適配體磁富集和rca雙信號放大檢測腫瘤細(xì)胞方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】適配體磁富集和RCA雙信號放大檢測腫瘤細(xì)胞方法及應(yīng)用。本發(fā)明公開了一種用于白血病細(xì)胞檢測的探針組及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的用于白血病細(xì)胞檢測的探針組由如下a)和b)組成：a)磁珠捕獲探針；所述磁珠捕獲探針由磁珠和固定于所述磁珠上的捕獲探針組成；所述捕獲探針為序列1所示的單鏈DNA分子；b)檢測探針或所述檢測探針的前體；所述檢測探針的前體由靶序列和磷酸標(biāo)記的鎖式探針組成；所述靶序列為序列2所示的單鏈DNA分子；所述磷酸標(biāo)記的鎖式探針的核苷酸序列為序列3所示的單鏈DNA分子；所述檢測探針是由所述磷酸標(biāo)記的鎖式探針環(huán)化后與所述靶序列結(jié)合而成。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了高特異性和高靈敏的檢測，能從200萬個(gè)正常人外周血細(xì)胞中檢測出100個(gè)白血病細(xì)胞，靈敏度達(dá)到兩萬分之一。
【專利說明】適配體磁富集和RCA雙信號放大檢測腫瘤細(xì)胞方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物材料的臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種適配體磁富集和RCA雙信號 放大檢測腫瘤細(xì)胞方法及應(yīng)用，特別涉及一種用于檢測白血病細(xì)胞的基于磁富集和RCA雙 信號放大的探針組及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病?？寺⌒园籽〖?xì)胞因?yàn)樵鲋呈Э亍⒎?化障礙、凋亡受阻等機(jī)制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤其他組織和器官， 同時(shí)正常造血受抑制。臨床可見不同程度的貧血、出血、感染發(fā)熱以及肝、脾、淋巴結(jié)腫大和 骨骼疼痛。
[0003] 白血病是我國的高發(fā)腫瘤之一，其分型診斷需要聯(lián)合形態(tài)學(xué)、免疫表型、細(xì)胞遺傳 學(xué)和分子生物學(xué)等各種手段。由于細(xì)胞形態(tài)的多樣性，單純依靠形態(tài)學(xué)檢查很難準(zhǔn)確分型； 也未發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞特異性單克隆抗體，白血病作為一種高度異質(zhì)性疾病，抗原表達(dá)有時(shí) 較紊亂，跨系列表達(dá)較為常見，部分白血病相關(guān)抗原在治療過程中或復(fù)發(fā)時(shí)會丟失或發(fā)生 系列轉(zhuǎn)換；利用細(xì)胞遺傳學(xué)（染色體核型和顯帶）與分子生物學(xué)的檢查方法，使診斷的客觀 性和準(zhǔn)確率明顯提高，但只有40%的急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL)有染色體的異常，而且各 種臨床亞型并沒有對應(yīng)特異性染色體異常，另外、這些檢查耗時(shí)、成本高，使之普及性有一 定難度。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于白血病細(xì)胞檢測的探針組。
[0005] 本發(fā)明所提供的用于白血病細(xì)胞檢測的探針組，具體由如下（a)和（b)組成：
[0006] (a)磁珠捕獲探針；
[0007] 所述磁珠捕獲探針由磁珠和固定于所述磁珠上的捕獲探針（適配體）組成；所述 捕獲探針為序列表中序列1所不的單鏈DNA分子；
[0008] (b)檢測探針或所述檢測探針的前體；
[0009] 所述檢測探針的前體由靶序列和磷酸標(biāo)記的鎖式探針組成；所述靶序列為序列表 中序列2所示的單鏈DNA分子；所述磷酸標(biāo)記的鎖式探針的核苷酸序列為序列表中序列3 所不的單鏈DNA分子；
[0010] 所述檢測探針是由環(huán)化的所述磷酸標(biāo)記的鎖式探針與所述靶序列結(jié)合而成。
[0011] 所述檢測探針具體可按照包括如下步驟的方法由所述檢測探針的前體制備得到 的：將所述靶序列和所述磷酸標(biāo)記的鎖式探針按照摩爾比為1 : (2-4)(如1 :3)的比例混 合，95°C孵育 5-10min (如 IOmin)后，加入 DNA 連接酶 15-20°C (如 16°C)孵育 10_16h (如 12h)，得到所述檢測探針。
[0012] 更加具體的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述檢測探針的制備方法如下：（1)將所 述靶序列和所述磷酸標(biāo)記的鎖式探針均用結(jié)合緩沖液（溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：NaCl 8g/L，KCl 0· 2g/L，CaCl2O. 14g/L，Na2HPO4 · H2O 0· lg/L，MgCl2 ·6Η20 I. 42g/L，NaHCO3O. 35g/ L，KH2PO4O. 2g/L，葡萄糖4. 5g/L)配成5 μ M濃度，然后將所得靶序列溶液、磷酸標(biāo)記的鎖式 探針溶液和無菌水按照體積比為1 :3 :6的比例混合，95°C加熱10分鐘，緩慢冷卻至25°C ; ⑵向步驟⑴的體系中加入E. coli DNA連接酶，至其終濃度為0.04υ/μ1，16?孵育12h。
[0013] 所述磁珠捕獲探針具體可按照包括如下步驟的方法制備得到：將經(jīng)生物素標(biāo)記的 所述捕獲探針與經(jīng)鏈霉親和素標(biāo)記的所述磁珠共同孵育，獲得所述磁珠捕獲探針。
[0014] 在本發(fā)明中，所述生物素具體標(biāo)記于所述捕獲探針的3'端。
[0015] 所述方法中，進(jìn)行所述孵育時(shí)，經(jīng)生物素標(biāo)記的所述捕獲探針與經(jīng)鏈霉親和素標(biāo) 記的所述磁珠的配比為75pmol :lmg。
[0016] 進(jìn)一步，所述孵育具體為20-30°C (如25°C )80-150rpm(如IOOrpm)震蕩孵育 10-30(如15min)。所述孵育的液體環(huán)境為結(jié)合緩沖液；所述結(jié)合緩沖液的溶劑為水，溶 質(zhì)及濃度如下：NaCl 8g/L，KCl 0· 2g/L，CaCl2O. 14g/L，Na2HPO4 · H2O 0· lg/L，MgCl2 · 6H20 I. 42g/L，NaHCO3O. 35g/L，KH2PO4O. 2g/L，葡萄糖 4. 5g/L。
[0017] 更加具體的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述磁珠捕獲探針的制備方法包括如下 步驟：分別取濃度為500nM(以DNA計(jì)量）的經(jīng)生物素標(biāo)記的所述捕獲探針的溶液（溶劑 為所述結(jié)合緩沖液）和濃度為l〇mg/ml (以磁珠計(jì)量）的經(jīng)鏈霉親和素標(biāo)記的所述磁珠 溶液（溶劑為所述結(jié)合緩沖液），按照體積比3:2的配比混合，20-30°C (如25°C )80? 150rpm(如IOOrpm)震蕩孵育10-30min(如15min)，即獲得所述磁珠捕獲探針。
[0018] 含有所述探針組的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019] 所述試劑盒中還含有分子信標(biāo)；所述分子信標(biāo)為由一端帶有熒光基團(tuán)，另一端帶 有淬滅基團(tuán)，核苷酸序列為序列表中序列4所示單鏈DAN分子形成的頸環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0020] 在本發(fā)明中，所述分子信標(biāo)的5'端標(biāo)記有熒光基團(tuán)FITC，3'端標(biāo)記有淬滅基團(tuán) DABCYL。
[0021] 所述探針組，或所述試劑盒，在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0022] (a)制備用于白血病細(xì)胞檢測的試劑盒；
[0023] (b)制備用于白血病病情監(jiān)測的試劑盒。
[0024] 在本發(fā)明中，所述白血病細(xì)胞檢測為從待測者的外周全血、骨髓細(xì)胞、白細(xì)胞或淋 巴細(xì)胞中檢測白血病細(xì)胞。
[0025] 在所述應(yīng)用中，進(jìn)行所述白血病病情監(jiān)測時(shí)，采用的待測樣本可為待測者的外周 全血、骨髓細(xì)胞、白細(xì)胞或淋巴細(xì)胞。
[0026] 所述待測者可為白血病患者、健康的正常人、或患有其他疾病（如地中海貧血、骨 髓異常增多癥、或缺鐵性貧血）的非白血病患者。
[0027] 在本發(fā)明中，所述白血病具體為急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL)，如急性T淋巴細(xì)胞白 血?。═-ALL)。
[0028] 前文所述檢測探針或所述檢測探針的前體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029] 本發(fā)明采用磁富集和滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification,RCA)雙重信號放 大方式形成了一種高特異性和高靈敏的腫瘤細(xì)胞檢測方法。磁珠捕獲探針能從大量對照細(xì) 胞中將微量的靶細(xì)胞富集，并從中分離出來，相對于離心分離技術(shù)，操作簡便，不易丟失細(xì) 胞，有效減少了因細(xì)胞丟失而造成的信號降低；本發(fā)明還對反應(yīng)時(shí)間等進(jìn)行了優(yōu)化，整個(gè)實(shí) 驗(yàn)是在優(yōu)化范圍內(nèi)最好的條件下進(jìn)行的；為了提高適配體探針檢測的靈敏性，本發(fā)明將檢 測探針檢測信號經(jīng)RCA信號放大。本發(fā)明還采用了分子信標(biāo)做信號報(bào)告分子，該分子信標(biāo) 的環(huán)狀部分能與RCA產(chǎn)物的重復(fù)序列完全互補(bǔ)。只有發(fā)生了 RCA反應(yīng)，RCA的長鏈產(chǎn)物有部 分序列與分子信標(biāo)雜交，使分子信標(biāo)自身雜交打開，突光信號才能得以恢復(fù)。分子信標(biāo)的使 用明顯降低了背景熒光，提高了檢測的靈敏度。另外，本發(fā)明在均相中進(jìn)行，相比界面反應(yīng) 來說，細(xì)胞與適配體之間有更多的接觸機(jī)會，保證了反應(yīng)更加快速和完全。由于以上原因， 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了高特異性和高靈敏的檢測，能從200萬個(gè)正常人外周血細(xì)胞中檢測出100個(gè) 白血病細(xì)胞，靈敏度達(dá)到兩萬分之一。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1為聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針的RCA反應(yīng)信號放大電泳檢測結(jié)果及熒光儀 檢測結(jié)果。A為電泳成像結(jié)果；B為熒光儀檢測結(jié)果。
[0031] 圖2為熒光顯微鏡觀察細(xì)胞上RCA擴(kuò)增的情況。左側(cè)圖片為光學(xué)顯微鏡下觀察， 右側(cè)為熒光顯微鏡下觀察。A、B :為RCA反應(yīng)后0分鐘；C、D :為RCA反應(yīng)后10分鐘；E、F : 為RCA反應(yīng)后30分鐘；G、H :為RCA反應(yīng)后60分鐘；I、J :為RCA反應(yīng)后90分鐘；K、L為RCA 反應(yīng)后120分鐘。
[0032] 圖3為流式細(xì)胞所檢測細(xì)胞上RCA擴(kuò)增的情況。A為流式細(xì)胞儀檢測CEM細(xì)胞上 RCA擴(kuò)增效果；為流式細(xì)胞儀檢測Ramos細(xì)胞上適配體RCA擴(kuò)增效果；C為CEM和Ramos幾 何平均熒光強(qiáng)度比較柱狀圖。
[0033] 圖4為FITC標(biāo)記的捕獲探針與聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針檢測CEM細(xì)胞RCA 信號放大效果比較圖。
[0034] 圖5為聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針對CEM細(xì)胞特異性的捕獲圖。A為空白磁珠； B為捕獲探針對Ramos細(xì)胞的捕獲；C為捕獲探針對293-T細(xì)胞的捕獲；D為捕獲探針對CEM 細(xì)胞的捕獲。
[0035] 圖6為聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針對CEM細(xì)胞特異性檢測熒光顯微鏡結(jié)果圖。 左側(cè)圖片為明場圖，右側(cè)圖片為熒光成像圖。A、B為空白磁珠；C、D為Ramos細(xì)胞；E、F為 293T細(xì)胞；G、H為CEM細(xì)胞。
[0036] 圖7為聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針對CEM細(xì)胞特異性檢測熒光光譜圖。
[0037] 圖8為聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針對CEM細(xì)胞系與T-ALL患者淋巴細(xì)胞捕獲結(jié) 果比較顯微鏡成像圖。A為CEM細(xì)胞系捕獲前；B為CEM細(xì)胞系捕獲后；C為T-ALL患者外 周血淋巴細(xì)胞捕獲前；D為T-ALL患者外周血淋巴細(xì)胞捕獲后。
[0038] 圖9為聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針檢測白血病微殘留小病變結(jié)果（RQ-PCR儀檢 測結(jié)果）。圖中，線條1表示〇個(gè)CEM細(xì)胞；線條2表示50個(gè)CEM細(xì)胞；線條3-6分別表示 100、500、1000、2000 個(gè) CEM 細(xì)胞。
[0039] 圖10為聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針對白血病患者外周全血細(xì)胞的檢測結(jié)果。A 為外周全血檢測結(jié)果熒光光譜圖；B為健康正常人與ALL患者外周全血檢測結(jié)果差異性比 較圖。
[0040] 圖11為ALL患者治療前后不同時(shí)間點(diǎn)外周血檢測結(jié)果（RQ-PCR儀檢測結(jié)果）。

【具體實(shí)施方式】
[0041] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043] CEM細(xì)胞（人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞）：購自上海豐壽生物科技有限公司，貨號： Cell-3720。
[0044] Ramos細(xì)胞（人B淋巴瘤細(xì)胞）：購自上海拜力生物科技有限公司，貨號：RAM0S。
[0045] 293T細(xì)胞（Sv40轉(zhuǎn)化的人胚腎上皮細(xì)胞）：購自上海拜力生物科技有限公司，貨 號：293T。
[0046] 實(shí)施例1、用于白血病細(xì)胞檢測的探針組的制備
[0047] 一、磁珠捕獲探針的制備
[0048](一）經(jīng)生物素標(biāo)記的捕獲探針的制備
[0049] 所述生物素標(biāo)記的捕獲探針為生物素標(biāo)記的單鏈DNA分子，為中國大連寶生物公 司產(chǎn)品，該探針?biāo)玫膯捂淒NA序列如下所示：
[0050] 5 ' -ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGAAAAAA-3 '（序列 1)，其中生物 素標(biāo)記分子在核酸鏈的3'端。
[0051] (二）經(jīng)鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠
[0052] 所述鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠為Invitrogen公司生產(chǎn)的Dynabeads鏈霉親和素磁 珠 Μ280,該磁珠的具體參數(shù)如下：如磁珠平均直徑2. 8μπι、表面積：4-8m2/g、密度：1. 4g/ cm3、磁珠含量：10mg/ml、等電點(diǎn)：pH 5.0、低電荷：-10mV(pH 7)、CV值〈3%、鐵含量（鐵氧 體）：12% (17% )。
[0053] (三）磁珠捕獲探針的制備
[0054] 1、將步驟（一）中獲得的經(jīng)生物素標(biāo)記的捕獲探針用結(jié)合緩沖液配制成濃度為 500nM(以DNA計(jì)量）的溶液。其中，結(jié)合緩沖液的組成如下（以IL溶液為例）：NaCl 8g， KCl 0· 2g，CaCl2O. 14g，Na2HPO4 · H2O 0· lg，MgCl2 · 6H20 I. 42g，NaHCO3O. 35g，KH2PO4O. 2g，葡 萄糖4. 5g;余量為水。
[0055] 2、取200 μ I步驟（二）獲得的經(jīng)鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠（濃度為10mg/ml，以磁 珠的量計(jì)算），用結(jié)合緩沖液（配方同上）洗滌2次后，再將磁珠懸浮于200 μ 1的結(jié)合緩沖 液中。
[0056] 3、取300 μ 1步驟1獲得的濃度為500ηΜ(以DNA計(jì)量）的經(jīng)生物素標(biāo)記的捕獲探 針溶液與200 μ 1經(jīng)步驟2處理的鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠充分混勻后，于25°C IOOrpm震蕩 孵育15分鐘，置磁力架上，磁分離后，棄上清，所得沉淀用結(jié)合緩沖液（配方同上）重懸。
[0057] 4、用50 μ 1的結(jié)合緩沖液（配方同上）清洗兩次，最后用200 μ 1結(jié)合緩沖液（配 方同上）重懸已固定有DNA的磁珠至10mg/ml (以磁珠計(jì)）。
[0058] 二、檢測探針的制備
[0059] 1、設(shè)計(jì)并合成靶序列和磷酸標(biāo)記的鎖式探針
[0060] 靶序列為：
[0061] 5 J -ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGAAAAAAAAAA TGTCCGTGCTAGAAGGAAACAGTTAC- 3'（序列 2);
[0062] 磷酸標(biāo)記的鎖式探針為（5' -3'）：
[0063] P03-TAGCACGGACATATATGATGGTACCGCAGACTAAGCCACCGTGATCACT ACTAAGTGGAAGAAA TGTAACTGTTTCCTTC (序列 3)。
[0064] 2、靶序列和磷酸標(biāo)記的鎖式探針均用結(jié)合緩沖液（配方同上）配成5μΜ濃度，將 靶序列溶液、磷酸標(biāo)記的鎖式探針溶液和無菌水按照體積比為1 :3 :6的比例混合，95°C加 熱10分鐘，緩慢冷卻至25°C。此步驟的目的是讓靶序列和鎖式探針結(jié)合。
[0065] 3、向步驟2的體系（20μ1)中加入4.5μ1大腸桿菌連接酶反應(yīng)溶液（含 IOXligase Buffer 2μ1，10XBSA 2μ1，Ε· coli DNA 連接酶 0·5μ1(濃度為 2U/μ 1)， 16°C過夜孵育（12h)。此步驟的目的是讓鎖式探針連接成環(huán)。
[0066] 實(shí)施例2、用于白血病細(xì)胞檢測的探針組的應(yīng)用實(shí)例
[0067] -、細(xì)胞的捕獲和突光信號的檢測
[0068] I、RCA反應(yīng)隨反應(yīng)時(shí)間信號放大情況檢測
[0069] A.待檢細(xì)胞：CEM細(xì)胞（人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞）。
[0070] (1)取4μ 1濃度為10mg/ml (以磁珠計(jì)）的實(shí)施例1步驟一獲得的磁珠捕獲探針 和4μ 1濃度為500nM(以DNA計(jì)量）的實(shí)施例1步驟二獲得的檢測探針混勻，加入待檢細(xì) 胞25 °C孵育25分鐘。
[0071] (2)用結(jié)合緩沖液（配方同上）洗滌2次，將細(xì)胞懸浮于30. 1μ 1的結(jié)合緩沖 液（配方同上）中，加入9·9μ1 Phi29DNA聚合混合反應(yīng)液（IOXPhi 29DNA polymerase Buffer4y I ;100XBSA 0· 4μ I ;2. 5mM dNTP 3μ 1 ;10μΜ 分子信標(biāo) 2 μ I ;Phi29DNA polymeraseO. 5 μ I)，30°C反應(yīng)30min后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測及突光儀檢測，反應(yīng)的第 Omin、10min、30min、60min、90min和120min分別進(jìn)行突光顯微鏡觀察。
[0072] 其中，分子信標(biāo)的核苷酸序列為：5' -TC TAC GG CAC TAC TAA GTG GAA GCC GTA GA-3'（序列 4)。
[0073] 分子信標(biāo)的5'端標(biāo)記有熒光基團(tuán)FITC，3'端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)DABCYL。
[0074] 瓊脂糖凝膠電泳檢測及熒光儀的檢測結(jié)果如圖1所示，圖1中的A可以看到在瓊 脂糖凝膠的出孔處可見明亮的條帶，表明形成了分子量很大的RCA產(chǎn)物；圖1中的B可以看 到RCA產(chǎn)物和分子信標(biāo)雜交后可產(chǎn)生大量的突光信號。
[0075] 熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖2所示，可以看到，細(xì)胞上熒光強(qiáng)度隨著滾環(huán)放大反應(yīng) 時(shí)間的增加而增強(qiáng)，表明聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針可以在細(xì)胞上進(jìn)行RCA擴(kuò)增，且隨 著時(shí)間的延長，產(chǎn)物逐漸增多。當(dāng)滾環(huán)放大反應(yīng)時(shí)間維持60分鐘左右時(shí)，可以觀察到細(xì)胞 熒光，120分鐘時(shí)熒光最強(qiáng)。
[0076] B.待檢細(xì)胞：CEM細(xì)胞（人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞）和Ramos細(xì)胞（人B淋巴瘤 細(xì)胞）。
[0077] (1)參照A中⑴進(jìn)行。
[0078] (2)參照 A 中（2)進(jìn)行，反應(yīng)的第 Omin、10min、30min、60min、90min 和 120min 分別 采用流式細(xì)胞儀對熒光信號進(jìn)行檢測。
[0079] 實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置采用FITC標(biāo)記的捕獲探針（FITC-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATA CTGTACGGTTAGAAAAAA)替代探針組和分子信標(biāo)的對照。具體如下：取4μ 1濃度為500nM(以 DNA計(jì)量）的FITC標(biāo)記的捕獲探針，加入待檢細(xì)胞25°C孵育25分鐘。用結(jié)合緩沖液（配 方同上）洗滌2次，將細(xì)胞懸浮于32. 1μ 1的結(jié)合緩沖液（配方同上）中，加入7· 9μ 1 Phi29DNA 聚合混合反應(yīng)液（10XPhi 29DNA polymerase Buffer 4μ I ;100XBSA 0·4μ I ; 2. 5mM dNTP 3μ I ;Phi29DNA polymerase 0· 5μ I)，30°C 反應(yīng) I. 5 小時(shí)后采用流式細(xì)胞儀對 熒光信號進(jìn)行檢測。
[0080] 實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置以空白磁珠替代磁珠捕獲探針的空白對照。
[0081] 實(shí)驗(yàn)組中，CEM細(xì)胞和Ramos細(xì)胞隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，流式細(xì)胞所檢測到的熒光 信號具體如圖3所示。可以看到隨著時(shí)間的延長，CEM細(xì)胞熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)（圖3中A)， 而Ramos細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化不大（圖3中B);隨著時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)組CEM細(xì)胞FITC-A Gea Mean成倍增加，RCA擴(kuò)增120分鐘時(shí)，幾何平均熒光強(qiáng)度增至空白對照的近40倍，對照組 Ramos細(xì)胞無明顯增加（圖3中C)。以上結(jié)果表明CEM細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于Ramos細(xì) 胞，聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針能有效的用于靶細(xì)胞的特異性檢測。
[0082] 另外，與FITC標(biāo)記的捕獲探針和CEM細(xì)胞結(jié)合相比，捕獲探針經(jīng)滾環(huán)擴(kuò)增1. 5小 時(shí)后的樣品（即本發(fā)明探針組處理樣品）曲線明顯右移（圖4)。表明聯(lián)合磁珠捕獲探針和 檢測探針檢測信號經(jīng)RCA后信號明顯放大。
[0083] 2、聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針對捕獲白血病細(xì)胞的特異性分析
[0084] 待檢細(xì)胞：CEM細(xì)胞（人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞）、Ramos細(xì)胞（人B淋巴瘤細(xì)胞） 和293T細(xì)胞（Sv40轉(zhuǎn)化的人胚腎上皮細(xì)胞）。
[0085] (1)參照步驟IA中（1)進(jìn)行。
[0086] (2)參照步驟IA中（2)進(jìn)行，反應(yīng)25min后采用光鏡和熒光顯微鏡對各細(xì)胞的捕 獲情況進(jìn)行觀察，并采用熒光儀對各組的熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行檢測。
[0087] 實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置以空白磁珠替代磁珠捕獲探針的對照。
[0088] 光鏡觀察結(jié)果如圖5所示，可以看到CEM細(xì)胞周圍可見磁珠，而其他的細(xì)胞未被捕 獲或者細(xì)胞周圍未見磁珠，表明捕獲探針只捕獲CEM細(xì)胞。
[0089] 熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖6所示，可以看到，空白磁珠、Ramos和293T細(xì)胞樣品均 未見明顯熒光，而CEM細(xì)胞樣品中可見磁珠及細(xì)胞均有熒光信號。表明聯(lián)合磁珠捕獲探針 和檢測探針可以實(shí)現(xiàn)CEM細(xì)胞特異性檢測。
[0090] 熒光光譜圖如圖7所示，可以看到，CEM細(xì)胞樣品的熒光信號明顯強(qiáng)于293T細(xì)胞 和Ramos細(xì)胞。表明聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針可以實(shí)現(xiàn)CEM細(xì)胞特異性檢測。
[0091] 二、聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針對白血病患者淋巴細(xì)胞的檢測
[0092] 待測樣本：取自臨床確認(rèn)為健康正常人的外周全血，以及取自臨床確診為T-ALL 患者的外周全血。
[0093] 向待測的外周全血中加入含肝素溶液（10?50U/ml血樣本），混勻，使血液抗凝。 然后按照如下步驟進(jìn)行操作：
[0094] (1)淋巴細(xì)胞的獲?。河胮H 7. 2的PBS將Iml的抗凝血按照體積比1 :1進(jìn)行稀 釋；吸取Iml淋巴細(xì)胞分離液（Solarbio公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為P8610)置于刻度離心 管中。將稀釋的全血沿管壁緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液上面；在18°C?20°C下，用水平離心 機(jī)以2000r/min離心20min，收集PBMC，用PBS液洗滌細(xì)胞3次，每次1600rpm，離心10分 鐘。用結(jié)合緩沖液（配方同上）重懸細(xì)胞，混勻，計(jì)數(shù)后加入完全1640培養(yǎng)基，移至6孔培 養(yǎng)板中培養(yǎng)30?45min，收集懸浮細(xì)胞即為淋巴細(xì)胞。
[0095] (2)分別取IX IO6淋巴細(xì)胞，置于96孔板中。
[0096] (3)取4 μ 1濃度為lOmg/ml (以磁珠計(jì)）的實(shí)施例1步驟一獲得的磁珠捕獲探針 和4μ 1濃度為500nM(以DNA計(jì)量）的實(shí)施例1步驟二獲得的檢測探針混勻，加入待檢細(xì) 胞25 °C孵育25分鐘。
[0097] (4)用結(jié)合緩沖液（配方同上）洗滌2次，將細(xì)胞懸浮于30. 1μ 1的結(jié)合緩沖 液（配方同上）中，加入9.9ylPhi29DNA聚合混合反應(yīng)液（IOXPhi 29DNA polymerase Buffer4yl;100XBSA 0·4μ1;2·5πιΜ dNTP 3μ1;10μΜ 分子信標(biāo) 2yl;Phi29DNA polymeraseO. 5 μ I)，30°C反應(yīng)120min，然后用突光顯微鏡進(jìn)行觀察。
[0098] 實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置以GEM細(xì)胞替代白血病患者淋巴細(xì)胞的對照。
[0099] 結(jié)果如圖8所示，可以看到，聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針對GEM細(xì)胞和白血病患 者淋巴細(xì)胞的捕獲相似。表明可以利用CEM細(xì)胞建立微小殘留病變模型。
[0100] 三、微小殘留病變模型的建立和微小病變的檢測
[0101] 1、微小殘留病變模型的建立
[0102] 將50、100、500、1000、2000個(gè)CEM細(xì)胞分別與臨床確認(rèn)為健康正常人的淋巴細(xì)胞 混合建立微小病變模型，使細(xì)胞總數(shù)達(dá)200萬個(gè)，得到微小殘留病變模型。
[0103] 2、微小病變的檢測
[0104] 待檢細(xì)胞：微小殘留病變模型細(xì)胞。
[0105] (1)參照步驟一 IA中（1)進(jìn)行。
[0106] ⑵參照步驟一 IA中⑵進(jìn)行，反應(yīng)25min后，采用RQ-PCR儀對各組的熒光信號 強(qiáng)度進(jìn)行檢測。
[0107] 實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置添加了 0個(gè)CEM細(xì)胞（即200萬個(gè)細(xì)胞均為健康正常人的淋巴細(xì) 胞）的正常人組。
[0108] 結(jié)果如圖9所示，可見100個(gè)CEM細(xì)胞以上的微小殘留病變模型的熒光強(qiáng)度均明 顯高于正常人對照，檢測靈敏度達(dá)2X10'實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次得到同樣的結(jié)果。
[0109] 四、聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針對白血病患者外周全血細(xì)胞的檢測
[0110] 待測樣本：取自臨床確認(rèn)為健康正常人的外周全血，以及取自臨床確診為T-ALL 患者的外周全血。
[0111] 向待測的外周全血中加入含肝素溶液（10?50U/ml血樣本），混勻，使血液抗凝。 然后按照如下步驟進(jìn)行操作：
[0112] (1)分別取健康正常人和T-ALL患者經(jīng)過抗凝處理的外周全血100 μ 1，IOOOrpm離 心5分鐘，棄上清，從離心管底部吸棄大部分的紅細(xì)胞，加入2ml的結(jié)合緩沖液中（配方同 上）洗滌3次，最終將細(xì)胞懸浮于100 μ 1的結(jié)合緩沖液中（配方同上），待用。
[0113] (2)取4μ 1濃度為10mg/ml (以磁珠計(jì)）的實(shí)施例1步驟一獲得的磁珠捕獲探 針，加入到20 μ 1步驟（1)最終獲得的細(xì)胞懸浮液中，25°C孵育25分鐘。緩慢加入100? 200 μ 1的結(jié)合緩沖液（配方同上）洗滌2-3次，加入2 μ 1濃度為500nM (以DNA計(jì)量）的 實(shí)施例1步驟二獲得的檢測探針，25 °C孵育25分鐘。
[0114] (3)用結(jié)合緩沖液（配方同上）洗滌2次，將細(xì)胞懸浮于30. 1μ 1的結(jié)合緩沖 液（配方同上）中加入9·9μ1 Phi29DNA聚合混合反應(yīng)液（IOXPhi 29DNA polymerase Buffer4yl;100XBSA 0·4μ1;2·5πιΜ dNTP 3μ1;10μΜ 分子信標(biāo) 2yl;Phi29DNA polymeraseO. 5 μ I)，30°C反應(yīng)2小時(shí)后采用突光儀對各組的突光信號進(jìn)行檢測。
[0115] 結(jié)果如圖10所示，可以看到，經(jīng)聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針檢測，ALL患者全血 的熒光強(qiáng)度明顯較正常人增強(qiáng)（圖10中A)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P < 0. 01 (圖10中B)。 表明聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針檢測技術(shù)可以特異性檢測白血病細(xì)胞。
[0116] 五、聯(lián)合磁珠捕獲探針和檢測探針用于白血病病情監(jiān)測
[0117] 待測樣本：取自臨床確診為T-ALL患者化療前、化療開始3天、4天和第13天的外 周全血。
[0118] 向待測的外周全血中加入含肝素溶液（10?50U/ml血樣本），混勻，使血液抗凝。 然后按照如下步驟進(jìn)行操作：
[0119] (1)同步驟四（1)。
[0120] (2)同步驟四（2)。
[0121] (3)用結(jié)合緩沖液（配方同上）洗滌2次，將細(xì)胞懸浮于30. 1μ 1的結(jié)合緩沖 液（配方同上）中，加入9·9μ1 Phi29DNA聚合混合反應(yīng)液（IOXPhi 29DNA polymerase Buffer4y I ;100XBSA 0· 4μ I ;2. 5mM dNTP 3μ 1 ;10μΜ 分子信標(biāo) 2 μ I ;Phi29DNA polymeraseO. 5μ 1)，30°C反應(yīng)2小時(shí)，采用RQ-PCR儀對各組的熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行檢測。
[0122] 結(jié)果如圖11所示，可以看到，隨著治療時(shí)間的延長，熒光信號逐漸減弱。表明本發(fā) 明的檢測技術(shù)可以用于白血病病情的動(dòng)態(tài)監(jiān)測。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于白血病細(xì)胞檢測的探針組，由如下（a)和（b)組成： (a) 磁珠捕獲探針； 所述磁珠捕獲探針由磁珠和固定于所述磁珠上的捕獲探針組成；所述捕獲探針為序列 表中序列1所不的單鏈DNA分子； (b) 檢測探針或所述檢測探針的前體； 所述檢測探針的前體由靶序列和磷酸標(biāo)記的鎖式探針組成；所述靶序列為序列表中序 列2所示的單鏈DNA分子；所述磷酸標(biāo)記的鎖式探針的核苷酸序列為序列表中序列3所示 的單鏈DNA分子； 所述檢測探針是由環(huán)化的所述磷酸標(biāo)記的鎖式探針與所述靶序列結(jié)合而成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針組，其特征在于：所述檢測探針是按照包括如下步驟的 方法由所述檢測探針的前體制備得到的：將所述靶序列和所述磷酸標(biāo)記的鎖式探針按照摩 爾比為1 :(2-4)的比例混合，95°C孵育5-10min后，加入DNA連接酶15-20°C孵育10_16h， 得到所述檢測探針。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的探針組，其特征在于：所述磁珠捕獲探針按照包括如下 步驟的方法制備得到：將經(jīng)生物素標(biāo)記的所述捕獲探針與經(jīng)鏈霉親和素標(biāo)記的所述磁珠共 同孵育，獲得所述磁珠捕獲探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的探針組，其特征在于：進(jìn)行所述孵育時(shí)，經(jīng)生物素標(biāo) 記的所述捕獲探針與經(jīng)鏈霉親和素標(biāo)記的所述磁珠的配比具體為75pmol :lmg ; 所述孵育具體為20-30°C 80-150rpm震蕩孵育10-30min ; 所述孵育的液體環(huán)境具體為結(jié)合緩沖液；所述結(jié)合緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度 如下：NaC18g/L，KC10. 2g/L，CaCl20. 14g/L，Na2HP04 ? H200. lg/L，MgCl2 ? 6H201. 42g/L， NaHC030 . 35g/L，KH2P040. 2g/L，葡萄糖 4. 5g/L。
5. 含有權(quán)利要求1-4中任一所述的探針組的試劑盒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還含有分子信標(biāo)； 所述分子信標(biāo)為由一端帶有熒光基團(tuán)，另一端帶有淬滅基團(tuán)，核苷酸序列為序列表中 序列4所示單鏈DAN分子形成的頸環(huán)結(jié)構(gòu)。
7. 權(quán)利要求1-4中任一所述的探針組，或權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，在如下任一中 的應(yīng)用： (a) 制備用于白血病細(xì)胞檢測的試劑盒； (b) 制備用于白血病病情監(jiān)測的試劑盒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的探針組或試劑盒或應(yīng)用，其特征在于：所述白血病 細(xì)胞檢測為從待測者的外周全血、骨髓細(xì)胞、白細(xì)胞或淋巴細(xì)胞中檢測白血病細(xì)胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：進(jìn)行所述白血病病情監(jiān)測時(shí)，采用的待測 樣本為待測者的外周全血、骨髓細(xì)胞、白細(xì)胞或淋巴細(xì)胞。
10. 權(quán)利要求1中所述的檢測探針或所述檢測探針的前體。
【文檔編號】C12Q1/68GK104388549SQ201410605342
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】趙永祥, 李霞, 盧小玲, 黃勇 申請人:廣西醫(yī)科大學(xué)