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一種簡便的轉(zhuǎn)基因大豆檢測試劑盒及檢測方法

文檔序號:565808閱讀:206來源:國知局
專利名稱:一種簡便的轉(zhuǎn)基因大豆檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及分子生物學(xué),具體的說是一種簡便的轉(zhuǎn)基因大豆檢測試劑 盒及檢測方法。
背景技術(shù)
轉(zhuǎn)基因作物是指利用重組DNA技術(shù)將外源基因整合于受體植物基因 組、改變其遺傳組成后產(chǎn)生的植物及其后代,也稱為遺傳修飾生物體 (Genetically modified organisms, GM0s )。自1983年首例轉(zhuǎn)基因植物
問世以來,全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積和銷售收入均以倍數(shù)增長。但從嚴(yán) 肅的科學(xué)意義上說,轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的生物安全性目前尚無確定的結(jié)論。雖 然我國規(guī)定自2002年3月20日起,所有轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物及其副產(chǎn)品都應(yīng)加 以標(biāo)志,但是在進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆數(shù)量超出國產(chǎn)大豆的形勢下,仍然很少見 到加注轉(zhuǎn)基因字樣的農(nóng)產(chǎn)品。因此開發(fā)簡便的轉(zhuǎn)基因大豆檢測技術(shù)并對相 關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行檢測勢在必行。
目前普遍應(yīng)用基于DNA的檢測技術(shù)對轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行檢測。該類技術(shù) 主要包括傳統(tǒng)定性PCR和定量PCR。這些檢測技術(shù)都需要特殊的顧A擴增儀 (PCR儀)才能夠完成。而環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增技術(shù)(Loop—Mediated 〖sothermal Amplification LAMP)依賴于能夠識別耙序列上6個特異區(qū) 域的引物和一種具有鏈置換特性的DM聚合酶,在等溫條件下可高效、快 速、高特異地擴增靶序列,因此不需要PCR儀。由此建立基于LAMP擴增技 術(shù)的轉(zhuǎn)基因大豆檢測方法并開發(fā)了相應(yīng)的檢測試劑盒,具有廣闊的應(yīng)用前

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種簡便的轉(zhuǎn)基因大豆檢測試劑盒及檢測方法。 為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
轉(zhuǎn)基因大豆檢測試劑盒包括LAMP反應(yīng)緩沖液2. 5|il,內(nèi)引物FIP(濃 度為lOyraol/L)和BIP(濃度為10jumol/L)各2|il、外側(cè)引物F3(濃度為 10pmol/L)和B3(濃度為10jjiiio1/L)各0.3^1、甜菜堿(濃度為 5raol/L) 1. O(il、 dNTPs (濃度為10mmol/L)各2 ju 1 、純水12. 7^1, MgS04溶 液(濃度為20miiiol/L)2. 5ul; Bs t DNA聚合酶(濃度為8U/uL) 1. O(il,轉(zhuǎn)基因 大豆陽性對照DM溶液(濃度為3|ig/jul) 1^1,熒光染料SYBR GREEN I (100 x電泳用染料)2. 5^1;其中內(nèi)引物FIP和BIP分別為FIP: CGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGTTTTCTACAGCCTGCATGCTTCAC 和 BIP : CGATCTCCCACCGGTCCTTCATTTTCGTCCTCGCCTTCCAGAA;外側(cè)引物F3和B3分別 為F3: CCTTTAGCA丁TTCAGCATCAGTG和B3: CATGGCCTTGCCCGTATT。所述每升LAMP檢測反應(yīng)緩沖液中含有20mmol Tris-HCI, lOn腦l KCI, lOmmoi (NH丄SO,, 2mmolMgS04和質(zhì)量體積比0. 1%的Tri ton X-100。
轉(zhuǎn)基因大豆檢測方法將待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板l)il混合在LAMP反 應(yīng)緩沖液2. 5|il,內(nèi)引物FIP(濃度為10 ju mol/L)和bip(濃度為10 m mol/L) 各2pl、外側(cè)引物F3(濃度為10nmol/L)和B3(濃度為10 ja raol/L)各0. 3^1、 甜菜堿(濃度為5mol/L)l. O)nl、 dNTPs(濃度為10隱ol/L)各2 ju 1 、純水 12. 7pl和MgS04溶液(濃度為20mmol/L)2. 5ul中于95-98。C加熱5 -lOmin, 然后迅速置于冰浴中,禽心混合后,加入Bst DNA聚合酶(濃度為 8U/uL)l. 0|il在于65。C保溫45-60 niin,最后在80-85。C加熱10-15min終 止反應(yīng),反應(yīng)物經(jīng)過電泳檢測顯示特征性條帶,證明所檢測的原料中含有 轉(zhuǎn)基因大豆;其中內(nèi)引物 FIP和BIP分別為 FIP : CGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGTTTTCTACAGCCTGCATGCTTCAC 和 BIP : CGATCTCCCACCGGTCCTTCATTTTCGTCCTCGCCTTCCAGAA;外側(cè)引物F3和B3分別 為F3: CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTG和B3: CATGGCCTTGCCCGTATT。
將上述經(jīng)過電泳檢測顯示特征性條帶加入熒光染料SYBR GREEN I ( 100 x電泳用染料)2. 5)il后若反應(yīng)液顯示綠色熒光顏色變化,證明所檢測的原 料中含有轉(zhuǎn)基因大豆。所述每升LAMP檢測反應(yīng)緩沖液中含有20mmo1 Tris-HCI, 10n腦l KCI, lOi細(xì)ol (肌)2S04, 2mmolMgS04和質(zhì)量體積比0.1% 的Triton X-100。
所述待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板的提取稱取0. 8-1. 2g純的轉(zhuǎn)基因大豆 粉末,將粉末中加入3.2-4. 8ml預(yù)冷4-6t:的提取緩沖液,其中提取緩沖 液每升含有46. 75g N aCI, 50 mL 1 mol/L Tris-HCl (pH 8. 0) , 20 mL 0. 5 mol/L EDTA (pH 8. 0),混勻'后,再加入4_6ml 60-65。C預(yù)熱60-65。C的CTAB 提取緩沖液,其中CTAB提取緩沖液每升含有46. 75g NaCI, 20g溴代十六 烷基三甲胺(CTAB) , 50 mL 1 mol/L Tris-HCI (pH 8. 0) , 20 mL 0. 5 mol/L EDTA (pH8. 0),而后在60-65 。C溫育30-90min,待冷卻后加入3. 6-5. 4ml
氯仿、異戊醇、和乙醇的混合液混勻,置于室溫放置待分層后,以 10000-13000rpm離心8-10min,上清液中加入4-6ml酚氯仿混合液混勻, 置于室溫放置待分層后,以10000-13000rpm離心8-10min取上清液;在上 清液中加入所分離上清夜2/3-1體積的預(yù)冷異丙醇混勻,于-28—-2(TC 放置20-30min,在以10000-13000g離心10-20min,所得沉淀即為待測純 的轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板。所述異戊醇、乙醇和氯仿的混合液含量分別為氯 仿75-77%,異戊醇3-5%,乙醇18-22%混合;所述酚氯仿按含量分別為酚 40 - 60 %,氯仿60 - 40 %混合。所得待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板在體積比 70%-75%乙醇中洗1-2次,待DNA濕度在30-50 %時溶于400-600 n 1含有 RM酶的超純水中,待用。所述待測轉(zhuǎn)基因大豆謹(jǐn)A提取液為純的轉(zhuǎn)基因大 豆可將其稀釋到l-10-"倍,.稀釋后的提取液均可進(jìn)行檢測。所述超純水為 經(jīng)過2次蒸餾的雙蒸水;j^述超純水中含0. lmg/mlRNA酶。本發(fā)明所具有的優(yōu)點本發(fā)明設(shè)計4條引物對靶序列的6個特異序列 區(qū)的識別,保證了 LAMP擴增的高度特異性。即LAMP能從僅相差1個核苷 酸的基因標(biāo)本中,找出相應(yīng)的靶序列進(jìn)行擴增。并且本發(fā)明在等溫條件下 擴增,不會因溫度改變而造成時間的損失,而且受非靶序列的影響小。同 時耗時短,在lh內(nèi)可將耙序列擴增至109倍。


圖1為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因大豆的LAMP擴增圖。(其中A: LAMP擴增的電泳 檢測;B:反應(yīng)管中加入熒光染料SYBR GREEN I后的顯色反應(yīng);M:分子量 標(biāo)準(zhǔn);1,非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?-16,轉(zhuǎn)基因大豆DNA提取液倍比稀釋后擴增 結(jié)果(1, 1(T1—10-14))'
具體實施例方式
實施例1
試劑盒包括LAMP反應(yīng)緩沖液2. 5^1,內(nèi)引物為濃度10|jmol/L的FIP 和BlP各2pl、外側(cè)引物為濃度lOpmol/L的F3和B3各0. 3)il、濃度為 5moL/L的甜菜堿1. 0^1、濃度為10mmol/L的dNTPs各2 ju 1、純水12. 7j_il, 濃度為20mniol/L的MgS04溶液2, 5ul;濃度為8U/uL的Bst DNA聚合酶
1. O)jl,濃度為3pg/|a 1的轉(zhuǎn)基因大豆陽性對照DNA溶液l^U,熒光染料SY1BR GREEN I (lOOx電泳用染料)2.5^1。
其中內(nèi)引物 FIP 和 BIP 分別為 FIP : CGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGTTTTCTACAGCCTGCATGCTTCAC 和 BIP : CGATCTCCCACCGGTCCTTCATTTTCGTCCTCGCCTTCCAGAA;外側(cè)引物F3和B3分別 為F3: CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTG和B3: CATGGCCTTGCCCGTATT。
所述每升LAMP檢測反應(yīng)緩沖液中含有20miuo1 Tris-〖ICI, 10m歸]KCI, lOi細(xì)ol (N1"2S04, 2隱olMg.SO4,質(zhì)量體積比0. 1% Triton X-100。
檢測方法將待測轉(zhuǎn)^因大豆顧A模板l)til混合在LAMP反應(yīng)緩沖液
2. 5)dl,濃度為10pmol/L的內(nèi)引物為FIP和BIP各2pl、濃度為lOjumol/L 的外側(cè)引物F3和B3各0. 3|al、濃度為5mol/L的甜菜堿1. 0|il、濃度為 lOmraol/L的dNTPs各2 ja 1、 ^水12. 7|nl和濃度為20mmol/L的MgS04溶液 2. 5ul中于95。C加熱5min,然后迅速置于冰洛中,2000rpm離心20s后, 加入濃度為8U/uL的Bst DNA聚合酶1. 0^1在于65。C保溫45 min,最后在 8(TC加熱10min終止反應(yīng),反應(yīng)物經(jīng)過電泳檢測顯示特征性條帶,將上述 經(jīng)過電泳檢測顯示特征性條帶加入熒光染料SYBR GREEN I ( 100 x電泳用染 料)2. 5^1后若反應(yīng)液顯示綠色熒光顏色變化,證明所檢測的原料中含有轉(zhuǎn) 基因大豆。(參見圖1)。
其中內(nèi)引物 FIP 和 BIP 分別為 FIP : CGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGTTTTCTACAGCCTGCATGCTTCAC 和 BIP : CGATCTCCCACCGGTCCTTCATTTTCGTCCTCGCCTTCCAGAA;外側(cè)引物F3和B3分別 為F3: CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTG和B3: CATGGCCTTGCCCGTATT。所述每升LAMP檢測反應(yīng)緩沖液中含有2Omnio 1 Tr i s-HCI, 1 Ommo 1 KCI , 1 Ommo 1 (NH4)2S04, 2lnmolMgS0,和質(zhì)量體積比0. 1%的Triton X-100。
結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因大豆樣本LAMP檢測結(jié)果均顯示陽性,電泳顯示很亮的 彌散狀條帶,而且反應(yīng)管中加入SYBR GREEN I后顯示綠色熒光。將轉(zhuǎn)基因 大豆的DNA提取液進(jìn)行倍比稀釋后在進(jìn)行檢測,通過本發(fā)明的方法可以成 功檢測出稀釋13倍后的轉(zhuǎn)基因大豆DNA提取液,由此可見這是 一種適用于 轉(zhuǎn)基因大豆的簡便靈敏的檢測技術(shù)。
所述待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板的提取稱取lg大豆粉末,將粉末中 加入4ml預(yù)冷4-6'C的提取緩沖液,其中提取緩沖液每升含有46. 75gNaCI, 50 niL 1 mol/L Tris-HC1 (pH 8.0), 20 mL 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0), 混勻后,再加入5ml預(yù)熱6.(TC的CTAB提取緩沖液,其中CTAB提取緩沖液 每升含有46. 75g NaCI, 20g溴代十六烷基三甲胺(CTAB) , 50 mL 1 mol/L Tris-HC1 (pH 8.0), 20 mL 0. 5 moi/L EDTA (pH 8. 0),而后在65。C溫育 30min,待冷卻后加入4. 5ml氯仿、異戊醇、和乙醇的混合液混勻,置于室 溫放置待分層后,以10000rpm離心8min,上清液中加入5ml酚氯仿混合液 混勻,置于室溫放置待分層后,以10000rpni離心8min取上清液;在上清 液中加入所取上清夜的2/3體積預(yù)冷異丙醇混勾,于-2(TC放置20min,在 以1 0000g離心10min,所得沉淀即為待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板。
所述異戊醇、乙醇和氯仿的混合液按體積比為4: 20: 76的比例混合; 所述酚氯仿按體積比為l: l的比例混合。所得待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板在 體積比70°/。的乙醇中洗1次,待DNA濕度在30。/。時,溶于500 nl含有RNA 酶的超純水中,待用。所述超純水為經(jīng)過2次蒸餾的雙蒸水;所述超純水 中含0. lmg/iiilRNA酶。
與、實施例l不同之處在于檢測方法將待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板lpl 混合在LAMP反應(yīng)緩沖液2.,5idl,濃度為10|amol/L的內(nèi)引物為FIP和BIP 各2(al、濃度為10jamol/L的外側(cè)引物F3和B3各0. 3|il、濃度為5mol./L 的甜菜堿1. 0|il、濃度為10mmol/L的dNTPs各2 n 1、純水12. 7^1和濃度 為20mniol/L的MgS04溶液2. 5ui中于98。C加熱10min,然后迅速置于冰浴 + , 5000rpm離心10s后,加入濃度為8U/uL的Bst DNA聚合酶1. 0^1在 于65。C保溫60min,最后在85。C加熱15min終止反應(yīng),反應(yīng)物經(jīng)過電泳檢
測顯示特征性條帶,將上述經(jīng)過電泳檢測顯示特征性條帶加入熒光染料 SYBR GREEN I (]OOx電泳用染料)2.5^1后若反應(yīng)液顯示綠色熒光顏色變
化,證明所檢測的原料中含有轉(zhuǎn)基因大豆。
所述待測轉(zhuǎn)基因大豆顧A模板的提取稱取1. 2g大豆粉末,將粉末 中加入4.8ml預(yù)冷的CTAB提取液I混勻后,加入65。C預(yù)熱的CTAB提取液 II,而后在65。C溫育30min,待冷卻后加入5. 4ml氯仿、異戊醇、和乙醇 的混合液混勻,置于室溫放置待分層后,以13000rpm離心10min,上清液中加入4ml酴氯仿混合液混勻,置于室溫放置待分層后,以10000rpm離心 8min取上清液;在上清液中加入所取上清夜的1體積預(yù)冷異丙醇混勻,于 -28'C放置30min,在以13000g離心20min,所得沉淀即為待測轉(zhuǎn)基因大 豆DNA模板。所得待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板在體積比72"/。乙醇中洗2次,待 DNA濕度在50。/。時溶于400 nl含有RNA酶的超純水中,待用。 實施例3
與實施例l不同之處在于檢測方法將待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板lpl 混合在LAMP反應(yīng)緩沖液2. 5|ul,濃度為10pmol/L的內(nèi)引物為FIP和BIP 各2(il、濃度為10ymol/L的外側(cè)引物F3和B3各0. 3pl、濃度為5mol/L 的甜菜堿1. 0|^1、濃度為10隱ol/L的dNTPs各2 ju 1、純水12. 7卩d和濃度 為20mmol/L的MgS04溶液2. 5ul中于96'C加熱8min,然后迅速置于冰洛 中,4000rpm離心15s后,加入濃度ij 8U/uL的Bst DNA聚合酶1. 0|li1在 于65'C保溫50min,最后在83'C加熱13min終止反應(yīng),反應(yīng)物經(jīng)過電泳檢
測顯示特征性條帶,將上述經(jīng)過電泳檢測顯示特征性條帶加入熒光染料 SYBR GREEN I (100x電泳用染料)2.5^1后若反應(yīng)液顯示綠色熒光顏色變
化,證明所檢測的原料中含有轉(zhuǎn)基因大豆。
所述待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板的提取稱取1.2g大豆粉末,將粉末中 加入4. 8ml預(yù)冷的CTAB提取液I混勻后,加入62。C預(yù)熱的CTAB提取液II, 而后在62r溫育40min,待冷卻后加入4. 5ml氯仿、異戊醇、和乙醇的混 合液混勻,置于室溫放置待分層后,以12000rpm離心9min,上清液中加入 6ml酴氯仿混合液混勾,置于室溫放置待分層后,以12000rpm離心9min取 上清液;在上清液中加入所取上清夜的2/3體積預(yù)冷異丙醇混勻,于-25°C 放置25min,在以12000g離心15min,所得沉淀即為待測轉(zhuǎn)基因大豆DM 模板。所得待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板在體積比75%的乙醇中洗1次,待DNA 濕度在40%時,溶于600)il含有RNA酶的超純水中,待用。
實施例4
與實施例l不同之處在于檢測方法將待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板1^U 混合在LAMP反應(yīng)緩沖液2.'5iil,濃度為10jumol/L的內(nèi)引物為FIP和BIP 各2)ul、濃度為10)imol/L的外側(cè)引物F3和B3各0. 3^1、濃度為5mol/L 的甜菜堿1. O(il、濃度為10隱ol/L的dNTPs各2 ia 1、純水12. 7^1和濃度 為20mmol/L的MgS04溶液2. 5ul中于97'C加熱5min,然后迅速置于冰洛 中,3000rpni離心16s后,加入濃度為8U八iL的Bst DNA聚合酶1. Opl在 于65。C保溫55min,最后在82'C加熱14min終止反應(yīng),反應(yīng)物經(jīng)過電泳檢 測顯示特征性條帶,將上述經(jīng)過電泳檢測顯示特征性條帶加入熒光染料 SYBR GREEN I (100x電泳用染料)2. 5^1后若反應(yīng)液顯示綠色熒光顏色變
所述待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA模t反的提取稱取0. 9g大豆粉末,將粉末 中加入3.6ml預(yù)冷的CTAB提取液I混勻后,加入64°C預(yù)熱的CTAB提取液II,而后在6fC溫育50min,待冷卻后加入5ml氯仿、異戊醇、和乙醇的 混合液混勻,置于室溫放置待分層后,以12000rpm離心9min,上清液中加 入5ml酚氯仿混合液混勻,置于室溫放置待分層后,以12000rpm離心9min 取上清液;在上清液中加入所取上清夜的2/3體積預(yù)冷異丙醇混勻,于-2^C放置"min,在以12000g離心15min,所得沉淀即為待測轉(zhuǎn)基因大豆 DNA模板。所得待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板在體積比73%的乙醇中洗1次,待 DNA濕度在35。/。時,溶于550 y 1含有RNA酶的超純水中,待用。
權(quán)利要求
1.一種簡便的轉(zhuǎn)基因大豆檢測試劑盒,包括引物、緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和對照,其特征在于包括LAMP反應(yīng)緩沖液2.5μl,內(nèi)引物FIP和BIP各2μl、外側(cè)引物F3和B3各0.3μl,甜菜堿1.0μl,MgSO4溶液2.5ul,熒光染料I2.5μl;其中內(nèi)引物FIP和BIP分別為FIPCGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGTTTTCTACAGCCTGCATGCTTCAC和BIPCGATCTCCCACCGGTCCTTCATTTTCGTCCTCGCCTTCCAGAA;外側(cè)引物F3和B3分別為F3CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTG和B3CATGGCCTTGCCCGTATT。
2. 按權(quán)利要求1簡便的轉(zhuǎn)基因大豆檢測試劑盒,其特征在于還包括 dNTPs各2pl,純水12.7p1, Bst DNA聚合酶1. O)iil,轉(zhuǎn)基因大豆陽性對 照DNA溶液lfil,SYBR GREEN熒光染料12. 5|ll1。
3. 按權(quán)利要求1簡便的轉(zhuǎn)基因大豆檢測試劑盒,其特征在于所述每 升.LAMP檢測反應(yīng)緩沖液中含有20mmol Tris-HCI, 10i腸l KCI, lOmniol W)2S04, 2隱olMgSO4和質(zhì)量體積比0. 1%的Triton X-100。
4. 一種按權(quán)利要求1所述的簡便的轉(zhuǎn)基因大豆檢測方法,其特征在于 將待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板lpl混合在LAMP反應(yīng)緩沖液2. 5^1,內(nèi)引物FIP 和BIP各2pil 、外側(cè)引物F3和B3各0. 3jil 、甜菜堿1. O^il 、 dNTPs各2 ja 1 、 純水12. 7^1和MgS04溶液2. 5ul中于95-98。C加熱5 -lOmin,然后迅速置 于冰洛中,2000 - 5000rpm離心10-20s后,加入Bst DNA聚合酶1. O)til 在于65。C保溫45-60 min,'最后在80-85。C加熱10:15min終止反應(yīng),反應(yīng)其中內(nèi)引物 FIP 和 BIP 分別為 FIP : CGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGTTTTCTACAGCCTGCATGCTTCAC 和 BIP : CGATCTCCCACCGGTCCTTCATTTTCGTCCTCGCCTTCCAGAA;外側(cè)引物F3和B3分別 為F3: CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTG和B3: CATGGCCTTGCCCGTATT。
5. 按權(quán)利要求4所述的簡便的轉(zhuǎn)基因大豆檢測方法,其特征在于將 上述經(jīng)過電泳檢測顯示特征性條帶加入熒光染料SYBR GREEN I 2. 5卩i1后若反應(yīng)液顯示綠色熒光顏色變化,證明所檢測的原料中含有轉(zhuǎn)基因大豆。
6. 按權(quán)利要求4所述的簡便的轉(zhuǎn)基因大豆檢測方法,其特征在于所 述每升LAMP檢測反應(yīng)緩沖液中含有2 Ommo 1 Tr i s -HC1, 1 Onimo 1 KCI , 1 Ommo 1 (NH丄SO,, 2mmolMgS04和質(zhì)量體積比0. 1%的Triton X-100。
7. 按權(quán)利要求4所述的簡便的轉(zhuǎn)基因大豆檢測方法,其特征在于所 述待測轉(zhuǎn)基因大豆,A模板的提取稱取0. 8-1. 2g純的轉(zhuǎn)基因大豆粉末, 將粉末中加入3. 2-4. 8ml預(yù)冷的提取緩沖液,混勻后,再加入4-6nil預(yù)熱 的CTAB提取緩沖液,而'后在60-65 。C溫育30-90min,待冷卻后加入 3. 6-5.4ml氯仿、異戊醇、和乙醇的混合液混勻,置于室溫放置待分層后, 以10000-13000rpm離心8—10min,上清液中加入4-6ml酚氯仿混合液混勻,置于室溫放置待分層后,以10000-13000rpni離心8-10min取上清液;在上 清液中加入所分離上清夜2/3-1體積的預(yù)冷異丙醇混勻,于-28—- 20。C 放置20-30min,在以10000-13000g離心10-20min,所得沉淀即為待測純 的轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板。
8. 按權(quán)利要求7所述的簡便的轉(zhuǎn)基因大豆檢測方法,其特征在于所 得待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA模板在體積比70%-75%乙醇中洗1-2次,待DNA濕 度在30-50 %時溶于400-600 pl含有RNA酶的超純水中,待用。
9. 按權(quán)利要求7所述的簡便的轉(zhuǎn)基因大豆檢測方法,其特征在于所 述待測轉(zhuǎn)基因大豆DNA提取液為純的轉(zhuǎn)基因大豆可將其稀釋到1-10 —13倍,稀釋后的提取液均可進(jìn)行檢測。
10. 按權(quán)利要求7所述的簡便的轉(zhuǎn)基因大豆檢測方法,其特征在于所 述超純水為經(jīng)過2次蒸餾的雙蒸水;所述超純水中含0. lmg/mlRNA酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué),具體地說是一種簡便的轉(zhuǎn)基因大豆檢測試劑盒及檢測方法。包括包括引物、緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和對照,其特征在于包括LAMP反應(yīng)緩沖液2.5μl,內(nèi)引物FIP和BIP各2μl、外側(cè)引物F3和B3各0.3μl,甜菜堿1.0μl,MgSO<sub>4</sub>溶液2.5ul,熒光染料I 2.5μl;檢測為若反應(yīng)液顯示綠色熒光顏色變化,證明所檢測的原料中含有轉(zhuǎn)基因大豆。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因大豆檢測技術(shù)特異性強、靈敏度高,而且操作簡便,不需要特殊的DNA擴增儀。
文檔編號C12Q1/68GK101633951SQ20081013867
公開日2010年1月27日 申請日期2008年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月25日
發(fā)明者梅 劉, 雷 王, 王寶杰, 蔣克勇, 冉 陶 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所
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