖式探針，采用一對(duì)通用引物對(duì)多條鎖式探針進(jìn)行同時(shí)滾環(huán)擴(kuò)增，并將多重滾環(huán)擴(kuò)增與基因芯片檢測(cè)方法相結(jié)合，有效的避免了目前轉(zhuǎn)基因大豆多靶標(biāo)檢測(cè)中多重引物PCR擴(kuò)增相互影響的問題，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因大豆內(nèi)源基因Lectin、 外源基因camv35S啟動(dòng)子、Nos終止子、CP4EPSPS基因及Roundup Ready Soybean品系特異性基因(RRS品系基因)等五個(gè)靶標(biāo)序列的同時(shí)檢測(cè)，為轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單、 方便、有效、可靠的高通量檢測(cè)方法，特別適合用于口岸檢驗(yàn)檢疫等部門使用。


圖1為鎖式探針構(gòu)成示意圖2為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1的滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)鎖式探針特異性的結(jié)果圖，圖中泳道M為 DNA Marker DL2000,1-5 為 PLP-Lectin、PLP-35S、PLP-Nos、PLP_CP4 和 PLP-RRSS 對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的擴(kuò)增結(jié)果，泳道 6-10 分別為 PLP-Lectin、PLP-35S、PLP-Nos、PLP-CP4 和 PLP-RRSS 對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆的擴(kuò)增結(jié)果，11為水對(duì)照；圖3為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例2的基因芯片五重靶標(biāo)檢測(cè)結(jié)果圖，圖中A為轉(zhuǎn)基因大豆基因芯片檢測(cè)結(jié)果圖，B為非轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的鎖式探針，及其與基因芯片相結(jié)合的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)方法。本發(fā)明的鎖式探針是長(zhǎng)100-120個(gè)堿基長(zhǎng)度的單鏈DNA，鎖式探針主要由5部分組成特異性5’端檢測(cè)區(qū)Tl (5’帶有磷酸基團(tuán))、通用擴(kuò)增引物結(jié)合區(qū)Pl和P2、特異性標(biāo)簽Zip、特異性3’端檢測(cè)區(qū)T2。特異性檢測(cè)區(qū)的T1、T2通過堿基互補(bǔ)對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行識(shí)別，當(dāng)Tl和Τ2與目標(biāo)DNA完全匹配時(shí)，在連接酶作用下將鎖式探針連接成環(huán)形，未被連接成環(huán)的線性鎖式探針被核酸外切酶降解，然后利用一對(duì)與Pl和Ρ2結(jié)合的通用擴(kuò)增引物對(duì)環(huán)化的鎖式探針進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)上述檢測(cè)原理，本發(fā)明分別針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆通常含有的 camv35S啟動(dòng)子和Nos終止子，以及目前轉(zhuǎn)基因大豆應(yīng)用較廣泛的抗除草劑基因CP4EPSPS 基因和RRS品系基因，設(shè)計(jì)四條檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆外源基因的特異性鎖式探針PLP-35S、 PLP-Nos、PLP-CP4EPS和 PLP-RRS。本發(fā)明用于檢測(cè)Camv35S啟動(dòng)子的鎖式探針PLP-35S含有kq ID No. 15所示序列；Seq ID No. 15 5， -P04-CGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTG-Seq ID No. 1GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-Seq ID No. 13Seq ID No. 14TCGTTGCGCTGCAGTACGCC-GATAAAGGAAAGGCCAT-3’Seq ID No. 9Seq ID No. 2本發(fā)明用于檢測(cè)Nos終止子的鎖式探針PLP-Nos含有kq ID No. 16所示序列；Seq ID No. 16 5， -P04-TTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAA-Seq ID No. 3GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-Seq ID No. 13Seq ID No. 14TGCGTGTAGCACGGCCTCCT-TTCTTAAGATTGAATCCTG-3’Seq ID No. 10Seq ID No. 4本發(fā)明用于檢測(cè)CP4EPSPS基因的鎖式探針PLP-CP4EPS含有kq ID No. 17所示
序列； Seq ID No. 17 0093]5， -P04-GGCACAAGGGATACAAACCCTTAATCC-
0094]Seq ID No. 5
0095]GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
0096]Seq ID No. 13Seq ID No. 14
0097]TCCGTTAGCGGTCCAGCTCG-TGGCACAAATTAACAACAT-3>
0098]Seq ID No. 11Seq ID No. 6
0099]本發(fā)明用于檢測(cè)RRS品系的鎖式探針PLP-RRS含有kq ID No. 18所示序列；
0100]Seq ID No. 18
0101]5， -P04-TTTGGGTTCCCTATGTTTATTTTAACCTGTATGTATG-
0102]Seq ID No. 7
0103]GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
0104]Seq ID No. 13Seq ID No. 14
0105]TATCTCGCTCGCACGGTGGC-CCACCTTCCTTTTCCA-3，。
0106]Seq ID No. 12 Seq ID No.8
0107]為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明還根據(jù)大豆內(nèi)源基因Lectin設(shè)計(jì)了一條內(nèi)控
參照鎖式探針PLP-Lectin，含有kq ID No. 22所示序列Seq ID No. 225' -P04-GACGTCTTGGGATTTGGCCAACAATA-Seq ID No. 19GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-Seq ID No. 13Seq ID No. 14TACGTGCTGTACCGCTCCGG-CTATCAGATCCATCAAAAC-3’Seq ID No. 21Seq ID No. 20利用上述鎖式探針本發(fā)明首先建立了能同時(shí)檢測(cè)大豆內(nèi)源基因和多個(gè)外源轉(zhuǎn)基因的多重滾環(huán)擴(kuò)增。具體方法可以將上述內(nèi)控參照鎖式探針PLP-Lectin和外源基因鎖式探針PLP-35S、PLP-Nos, PLP-CP4EPS、PLP-RRS中的至少一條混合，以轉(zhuǎn)基因大豆DNA為模板，在連接酶的作用下連接成環(huán)狀鎖式探針，經(jīng)過外切酶消化處理后，采用通用引物對(duì)環(huán)狀鎖式探針進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，其中上游通用引物具有^^ ID No. 23所示序列，下游通用引物具有kq ID No. 14所示序列；Seq ID No. 23 :5，-GGACGAGTCTCTATGCCTAAGC-3，。為了進(jìn)一步的實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)序列的同時(shí)檢測(cè)，本發(fā)明優(yōu)選的采用基因芯片對(duì)滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。在鎖式探針設(shè)計(jì)中，每條鎖式探針對(duì)應(yīng)一個(gè)特異性的不重復(fù)的Zip序列，因此可以針對(duì)不同的Zip序列設(shè)計(jì)用于基因芯片的特異性基因芯片檢測(cè)探針，實(shí)現(xiàn)基于鎖式探針的滾環(huán)擴(kuò)增與基因芯片多靶標(biāo)檢測(cè)。其中基因芯片陽(yáng)性定位探針含有^^ ID No. 24所示序列，陰性定位探針含有kq IDNo. 25所示序列，陽(yáng)性定位探針互補(bǔ)鏈含有kq ID No. 26所示序列；Seq ID No. 24 :5，-GGGTGGGATCAATTTGG-3，Seq ID No. 25 :5，-CTGGAACAGCCAGAAGGAC-3，Seq ID No. 26 :5，-CCAAATTGATCCCACCC-3，。
本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)方法，將滾環(huán)擴(kuò)增與基因芯片相結(jié)合，利用滾環(huán)擴(kuò)增能夠?qū)崿F(xiàn)一對(duì)通用引物對(duì)多條環(huán)狀鎖式探針進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增的特點(diǎn)，有效的避免了傳統(tǒng)基因芯片中靶標(biāo)序列擴(kuò)增和檢測(cè)信號(hào)標(biāo)記困難的問題。特別的，鎖式探針的特殊結(jié)構(gòu)，即提供了通用引物結(jié)合區(qū)，又提供了每條探針?biāo)禺惖腪ip區(qū)，特別適用于對(duì)不同靶標(biāo)序列的基因芯片多重檢測(cè)。本發(fā)明中，針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆四個(gè)不同靶標(biāo)序列設(shè)計(jì)特異性鎖式探針，能夠?qū)δ壳皯?yīng)用較廣泛的不同轉(zhuǎn)基因大豆品種進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)鑒定，并且設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)中常用的內(nèi)源基因Lectin作為參照，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。下面通過具體實(shí)驗(yàn)例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實(shí)驗(yàn)例僅僅對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)驗(yàn)例1 鎖式探針特異性檢測(cè)一、材料和儀器Round up ready轉(zhuǎn)基因大豆及非轉(zhuǎn)基因大豆由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植中心提供，dNTPs Mixture、DNA Marker DL2000 購(gòu)自大連 TaKaRa 公司。Taq DNA Ligase, Exonuclease III、Exonuclease I、Bst DNA polymerase large fragment購(gòu)自 New England Biolabs。Biometra Grident PCR儀和Syngene凝膠成像系統(tǒng)均由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植中心提供。二、實(shí)驗(yàn)方法1、引物和鎖式探針探針設(shè)計(jì)根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)所使用的引物擴(kuò)增區(qū)域的序列，分別設(shè)計(jì)針對(duì)大豆內(nèi)源基因Lectin、外源基因35S啟動(dòng)子、Nos終止子、CP4EPSPS基因及RRS品系的相應(yīng)鎖式探針。所設(shè)計(jì)的鎖式探針包含五個(gè)組成部分，依次為Tl、Pl、P2、Zip、T2(圖1)，鎖式探針設(shè)計(jì)原則主要采用“不對(duì)稱設(shè)計(jì)原則”，即位于鎖式探針5’端檢測(cè)臂Tl長(zhǎng)度為25-35個(gè)堿基長(zhǎng)度，Tm值60-70°C ；3，端的檢測(cè)臂T2長(zhǎng)度為14-20個(gè)堿基長(zhǎng)度，Tm值40_50°C。采用該設(shè)計(jì)方法，通過65°C連接過程中T2區(qū)的不穩(wěn)定性增加連接反應(yīng)的特異性，同時(shí)也使整個(gè)鎖式探針的長(zhǎng)度縮短，增加了合成的質(zhì)量。本方法中所使用的基礎(chǔ)Zip標(biāo)簽和通用引物由章桂明提供，其中Zip標(biāo)簽由DNAMAN v6. O軟件隨機(jī)生成的20堿基長(zhǎng)度的序列，Tm值控制在65°C 士3°C，并通過NCBI的Blastn軟件進(jìn)行比對(duì)，選擇與轉(zhuǎn)基因大豆DNA同源性極低的序列。鎖式探針由IDT公司或TaKaRa公司合成(表1)。表1鎖式探針序列
權(quán)利要求
1.一種用于轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)的鎖式探針，所述探針的序列從5’端到3’端依次包括Tl、 PU P2、Zip、T2區(qū)段，所述Tl和T2為與檢測(cè)目標(biāo)序列匹配的檢測(cè)區(qū)域，Pl和P2為通用引物結(jié)合區(qū)域，Zip為特異性標(biāo)簽，其特征在于所述Tl含有kq ID No. 1所示序列，T2含有kq ID No. 2所示序列；或者Tl含有kq ID No. 3所示序列，T2含有kq ID No. 4所示序列；或者Tl含有kq ID No. 5所示序列，T2含有kq ID No. 6所示序列；或者Tl含有kq ID No. 7所示序列，T2含有kq ID No. 8所示序列；Seq ID No.1 :5’ -CGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTG-3’Seq ID No. 2 :5’ -GATAAAGGAAAGGCCAT-3，Seq ID No. 3 :5’ -TTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAA-3’Seq ID No. 4 :5，-TTCTTAAGATTGAATCCTG-3‘Seq ID No. 5 :5’ -GGCACAAGGGATACAAACCCTTAATCC-3，Seq ID No. 6 :5’ -TGGCACAAATTAACAACAT-3，Seq ID No. 7 :5，-TTTGGGTTCCCTATGTTTATTTTAACCTGTATGTATG-3，Seq ID No. 8 :5，-CCACCTTCCTTTTCCA-3‘
2.如權(quán)利要求1所述鎖式探針，其特征在于所述鎖式探針的Zip區(qū)段選自kqID No. 9-12所示序列中的一條序列；Seq ID No. 9 :5’ -TCGTTGCGCTGCAGTACGCC-3， Seq ID No. 10 :5，-TGCGTGTAGCACGGCCTCCT-3’ Seq ID No. 11 :5，-TCCGTTAGCGGTCCAGCTCG-3’ Seq ID No. 12 :5，-TATCTCGCTCGCACGGTGGC—3，。
3.如權(quán)利要求1或2所述鎖式探針，其特征在于所述鎖式探針的Pl含有％(1ID No. 13所示序列，P2含有kq ID No. 14所示序列；Seq ID No. 13 :5’ -GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-3， Seq ID No. 14 :5，-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-3，。
4.如權(quán)利要求1所述鎖式探針，其特征在于所述鎖式探針分別含有^^IDNo. 15-18 中任一所示的序列；Seq ID No. 15 ·5， -CGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTG-Seq ID No. 1GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGTSeq ID No. 13Seq ID No. 14TCGTTGCGCTGCAGTACGCC-GATAAAGGAAAGGCCAT-3Seq ID No. 9Seq ID No. 2Seq ID No. 16 5， -TTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAA-Seq ID No. 3GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGTSeq ID No. 13Seq ID No. 14TGCGTGTAGCACGGCCTCCT-TTCTTAAGATTGAATCCTG-3，Seq ID No. 10Seq ID No. 4Seq ID No. 17 5， -GGCACAAGGGATACAAACCCTTAATCC-Seq ID No. 5GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-Seq ID No. 13Seq ID No. 14TCCGTTAGCGGTCCAGCTCG-TGGCACAAATTAACAACAT-3，Seq ID No. 11Seq ID No. 6Seq ID No. 18 5，-TTTGGGTTCCCTATGTTTATTTTAACCTGTATGTATG-Seq ID No. 7GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-Seq ID No. 13Seq ID No. 14TATCTCGCTCGCACGGTGGC-CCACCTTCCTTTTCCA-3，。 Seq ID No. 12 Seq ID No. 8
5.一種轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)方法，所述方法包括，采用權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的鎖式探針以轉(zhuǎn)基因大豆DNA為模板進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。
6.如權(quán)利要求5所述方法，其特征在于所述方法還包括進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增時(shí)加入內(nèi)控參照鎖式探針進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增；所述內(nèi)控參照鎖式探針Tl含有kq IDNo. 19所示序列，T2含有 Seq ID No. 20所示序列，Zip含有kq ID No. 21所示序列；Seq ID No.19 :5’ -GACGTCTTGGGATTTGGCCAACAATA-3’ Seq ID No. 20 :5’ -CTATCAGATCCATCAAAAC-3， Seq ID No. 21 :5，-TACGTGCTGTACCGCTCCGG-3，。
7.如權(quán)利要求6所述方法，其特征在于所述內(nèi)控參照鎖式探針具有％(1IDNo. 22所示序列；Seq ID No. 22 5， -GACGTCTTGGGATTTGGCCA ACA ATA-Seq ID No. 19 GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-Seq ID No. 13Seq ID No. 14TACGTGCTGTACCGCTCCGG-CTATCAGATCCATCAAAAC-3，。 Seq ID No. 21Seq ID No. 20
8.如權(quán)利要求7所述方法，其特征在于所述方法包括采用kqID No. 15-18所示序列的鎖式探針中的至少一條以及^^ ID No. 22所示序列的內(nèi)控參照鎖式探針以轉(zhuǎn)基因大豆DNA為模板，在同一個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。
9.如權(quán)利要求5-8所述方法，其特征在于所述方法還包括以滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，所述基因芯片上設(shè)置有能與所述鎖式探針Zip區(qū)段特異匹配的探針序
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因大豆的鎖式探針及檢測(cè)方法，所述鎖式探針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的內(nèi)源基因和多個(gè)外源基因設(shè)計(jì)，能特異性的檢測(cè)出各靶標(biāo)序列；所述檢測(cè)方法將基于鎖式探針的多重滾環(huán)擴(kuò)增與基因芯片相結(jié)合，采用一對(duì)通用引物對(duì)不同的鎖式探針進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，以滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了多個(gè)靶標(biāo)的簡(jiǎn)便、快速、同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明公開的轉(zhuǎn)基因大豆鎖式探針及檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、擴(kuò)展性能好、靈敏、可靠，特別適用于口岸檢驗(yàn)檢疫等部門。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102399853SQ20101027720
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日
發(fā)明者向才玉, 程穎慧, 章桂明, 繆建錕 申請(qǐng)人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心