專利名稱：生產(chǎn)重組人溶菌酶的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器——人溶菌酶轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別是涉及轉(zhuǎn)基因—克隆技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究是人類按著自己的意愿有目的、有計(jì)劃、有根據(jù)、有預(yù)見(jiàn)地改變動(dòng)物的遺傳組成，而改變其遺傳組成的目的是多種多樣的。比如遺傳學(xué)家希望通過(guò)改變動(dòng)物的遺傳組成來(lái)觀察其表型變化，生理學(xué)家希望通過(guò)特定基因的表達(dá)來(lái)研究該基因?qū)C(jī)體生理狀況的影響。與動(dòng)物生產(chǎn)有關(guān)的轉(zhuǎn)基因研究則希望通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)賦予動(dòng)物新的表型性狀。該項(xiàng)研究在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上依賴分子生物學(xué)、動(dòng)物胚胎和配子操作技術(shù)。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作方法目前主要有原核期胚胎的顯微注射，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染發(fā)育早期的動(dòng)物胚胎，精子載體法，ES細(xì)胞技術(shù)，PGCs技術(shù)，體細(xì)胞核移植技術(shù)，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染MII期的卵母細(xì)胞，精子頭與DNA合并注射卵母細(xì)胞法。這些方法上的改進(jìn)與提高大大地促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究由實(shí)驗(yàn)室向生產(chǎn)實(shí)踐轉(zhuǎn)化的進(jìn)程。
其中最傳統(tǒng)和最常用的方法是原核期胚胎的顯微注射，該方法由美國(guó)人Gordon發(fā)明，是目前應(yīng)用比較廣泛、效果比較穩(wěn)定的制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法之一。即在顯微操作儀下通過(guò)一毛細(xì)玻璃管將外源DNA注射進(jìn)動(dòng)物受精卵細(xì)胞的原核內(nèi)，再將該受精卵細(xì)胞移植進(jìn)受體細(xì)胞子宮內(nèi)，在受精卵分裂時(shí)，外源DNA可能整合入宿主染色體組，待該受精卵發(fā)育成熟即可獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。但是顯微注射法獲得的轉(zhuǎn)基因家畜的效率極低，特別是牛，羊和豬等，往往低于1％，這將大大增加制作轉(zhuǎn)基因家畜的成本。
隨著體細(xì)胞克隆技術(shù)的發(fā)展，基因操作技術(shù)與克隆技術(shù)相結(jié)合是將成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，特別是大家畜生產(chǎn)的主要方式。目前，取得的主要進(jìn)展是轉(zhuǎn)基因技術(shù)和靶位操作技術(shù)在克隆動(dòng)物上的應(yīng)用。首先，利用克隆進(jìn)行轉(zhuǎn)基因是指在核移植前，先把目的基因和標(biāo)記基因的融合基因?qū)肱囵B(yǎng)的體細(xì)胞，再通過(guò)標(biāo)記基因的表現(xiàn)來(lái)篩選轉(zhuǎn)基因的陽(yáng)性細(xì)胞及其克隆，然后再移植。1997年，英國(guó)PPL公司的科學(xué)家Schnieke與羅斯林研究所的Wilmut等聯(lián)手通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)率先在世界上制作了轉(zhuǎn)基因綿羊。利用胎兒成纖維細(xì)胞系，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染之后，再克隆。利用克隆進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，一旦核移植成功，從理論上講，轉(zhuǎn)基因成功率為100％。原核注射的方法會(huì)使大量的非轉(zhuǎn)基因胚胎被懷孕，這是一種資源浪費(fèi)，而利用克隆進(jìn)行轉(zhuǎn)基因技術(shù)不會(huì)造成代理母親去懷孕非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。此外，利用克隆進(jìn)行轉(zhuǎn)基因時(shí)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的性別會(huì)被提前決定。這樣的話，如果想得到能在乳腺中表達(dá)蛋白質(zhì)，就可以使克隆的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物全是雌性動(dòng)物。
由于動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)能按照人們的意愿改變動(dòng)物的生產(chǎn)性狀，得到人們所需要的產(chǎn)品，特別是一些蛋白藥品及保健品，科學(xué)家們已經(jīng)開(kāi)始將動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用到實(shí)踐當(dāng)中，目前動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有以下一些應(yīng)用(1)、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高畜產(chǎn)品產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)，(2)、動(dòng)物抗病育種，(3)建立診斷和治療人類疾病的動(dòng)物模型，(4)生產(chǎn)藥用蛋白。
動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器是一種利用動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在乳腺細(xì)胞中表達(dá)多肽藥物、工業(yè)酶、疫苗和抗體等蛋白的技術(shù)。通過(guò)基因工程的方法改造乳腺的功能有利于我們進(jìn)一步研究乳腺癌的機(jī)制，提高乳汁的營(yíng)養(yǎng)成分，甚至可以合成藥物。該技術(shù)具有低投入高產(chǎn)出的特點(diǎn)，其效率是利用以大腸桿菌和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的一百倍，是一種非常有潛力的高新技術(shù)。1987年，Simons等人在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中首次成功地表達(dá)羊乳球蛋白基因，并且小鼠奶樣中的蛋白含量高達(dá)23克/升，大約是動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)蛋白的400倍以上。該技術(shù)一經(jīng)出現(xiàn)就得到迅猛的發(fā)展。目前，牛乳白蛋白基因人組織血纖維蛋白溶酶原因子，人生長(zhǎng)激素基因，人體抗胰蛋白酶基因，人尿激酶基因和人干擾素基因等基因都在小鼠的乳腺中得到表達(dá)。許許多多的著名科學(xué)家都認(rèn)為這將是畜牧業(yè)前所未有的革命，可能會(huì)給社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。
乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物的優(yōu)越性讓藥物蛋白基因表達(dá)在某一特定部位，而不是隨機(jī)地在身體任意表達(dá)。科學(xué)家們一致認(rèn)為，就藥物而言，理想的表達(dá)場(chǎng)所是乳腺。主要有以下原因1、動(dòng)物乳腺是一個(gè)封閉的系統(tǒng)。乳腺組織表達(dá)的蛋白質(zhì)絕大部分不會(huì)回到血液循環(huán)，這樣就避免大量表達(dá)的外源性蛋白質(zhì)對(duì)動(dòng)物健康造成的危害。2、乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器。一頭奶牛一年可生產(chǎn)乳蛋白250～300kg，一只綿羊和山羊可生產(chǎn)乳蛋白25～30kg，即使一只家兔，一年生產(chǎn)乳蛋白也可達(dá)到3～5kg，如果把百分之一的乳蛋白合成醫(yī)用蛋白，其產(chǎn)量就十分可觀。3、乳腺組織可以對(duì)人體蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的修飾和后加工，產(chǎn)品的生物學(xué)活性接近天然產(chǎn)品。4、在動(dòng)物乳腺表達(dá)的外源基因可以遺傳。一旦獲得一個(gè)生產(chǎn)某種有價(jià)值蛋白質(zhì)的動(dòng)物個(gè)體，可以用常規(guī)畜牧技術(shù)繁殖生產(chǎn)群體，研究技術(shù)雖然復(fù)雜，費(fèi)用高昂，但其研究生產(chǎn)的放大過(guò)程卻較容易5、縮短新藥上市周期。從藥物生產(chǎn)開(kāi)發(fā)周期方面來(lái)看，目前一種新藥從它的研制開(kāi)發(fā)、藥審，直到上市，整個(gè)過(guò)程需要10～15年，如果利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺反應(yīng)器，新藥生產(chǎn)的周期約5年。6、可以獲取巨額經(jīng)濟(jì)利潤(rùn)。如荷蘭金發(fā)馬公司用轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)乳鐵蛋白，預(yù)計(jì)每年從乳汁中提煉出來(lái)營(yíng)養(yǎng)奶粉銷售額是50億美元。
利用乳腺生物反應(yīng)器的方法改造奶牛、奶山羊，使生產(chǎn)出的奶成分近似于人奶，既有營(yíng)養(yǎng)的功能，又有藥用的功能，這種奶可以使孩子長(zhǎng)得高大，促進(jìn)大腦和神經(jīng)發(fā)育，增強(qiáng)免疫功能，這種新型保健品一定會(huì)有廣闊的前途。改善奶的營(yíng)養(yǎng)成份或生理生化特征也是人們希望通過(guò)改變動(dòng)物的遺傳組成來(lái)實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)之一，即制造所謂的營(yíng)養(yǎng)藥品(Nutraceuticals)。家畜奶及其加工產(chǎn)品可提供人類30％的營(yíng)養(yǎng)蛋白，含有豐富的必需氨基酸、鈣和無(wú)機(jī)磷酸鹽，以及消化率很高的酪蛋白，是人類高質(zhì)量的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源但家畜奶在品質(zhì)上還是不盡如人意。因此，人們一直在研究如何改善奶品質(zhì)。自Gordon創(chuàng)立動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)以來(lái)，世界各國(guó)都爭(zhēng)先開(kāi)展轉(zhuǎn)基因育種及其相關(guān)技術(shù)研究。研究表明外源基因不僅能在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中得到整合與表達(dá)，而且能獲得組織特異性(乳腺組織、輸卵管)和發(fā)育特異性表達(dá)，并且現(xiàn)在能夠利用分子技術(shù)找到調(diào)節(jié)乳成分的所有基因。
牛乳的蛋白含量比人乳的高，牛乳為33g/L，而人乳僅為10g/L。其中最重要的是人乳中乳清蛋白含量(68％)比酪蛋白(32％)比例高，具有免疫活性的乳鐵蛋白(15％)和溶菌酶(4％)含量高，且缺乏β-乳球蛋白和κ-酪蛋白。
溶菌酶(lysozyme)又稱胞壁質(zhì)酶(muramidase)，是天然非特異性免疫物質(zhì)，具有強(qiáng)力殺菌作用。1922年，英國(guó)細(xì)菌科學(xué)家Fleming首次發(fā)現(xiàn)人的唾液和眼淚中存在有溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名為溶菌酶。此后在人和動(dòng)物多種組織、分泌物，某些植物、微生物中也發(fā)現(xiàn)了溶菌酶的存在。溶菌酶可分為三型c型(雞卵清溶菌酶，Chicken white lysozyme，cly)、g型(鵝卵清溶菌酶，googse egg-white lysozyme，gly)、噬菌體溶菌酶(Canfield and Mcmurry，1967)。大部分溶菌酶都屬于c型，從人乳汁、尿和胎盤中提取的溶菌酶也屬于c型。人溶菌酶(hLY)屬于c型溶菌酶(Isabelle，1990)，具有抗菌、免疫調(diào)節(jié)及一定的抗腫瘤作用，有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
人溶菌酶是一種由18種130個(gè)氨基酸組成的堿性多肽，分子量為14.7KD，等電點(diǎn)為pH11。其前體包含148氨基酸，其中前18個(gè)氨基酸為信號(hào)肽(NP_000230)。人溶菌酶的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，包含7個(gè)α—螺旋和1個(gè)由3股肽鏈組成的beta-sheet和四對(duì)二硫鍵。所有的結(jié)構(gòu)均有一條肽鏈組成，而沒(méi)有其他亞基。從酶三維結(jié)構(gòu)的表面結(jié)構(gòu)來(lái)看，酶的結(jié)構(gòu)為較緊密的橢球形，大多數(shù)極性基團(tuán)分布在酶的表面上，便于與溶劑結(jié)合，而非極性基團(tuán)隱藏在酶的內(nèi)部，整個(gè)酶分子中有一狹長(zhǎng)的凹穴。
溶菌酶以溶解革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁而具有溶菌作用。原因在于它能水解細(xì)菌細(xì)胞壁粘多糖(polypeptidoglycan)N-乙酰葡萄糖胺(NAG)與N-乙酰氨基葡萄糖乳酸(NAM)之間(NAM4-O-NAG5glycosidic bond)的β-1.4糖苷鍵。隨著細(xì)胞壁的弱化，細(xì)菌會(huì)因?yàn)閮?nèi)部壓力的作用崩裂而死。Pellegrini等人的結(jié)果顯示溶菌酶抑菌作用不僅僅與它的胞壁質(zhì)酶有關(guān)，而且還與其陽(yáng)離子和疏水的特性有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明，最適小分子底物與酶結(jié)合時(shí)，正好與酶分子中的長(zhǎng)形凹穴嵌合，酶活性中心由三級(jí)結(jié)構(gòu)相距較近的Asp53和Glu35氨基酸殘基組成。
溶菌酶的作用1)抗菌消炎，溶菌酶是能水解粘多糖的堿性水解酶，而粘多糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分之一，其能直接水解革蘭陽(yáng)性菌，在免疫蛋白A、補(bǔ)體的參與下，還能水解革蘭陰性菌。此外，它還會(huì)與各種誘發(fā)炎癥的酸性物質(zhì)結(jié)合，使其失活，并能夠增強(qiáng)抗生素和其它藥物的療效，改善組織基質(zhì)的粘多糖代謝，從而達(dá)到消炎、修復(fù)組織的目的。2)抗病毒作用，溶菌酶能與帶負(fù)電荷的病毒蛋白作用，與DNA，RNA，脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活。近來(lái)，一些結(jié)果顯示來(lái)源雞蛋清，人乳核和人中性粒細(xì)胞的溶菌酶具有抑制HIV-1生長(zhǎng)的活性。3)增強(qiáng)免疫力，溶菌酶作為機(jī)體非特異免疫因子之一，參與機(jī)體多種免疫反應(yīng)，在機(jī)體正常防御功能和非特異免疫中，具有保持生理平衡的重要作用，可以改善和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和消化能力，激活白細(xì)胞的的吞噬功能，并能改善細(xì)胞抑制劑所導(dǎo)致的白細(xì)胞減少，受到病原微生物的侵害時(shí)，其發(fā)揮抗感染作用，是一種非常重要的非特性免疫物質(zhì)。4)其還具有激活血小板的功能可以改善組織的局部血液循環(huán)障礙，分解膿液、增強(qiáng)局部防衛(wèi)功能，從而體現(xiàn)止血、消腫等作用。還可以作為一種抵抗因子，對(duì)組織局部起保護(hù)作用。
溶菌酶的應(yīng)用1)溶菌酶作為防腐劑。它本身是一種天然蛋白質(zhì)，無(wú)毒性，是一種安全性高的食品添加劑。同時(shí)溶菌酶僅能作用于目的微生物的細(xì)胞壁，而不能作用于其它物質(zhì)。2)溶菌酶在醫(yī)學(xué)上和應(yīng)用。A.五官科的應(yīng)用溶菌酶適用于五官科各種炎癥。研究表明它對(duì)眼、耳、鼻、喉和口腔等的急、慢性炎癥均有一定療效，特別對(duì)急性炎癥如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明顯。若在牙膏、漱口水、口潔劑、口香糖中設(shè)法添加一定量的溶菌酶，則可以殺死這些病菌，達(dá)到防止蟲(chóng)牙的目的。同樣，可用溶菌酶來(lái)制眼藥水、潤(rùn)喉液。B.皮膚科的應(yīng)用溶菌酶可以用于治療扁平疣、傳染性軟疣、尋常性疣、尖銳濕疣、帶狀皰疹等多種皮膚病。對(duì)于帶狀皰疹，內(nèi)服溶菌酶即可。而對(duì)于扁平疣和傳染性軟疣等的治療，最好采取內(nèi)服溶菌酶和5-氟脲嘧啶人溶液外涂，療效明顯提高。C.其他方面的應(yīng)用溶菌酶可用于小兒和乳兒哮喘性支氣管炎、呼吸道內(nèi)膜腫脹等，它可使粘膜腫脹很快消除，使痰液變稀，呼吸道通暢。溶菌酶可以預(yù)防和治療病毒性肝炎，尤其對(duì)輸血后肝炎及急性肝炎的效果較為顯著。在機(jī)體內(nèi)，它還有抗流感病毒和腺病毒的生長(zhǎng)，并能防止皰疹病毒感染。此外，對(duì)肉瘤引起的疼痛、久治不愈的小兒腹瀉及Sjogren’s病，均有一定療效。D.人體溶菌酶的濃度還可以作為多種疾病診斷指標(biāo)。3)食品、飲料中的應(yīng)用。溶菌酶集藥理、保健和防腐三個(gè)功能于一體。做為一種天然蛋白質(zhì)無(wú)任何副作用。溶菌酶的加入，補(bǔ)充了人體內(nèi)的非特異性免疫因子，殺死腸道內(nèi)的腐敗球菌，維持腸道內(nèi)菌群正常化，促進(jìn)雙歧桿菌增殖，加強(qiáng)白清滅菌蛋白，Y-球蛋的防御因子，增強(qiáng)抗感染力。加入飲料中，如鈣奶、乳酸飲料中，也可起到防蛀牙、爽口的作用。特別是母乳化奶粉，對(duì)嬰幼兒的成長(zhǎng)十分重要。牛奶中的溶菌酶含量極少，而母乳中的溶菌酶含量十分豐富。為彌補(bǔ)奶粉的不足，可以向其中添加適量溶菌酶，制成母乳化能奶粉。溶菌酶的加入，可以加強(qiáng)嬰幼兒的抗感染能力。4)制備細(xì)胞浸提物。酵母膏藥發(fā)酵工業(yè)中用量最多的一類培養(yǎng)基成分。它的制備目前大多是采用酵母自溶法或酵解、酵母的辦法制成的。如果改用溶菌酶制備酵母膏，則不僅可以提高浸膏量的收率，還可以大大縮短酵母膏的制備時(shí)間。也可以用溶菌酶從酵母細(xì)胞中制備呈味物質(zhì)，如有些溶菌酶中除了含有溶菌酶活性外，還含有能分解酵母細(xì)胞中的核酸為肌苷酸和鳥(niǎo)苷酸的單核酸類的呈味物質(zhì)。5)科學(xué)研究中的應(yīng)用。由于溶菌酶具有能夠?qū)Ｒ恍缘胤纸饧?xì)胞壁的能力，除了在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用外，溶菌酶更廣泛的應(yīng)用于科學(xué)研究中。如用溶菌酶專一性地水解細(xì)胞壁的特點(diǎn)，了解微生物細(xì)胞壁的構(gòu)造；分解細(xì)胞壁后制備原生質(zhì)體，而用于微生物育種以及微生物分類等學(xué)術(shù)研究和專用試劑學(xué)。
不同來(lái)源的溶菌酶，其溶菌譜各不相同。雞蛋清溶菌酶只對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有溶菌作用。在這些溶菌酶中，人體中的溶菌酶活性最高，其次是雞蛋白中的溶菌酶，最低的是牛乳中的溶菌酶。人溶菌酶具有生物相容性好，對(duì)組織無(wú)刺激、無(wú)毒性的優(yōu)點(diǎn)。商業(yè)化的人溶菌酶可以從乳汁、中性粒細(xì)胞和尿液中提取，然而這種資源畢竟非常有限，所以人們開(kāi)始研究利用重組技術(shù)來(lái)生產(chǎn)人溶菌酶。這個(gè)過(guò)程主要經(jīng)歷了三個(gè)階段。第一個(gè)階段，最初，利用酵母和米曲霉實(shí)驗(yàn)來(lái)表達(dá)溶菌酶。1986年，Jigami等人利用酵母進(jìn)行人溶菌酶表達(dá)，但這種重組蛋白不具有抑菌活性。接下來(lái)，Castanon和Yoshimura也作了相似的工作，也沒(méi)有取得重要突破。1990年，Archer等人用米曲霉表達(dá)雞蛋清溶菌酶，表達(dá)量為12mg/l。Tsuchiya等人在米曲霉里表達(dá)人溶菌酶，表達(dá)量為1.2mg/l，遺憾的是同樣沒(méi)有生物學(xué)活性。由此可見(jiàn)，在酵母和米曲霉里表達(dá)的溶菌酶不具有生物活性。第二個(gè)階段，利用轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)人溶菌酶。Maga在這方面作了大量工作，1994年Maga等人進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺表達(dá)人溶菌酶的研究，他們利用alpha sl-casein啟動(dòng)子來(lái)誘導(dǎo)溶菌酶的表達(dá)。在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺組織檢測(cè)人溶菌酶mRNA的存在。溶菌酶的表達(dá)量估計(jì)為0.2g/L到0.7g/L，由于溶菌酶的表達(dá)，乳汁的物理和功能特性也發(fā)生了改變。1998年，Maga等人的研究結(jié)果進(jìn)一步表明轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)人溶菌酶的奶樣具有同標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶相同的活性。這些結(jié)果暗示著溶菌酶的轉(zhuǎn)基因研究在乳品加工業(yè)有著巨大的應(yīng)用前景。2000年，Akinbi等人為了在體內(nèi)檢測(cè)溶菌酶在呼吸系統(tǒng)的作用，他們制備了在呼吸道上皮細(xì)胞表達(dá)大鼠溶菌酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。這種轉(zhuǎn)基因小鼠能提高在肺部對(duì)細(xì)菌的殺傷能力5-30倍。由此可見(jiàn)，利用轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)具有生物活性的溶菌酶的方法是可行的，并且有著巨大的潛在應(yīng)用前景。第三個(gè)階段，近年來(lái)，人們開(kāi)始利用植物實(shí)驗(yàn)體系表達(dá)溶菌酶，在這方面已取得了很大進(jìn)展。1997年，Nakajima等人的研究結(jié)果表明低水平的溶菌酶也可以在煙草葉表達(dá)，并且可以提高植物抗真菌和細(xì)菌的活性。2000年，Takaichi和Oeda利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)也成功地在胡蘿卜根中表達(dá)了人溶菌酶。Ahreholta等人將T4溶菌酶基因轉(zhuǎn)移到馬鈴薯里。發(fā)現(xiàn)馬鈴薯的根部上皮細(xì)胞可以表達(dá)T4溶菌酶并釋放根表面的薄膜層。T4溶菌酶具有活性，可以殺死細(xì)菌。而且，這種殺菌能力不依賴于植物的年齡和生長(zhǎng)環(huán)境。2002年，一個(gè)密碼子優(yōu)化的人工合成的溶菌酶基因通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)到水稻愈傷組織，重組的溶菌酶可以在水稻懸浮細(xì)胞里表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到大約可溶性蛋白的4％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ramy3D信號(hào)肽可以被正常剪切，并且具有和人溶菌酶同樣的生物活性。以上研究結(jié)果顯示利用植物表達(dá)具有生物活性的溶菌酶是可行的?？梢韵胂?，含有人溶菌酶的水果和食物一定會(huì)人們的生活帶來(lái)福音。
從上述對(duì)人溶菌酶轉(zhuǎn)基因的研究表明，還沒(méi)有見(jiàn)到人溶菌酶在大型牲畜方面的轉(zhuǎn)基因克隆報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述技術(shù)領(lǐng)域的空白，將轉(zhuǎn)基因、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和克隆技術(shù)相結(jié)合，提供一種生產(chǎn)重組人溶菌酶的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器——人溶菌酶轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，以實(shí)現(xiàn)“牛奶人乳化”。
生產(chǎn)重組人溶菌酶的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器——人溶菌酶轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，其操作步驟如下(1)構(gòu)建含有人溶菌酶基因的乳腺特異表達(dá)載體，(2構(gòu)建雙標(biāo)記選擇載體和單標(biāo)記選擇載體，通過(guò)電擊方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，(3)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為核供體進(jìn)行體細(xì)胞克隆，獲得轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物。
所述人溶菌酶基因含有人溶菌酶基因信號(hào)肽序列，1-4外顯子，1-3內(nèi)含子。
所述人溶菌酶基因的特異表達(dá)載體是pBC1-HLY或pBC2-HLY。
所述人溶菌酶基因還含有牛beta-casein信號(hào)肽序列，1-4外顯子，1-3內(nèi)含子。
所述人溶菌酶基因的特異表達(dá)載體是pBC1-sigHLY或pBC2-sigHLY，pBC2是在pBC1的6407-6438bp處缺失31bp所構(gòu)建的載體，重組人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中表達(dá)的人溶菌酶與天然人溶菌酶大小一致，具有與天然人乳中溶菌酶相同的免疫活性。
所述雙標(biāo)記選擇載體是pBC2-sigHLY-EGFP-NEO，單標(biāo)記選擇載體是pBC2-sigHLY-NEO。
所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是通過(guò)G418進(jìn)行篩選獲得的陽(yáng)性細(xì)胞。
所述大型家畜為牛、山羊、綿羊、豬或兔。
所述大型家畜為牛。
為了制備高效表達(dá)人溶菌酶的奶牛乳腺生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)重組人溶菌酶，本實(shí)驗(yàn)室首先建立了乳腺高效表達(dá)人溶菌酶的小鼠模型，構(gòu)建了pBC1-hLY、pBC2-hLY、pBC1-sighLY和pBC2-sighLY四種不同的溶菌酶基因表達(dá)載體。利用顯微注射方法注射原核期小鼠胚胎制備轉(zhuǎn)基因小鼠。
pBC-hLY溶菌酶表達(dá)載體包含溶菌酶基因的編碼序列(含溶菌酶信號(hào)肽)、山羊beta-casein啟動(dòng)子、終止子及其部分不編碼的外顯子和內(nèi)含子。經(jīng)顯微注射共獲得6只為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠，經(jīng)Western Blotting檢測(cè)，在3只存活轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性母鼠的乳汁中，可以檢測(cè)到重組人溶菌酶的表達(dá)。其中6號(hào)轉(zhuǎn)基因小鼠的溶菌酶表達(dá)量達(dá)到0.2mg/ml，34號(hào)的表達(dá)量為0.12mg/ml，41號(hào)沒(méi)有檢測(cè)到重組溶菌酶的表達(dá)。經(jīng)溶菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)及對(duì)重組溶菌酶比活力的計(jì)算，重組溶菌酶具有同人溶菌酶相似的比活力。
pBC2-sigHLY溶菌酶表達(dá)載體包含溶菌酶基因的編碼序列(含牛beta-casein信號(hào)肽)，而pBC2是在pBC1的6407-6438bp處缺失31bp(GAATTCATTTCCTAATCATGCAGATTTCTAG)所構(gòu)建的載體。將pBC2-sigHLY載體進(jìn)行小鼠原核胚的顯微注射獲得轉(zhuǎn)人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，三只陽(yáng)性小鼠乳汁中有兩只能檢測(cè)到重組人溶菌酶的高效表達(dá)，分別為2mg/ml和0.5mg/ml；經(jīng)溶菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，表明重組人溶菌酶具有溶菌活性，其中61號(hào)小鼠的酶活性為2160U/ml、63號(hào)948U/ml，陰性小鼠的酶濃度為25.98U/ml，人的為1224U/ml。與陰性小鼠相比，61號(hào)轉(zhuǎn)基因小鼠乳清的溶菌酶活性提高了83倍，63號(hào)提高了36倍。與人奶相比，61號(hào)小鼠奶的酶活性提高了近一倍，而63號(hào)也比較接近人奶的溶菌酶活性。表明我們構(gòu)建的pBC2-sigHLY表達(dá)載體能在動(dòng)物乳腺中高效表達(dá)有溶菌活性的重組人溶菌酶。而且pBC2-sigHLY表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因小鼠奶中人溶菌酶的表達(dá)量及活性明顯高于我們構(gòu)建的含自身信號(hào)肽序列的人溶菌酶表達(dá)載體pBC1-HLY(＜0.2mg/ml和480U/ml)。
本發(fā)明探索和完善了轉(zhuǎn)基因技術(shù)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)和體細(xì)胞克隆技術(shù)相結(jié)合生產(chǎn)攜帶外源功能基因(包括山羊beta-酪蛋白5’和3’調(diào)控元件，目的基因的編碼區(qū))的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的途徑，并極大提高了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，特別是轉(zhuǎn)基因大家畜的制作效率，本發(fā)明所使用的技術(shù)路線適用于轉(zhuǎn)基因牛、山羊、綿羊、豬和兔的基礎(chǔ)群生產(chǎn)和擴(kuò)繁。
目前商業(yè)化的人溶菌酶主要從人乳汁、中性粒細(xì)胞和尿液等中提取，然而這種資源畢竟非常有限，所以我們利用體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因牛，從而通過(guò)高產(chǎn)奶牛的乳腺大量生產(chǎn)具有活性的人溶菌酶，既可開(kāi)發(fā)出具有高附加值的保健牛奶，也可純化出人溶菌酶并開(kāi)發(fā)成藥品和保健品。本發(fā)明所研究的重組人溶菌酶，具有與天然人溶菌酶相同的生物活性；含有重組人溶菌酶的牛奶可以開(kāi)發(fā)成保健牛奶及奶制品；純化的重組人溶菌酶可以開(kāi)發(fā)成防腐劑、食品添加劑、保健品和藥品。


圖1溶菌酶基因表達(dá)載體pBC1-hLY的物理圖譜其中Pcasein為pBC1上的山羊beta-casein啟動(dòng)子，Casein E1-E2為山羊beta-casein非編碼的第1，2外顯子，Casein E7-E8-E9為山羊beta-casein非編碼的第7，8及9外顯子，Casein 3`genome DNA為山羊beta-casein 3’端調(diào)控序列。
圖2pBC1-hLY轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的PCR檢測(cè)0非轉(zhuǎn)基因小鼠基因組，+人的基因組；6、30、34、41、48、50分別為PCR檢測(cè)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠圖3pBC1-hLY轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的Southern blot檢測(cè)0非轉(zhuǎn)基因小鼠基因組，6、30、34、41、48、50分別為PCR檢測(cè)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠，陽(yáng)性對(duì)照包括3條帶(10、5、1)，分別相當(dāng)于基因組的10、5、1拷貝。
圖4pBC1-hLY轉(zhuǎn)基因母鼠乳汁的Western Blot檢測(cè)41，34，6為轉(zhuǎn)基因母鼠奶樣，human為人奶對(duì)照，CK為陽(yáng)性對(duì)照。
圖5人溶菌酶基因編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增。
M為1kb DNA marker，1為hly的PCR產(chǎn)物圖6利用XhoI和KpnI對(duì)p7zf-sighLY11進(jìn)行酶切鑒定M為1kb DNA marker，11為p7zf-sighLY11質(zhì)粒DNA，KpnI為p7zf-sighLY11被KpnI酶切結(jié)果，XhoI為p7zf-sighLY11被KpnI酶切結(jié)果。
圖7利用XhoI酶切對(duì)pBC2-sighLY13進(jìn)行鑒定M為1kb DNA marker，13為pBC-sighLY13質(zhì)粒DNA，BC1為pBC1質(zhì)粒DNA，XhoI為XhoI酶切pBC-sighLY13結(jié)果。
圖8pBC2-sighLY13方向鑒定M為1kb DNA marker，13為pBC-sighLY13質(zhì)粒DNA，CalI為CalI酶切pBC2-sighLY13結(jié)果，KpnI為KpnI酶切pBC2-sighLY13結(jié)果。
圖9溶菌酶表達(dá)載體pBC2-sighLY的物理圖譜其中Pcasein為pBC2上的山羊beta-casein啟動(dòng)子，Casein E1-E2為山羊beta-casein非編碼的第1，2外顯子，Casein E7-E8-E9為山羊beta-casein非編碼的第7，8及9外顯子，Casein 3`genome DNA為山羊beta-casein 3’端調(diào)控序列。
圖10pBC2-sighLY轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的PCR檢測(cè)M為1kb DNA marker，0為陰性對(duì)照，h為陽(yáng)性對(duì)照，6，12，43，61和63為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠。
圖11pBC2-sighLY轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的Southern blot檢測(cè)M為1kb DNA marker，0為陰性對(duì)照，h為陽(yáng)性對(duì)照，6，12，43，61和63為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠，1，3，5分別為陽(yáng)性對(duì)照的1，3和5個(gè)拷貝。
圖12pBC2-sighLY轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性母鼠乳汁的Western Blot檢測(cè)CK為陰性小鼠奶樣，12，61和63為轉(zhuǎn)基因小鼠奶樣，human為人乳對(duì)照。
圖13雙標(biāo)記選擇載體pEGFP-NEO的結(jié)構(gòu)圖
EGFP為增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因，NEO為新霉素抗性基因，IRES為核糖體結(jié)合位點(diǎn)，SalI，NotI，AscI和BamHI為酶切位點(diǎn)，CMV-IE Enhancer為CMV-IE增強(qiáng)子，pEF321為EF321啟動(dòng)子圖14單標(biāo)記選擇載體pNEO的結(jié)構(gòu)圖NEO為新霉素抗性基因，SalI，NotI，AscI和BamHI為酶切位點(diǎn)，pPGK為PGK啟動(dòng)子，Amp為氨芐抗性基因圖15pBC2-sighLY-EGFP-NEO酶切后的線性圖譜b-casein promoter為pBC1上的山羊beta-casein啟動(dòng)子，human lysozyme gene為人溶菌酶基因(含牛b-casein序列)，GFP為增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因，Neomycin為新霉素抗性基因圖16pBC2-sighLY-NEO酶切后的線性圖譜b-casein promoter為pBC2上的山羊beta-casein啟動(dòng)子，human lysozyme gene為人溶菌酶基因(含牛b-casein序列)，GFP為增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因，Neomycin為新霉素抗性基因圖17hLY引物的擴(kuò)增結(jié)果。
M1kb ladder；1盼娃；2金娃；3陽(yáng)性對(duì)照；4陰性對(duì)照；5blank圖18hLY引物的擴(kuò)增結(jié)果。
M1kb ladder；1329號(hào)牛；20365號(hào)牛；3為020613，4陽(yáng)性對(duì)照；5陰性對(duì)照；6blank圖19NEO引物的擴(kuò)增結(jié)果。
M1kb ladder；1盼娃；2金娃；3陽(yáng)性對(duì)照；4陰性對(duì)照；5blank圖20NEO引物的擴(kuò)增結(jié)果M1kb ladder；1陰性對(duì)照；2329號(hào)牛；30365號(hào)牛；4為020613，5陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D21EGFP引物的擴(kuò)增結(jié)果。
M1kb ladder；1329號(hào)牛；20365號(hào)牛；3為020613，4陽(yáng)性對(duì)照；5陰性對(duì)照；6blank圖22pBC2引物擴(kuò)增結(jié)果泳道1，4為普通克隆?；蚪MDNA，泳道2，3分別為轉(zhuǎn)pBC2-sighLY基因克隆?；蚪MDNA，泳道5為pBC2-sighLY-NEO(在pBC上有缺失)質(zhì)粒DNA，泳道6為pBC2-sighLY轉(zhuǎn)基因小鼠DNA，泳道7為完整pBC1，泳道8為非克隆牛DNA，泳道9為空白對(duì)照。
圖23hLY轉(zhuǎn)基因克隆牛的Southern結(jié)果泳道1為盼娃，泳道2為金娃，泳道3-5為陰性對(duì)照，泳道6-8分別為1，2和5個(gè)拷貝的陽(yáng)性對(duì)照。
圖24p7zf-sighLY11質(zhì)粒測(cè)得序列的比對(duì)結(jié)果beta-casein的信號(hào)肽序列用下劃線和黑體標(biāo)明；外顯子1的序列用下劃線標(biāo)出；XhoI和Csp45I酶切位點(diǎn)用灰色標(biāo)明圖25載體外顯子2的測(cè)序結(jié)果及其與溶菌酶基因序列的比對(duì)外顯子2的序列由下劃線和黑體標(biāo)出，上行為外顯子2的測(cè)序序列，下行為溶菌酶的基因序列。
圖26載體外顯子3的測(cè)序結(jié)果及其與溶菌酶基因序列的比對(duì)顯子3的序列用下劃線和黑體標(biāo)出。上行為溶菌酶的基因序列，下行為外顯子3及其側(cè)翼序列。
圖27外顯子4的測(cè)序結(jié)果及其與溶菌酶基因序列的比對(duì)外顯子4的序列用下劃線標(biāo)出，其中的編碼序列又用黑體表明。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)步的詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)材料1.1質(zhì)粒及菌株宿主菌大腸桿菌DH5α和DH10B，pBC1 milk expression vector kit和PCR-XL-TOPO vector購(gòu)自Invitrogen公司，pCMV-EGFP-IRES-NEO和pIRES-NEO購(gòu)自Clontech公司，pGEM-7zf購(gòu)自Promega公司，BAC RP11-1143G9購(gòu)于美國(guó)基因公司1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Holstein奶牛約3月齡的胎兒取自屠宰場(chǎng)，黃牛卵巢來(lái)自北京周邊地區(qū)屠宰場(chǎng)。
1.3主要試劑DMEM/F12粉末、DMEM粉末培養(yǎng)基、臺(tái)盼藍(lán)(trypan blue)、TCM199粉末，谷氨酰胺和G418為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；dNTP以及PCR引物購(gòu)于上海生物工程公司；Taq酶購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室；內(nèi)切酶SspI和BamHI為華美生物工程公司產(chǎn)品；IPTG、X-gal、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)均購(gòu)自華美生物公司；飽和酚為鼎國(guó)生物工程公司產(chǎn)品；胰蛋白酶、青霉素鏈霉素、EDTA、Hepes、FSH，LH，17β-E2，EGF，透明質(zhì)酸酶，HEPES，無(wú)脂肪酸BSA，細(xì)胞松弛素B，Hoechest33342，cycloheximide，A23187，6-DMAP，D-甘露醇，丙酮酸鈉，肝素鈉，礦物油和其它無(wú)機(jī)鹽均為Sigma公司產(chǎn)品。
1.4培養(yǎng)基的配制SOB培養(yǎng)基配置每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水加入蛋白胨20g酵母提取物5g NaCl 0.5g.搖動(dòng)容器室溶質(zhì)完全溶解，然后加入250mmol/L KCl溶液10ml，用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)到pH7.0。滅菌LB液體培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCL10g，溶于800ml水中，調(diào)節(jié)PH值至7.5，定容制1000ml，高壓滅菌。
LB固體培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCL10g，溶于800ml水中，加脂粉15g，調(diào)節(jié)pH值至7.5，定容至1000ml，高壓滅菌。
1.5試劑的配制DMEM培養(yǎng)液DMEM粉末13.4g，NaHCO33.7g，青霉素66mg，鏈霉素100mg，Mill-Q超純水定容到1升，PH 7.0-7.4，滲透壓為280-320mOsm/kg，用0.2μm濾膜過(guò)濾滅菌，4℃保存。使用時(shí)加10％的血清。
0.1％Trypsin/EDTA酶消化液Trypsin 0.1g，KCl 0.04g，NaHCO3，NaCl 0.8g，EDTA 0.02g，用滅菌的Mill-Q超純水溶解，定容至100ml，用0.2μm濾膜過(guò)濾滅菌，-20℃保存。
DPBS液DPBS粉末9.7g，Mill-Q超純水定容到1升，PH 7.0-7.2，用0.2μm濾膜過(guò)濾滅菌，4℃保存。無(wú)鈣鎂PBS溶液KCl 0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO412H2O 2.88g，Mill-Q超純水定容到1升，PH7.0-7.4，滲透壓為280-320mOsm/kg，用0.2μm濾膜過(guò)濾滅菌，4℃保存。
Gimsa母液Gimsa粉末0.5g，加少量甘油將Gimsa粉末在研缽中充分研磨。再加入甘油至總量為22ml，56℃保溫2h，然后再加入33ml甲醇，保存在棕色試劑瓶中，備用。
細(xì)胞裂解液10mM Tris.Cl(PH 8.0)，0.1M EDTA(PH8.0)，0.5％SDS。
蛋白酶K貯存液蛋白酶K100mg，溶于5mL滅菌水中，分裝，-20度保存。
TBS液NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tris.Cl 3.0g，溶于1L重蒸水中，高壓滅菌。
G418貯液1g G418溶于1mL 1mol/mL HEPES溶液中(PH7.0-7.2)，加Mill-Q10mL，過(guò)濾滅菌，-20度保存。
兩倍電擊緩沖液(2×HeBS)280mM Nacl、10mM Kcl、1.5mM Na2HPO4、12mM Glucose、50mM Hepes，PH7.0-7.4，過(guò)濾滅菌，1mL分裝，-20度保存。
1Mol/L Tris.Cl(pH8.0)121.1gTris堿溶于800ml水中，用HCl調(diào)PH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。0.5Mol/L EDTA(pH8.0)126.1g乙二胺四乙酸二鈉加入到800ml水中，用NaOH調(diào)PH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
RNase溶液將RNaseA溶于10mMol/L Tris.Cl(pH7.5)，5mMol/L NaCL中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20℃。
TE緩沖液10mMol/L NaCL，10mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mMol/L EDTA(pH8.0)，高壓滅菌。5mol/L LiCl30.2g氯化鋰二水(LiCl.2H2O)完全溶于80ml水后，定容至100ml高壓滅菌。50×TAE242gTris堿，57.1ml冰乙酸，100ml0.5Mol/L EDTA(pH8.0)，溶解后定容至1000ml。氨芐青霉素(Amp)貯存液將氨芐青霉素鈉溶于滅菌水后用0.22μm的濾器過(guò)濾除菌，配制成100mg/ml，保存于-20℃。
3mol/L NaAc(pH5.2)24.604g無(wú)水乙酸鈉溶于80ml水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2，定容至100ml，高壓滅菌。
1mol/L CaCl2在200ml水中溶解54gCaCl2.6H2O，過(guò)濾除菌，分裝成10ml每份，貯存于-20℃，制備感受態(tài)時(shí)取出一份稀釋至100ml，過(guò)濾除菌，預(yù)冷備用。
溴化乙錠貯存液在100ml水中加入1g溴化乙錠，溶解后于4℃棕色瓶?jī)?nèi)保存。
DNA提取抽提緩沖液50mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，100mMol/L EDTA(pH8.0)，100mMol/L NaCl，1％SDS。
2×Cracking buffer0.2N NaOH，0.5％SDS，20％蔗糖。
酚∶仿(1∶1)等體積苯酚、氯仿混合，保存于4℃棕色瓶中。
蛋白酶K溶液用水配成20mg/ml，-20℃保存。
TCM199培養(yǎng)液稱TCM199粉末9.9g，NaHCO32.2g，丙酮酸鈉0.1375g，EDTA 0.372g，用1L超純水定容，PH7.2-7.4，正壓過(guò)濾滅菌，4℃保存。培養(yǎng)用工作液中加入10％FCS。
操作液H199在含有25mM Hepes的TCM199中加入10％FCS。
沖卵液DPBS溶液中加入10％FCS。
透明質(zhì)酸酶透明質(zhì)酸酶0.2g，溶于10ml無(wú)鈣DPBS溶液中，過(guò)濾滅菌，-20℃貯存。
工作液用沖卵液稀釋10倍。
融合液0.3M甘露醇，0.1mM MgSO4，0.05mM CaCl2，0.5mMHEPES，0.05％BSA，調(diào)PH至7.2-7.4，過(guò)濾滅菌。
成熟培養(yǎng)液M199培養(yǎng)液中加入10％FBS，10u/ml FSH，100U/ml LH，1ug/ml estradiol，100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素。
CRlaa培養(yǎng)液成份 終濃度(mM) 加入量g/100mlNaCl 114.70.67KCl3.1 0.023NaHCO326.2 0.22Na Pyruvate20.4 0.002Phenol Red 1μl/ml 100μl將上述成份加入90ml ddH2O中，待所有試劑徹底溶解后，加入0.055g Hemicalcium L-lactate(5mM)。調(diào)整pH為7.4，用ddH2O加到100ml，滲透壓為265-285mOsm之間。過(guò)濾滅菌。
1.6主要儀器設(shè)備
1)CO2培養(yǎng)箱美國(guó)Forma Scientific Inc.
2)倒置顯微鏡和熒光顯微鏡日本Nikon公司3)培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、離心管和細(xì)胞凍存管Nunc公司4)電擊儀美國(guó)BTX公司(ECM2001)5)電泳儀DYY-III2穩(wěn)壓電泳儀，北京六一儀器廠6)超凈工作臺(tái)北京凈化設(shè)備廠7)-80℃超低溫冰箱日本SANYO公司8)制冰機(jī)日本SANYO公司9)超純水儀美國(guó)MILLIPORE公司10)低溫離心機(jī)Eppendorf公司11)高速冷凍離心機(jī)BECKMAN公司12)凝膠成像系統(tǒng)ALPHA INNOTECH公司13)PHS-3C酸度計(jì)上海虹益儀器廠14)自動(dòng)滅菌鍋日本SANYO公司15)測(cè)序儀ABI 377型DNA sequencer，美國(guó)PERKIN ELMER公司16)恒溫水浴儀美國(guó)LIFESCIENCE公司17)9700型PCR儀美國(guó)PERKIN ELMER公司18)ABI 377 DNA測(cè)序儀美國(guó)PERKIN ELMER公司1.7分析工具軟件及網(wǎng)址同源性分析軟件DNAMANPCR引物設(shè)計(jì)軟件Oligo4.0DNA序列分析軟件ChromasDNA及蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI/GenBank/Nucleotides，Protein2實(shí)驗(yàn)方法2.1載體構(gòu)建2.1.1 pBC1-hLY表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因小鼠模型建立1)pBC1-hLY表達(dá)載體的構(gòu)建策略首先利用長(zhǎng)片段PCR的方法獲得溶菌酶基因的編碼區(qū)，將其克隆到PCR-XL-TOPO vector上，并進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證。然后再把它連接到乳腺特異表達(dá)載體pBC1上，經(jīng)插入方向和測(cè)序鑒定，最后得到溶菌酶的表達(dá)載體。
2)人溶菌酶基因編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增溶菌酶基因全長(zhǎng)6807bp，含有4個(gè)外顯子。mRNA(519-682，2246-2410，4349-4427，5281-6374)和CDS(601-682，2246-2410，4349-4427，5281-5347)，起始密碼子位于547位點(diǎn)，TATAbox位于491-496位置。為了得到溶菌酶編碼區(qū)片段，我們以溶菌酶基因組DNA序列為模版設(shè)計(jì)引物進(jìn)行DNA擴(kuò)增。設(shè)計(jì)的引物為上游5`CCC TCG AGA CTC TGA CCT AGC AGT CAA C 3`，下游5`CCG CTC GAG TCTGTT TCT ATC ATT TGG 3`，5`端分別含有XhoI酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)5652bp，包含溶菌酶基因信號(hào)肽部分的DNA片段。PCR條件94℃ 3min，94℃ 1min，60℃ 1min，68℃ 5min，68℃ 10min，4℃ 1h；30cycles.PCR擴(kuò)增出1條約5.5kb的特異片段，于是我們把這個(gè)PCR產(chǎn)物回收回來(lái)，克隆到pPCR-XL-TOPO載體上。
3)人溶菌酶基因編碼區(qū)DNA片段的克隆為了對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和驗(yàn)證，我們首先把它克隆到PCR-XL-TOPO vector上得到pTOPO-hLY重組載體。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后，進(jìn)行培養(yǎng)，最后提取質(zhì)粒。對(duì)獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定。
4)pBC1-hLY expression vector的構(gòu)建本發(fā)明采用pBC1作為構(gòu)建乳腺表達(dá)載體的骨架載體，pBC1為Invotrogen公司的商業(yè)化乳腺表達(dá)載體，全長(zhǎng)為21628bp，包含山羊beta-casein啟動(dòng)子，外顯子1、2和7、8、9的非編碼區(qū)，beta-casein 3`中止子區(qū)和2拷貝的beta-globin隔離子，以及原核序列。其中在山羊beta-casein的外顯子2和7之間存在一個(gè)XhoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，用于將外源基因的編碼區(qū)連接上去。
在構(gòu)建溶菌酶基因表達(dá)載體時(shí)，我們首先分別對(duì)pBC1和pTOPO-hLY進(jìn)行XhoI酶切與回收，再按1∶10的比例混勻于16℃過(guò)夜連接，再進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。挑單克隆菌落進(jìn)行搖菌提取質(zhì)粒，篩選重組質(zhì)粒pBC-hLY陽(yáng)性克隆。
5)酶切鑒定及PCR檢測(cè)XhoI酶切pBC-hLY陽(yáng)性質(zhì)粒，結(jié)果顯示可以切出一條5kb外源片段和21kb的pBC1的骨架片段，表明重組質(zhì)粒的XhoI位點(diǎn)已連入5kb外源片段。
為進(jìn)一步驗(yàn)證，我們以溶菌酶基因序列為模板設(shè)計(jì)引物上游5`TTA TAC ACA CGG CTT TAC 3`下游5`CAG CAT CAG CGA TGT TAT CT 3`PCR條件94℃ 5min，94℃ 40sec，53℃ 40sec，72℃ 40sec，72℃ 7min，4℃ 1∞；30cycles。結(jié)果顯示以4號(hào)和12號(hào)質(zhì)粒為模板可以擴(kuò)增到與以含人溶菌酶基因BAC為模板大小相同的DNA片段，表明人溶菌酶基因編碼區(qū)已經(jīng)連接到pBC1載體上6)方向鑒定由于上述連接屬于單酶切位點(diǎn)連接，所以必須進(jìn)行插入片段的方向鑒定。我們選擇限制性內(nèi)切酶Drd進(jìn)行方向鑒定，有一個(gè)Drd位點(diǎn)位于溶菌酶基因5`端(538)，同時(shí)在pBC1上也存在相應(yīng)酶切位點(diǎn)(2442、12109、12219、15035、17540、17953)。根據(jù)酶切產(chǎn)物的DNA片段大小，可以判斷外源片段的插入方向。
7)測(cè)序驗(yàn)證為了保證該表達(dá)載體序列的正確性，我們又對(duì)pBC1-hLY陽(yáng)性質(zhì)粒的外顯子1-4的部分進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明在PCR過(guò)程中，沒(méi)有造成溶菌酶基因外顯子部分序列的突變，連入pBC1的是完好的人溶菌酶基因基因組DNA。
8)pBC1-hLY轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立及檢測(cè)(1)pBC1-hLY expression vector的NotI和SalI酶切片段的回收與檢測(cè)pBC1-hLY expressionvector的物理圖譜如圖1所示，本實(shí)驗(yàn)用NotI和SalI雙酶切，除去質(zhì)粒的多余部分，用Qigen試劑盒回收約26kb大小的片段，溶于轉(zhuǎn)基因?qū)Ｓ肨E，調(diào)整DNA濃度為2μg/ml。
(2)顯微注射共注射受精卵1200枚，移植受體鼠70只，受孕鼠32只，共生小鼠83只(3)轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR檢測(cè)取2-3周齡轉(zhuǎn)基因小鼠的尾巴組織樣，提取DNA。用前面已使用過(guò)的一對(duì)引物(上游5`TTA TACACA CGG CTT TAC 3`下游5`CAG CAT CAG CGA TGT TAT CT 3`)分別對(duì)小鼠DNA樣PCR擴(kuò)增，以普通小鼠基因組作為陰性對(duì)照，以人基因組作為陽(yáng)性對(duì)照，如圖2所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有6只小鼠為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠，分別為6、30、34、41、48和50號(hào)。小鼠擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物與陽(yáng)性對(duì)照一致，咱們這些小鼠為攜帶有pBC-hLY的轉(zhuǎn)基因小鼠(4)轉(zhuǎn)基因小鼠的Southern blot檢測(cè)將PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的6只小鼠尾巴組織樣DNA，取大約10μg用PstI內(nèi)切酶消化，低壓慢速電泳，轉(zhuǎn)膜后，進(jìn)行Southern雜交，雜交所用探針為α-P32dCTP同位素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。以pBC-hLY質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以陰性小鼠基因組為陰性對(duì)照，雜交可得到5kb片段。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明6、30、34、41、48和50號(hào)轉(zhuǎn)基因小鼠均為陽(yáng)性小鼠，與PCR檢測(cè)結(jié)果一致，而陰性小鼠的基因組(0)沒(méi)有雜交信號(hào)。根據(jù)Southern雜交信號(hào)強(qiáng)度，估算轉(zhuǎn)基因小鼠的外源基因整合的拷貝數(shù)。6、48號(hào)，3拷貝；30號(hào)，1拷貝；34、41號(hào)，2拷貝；50號(hào)，8拷貝。
(5)轉(zhuǎn)基因小鼠的Western blot檢測(cè)在轉(zhuǎn)基因小鼠生仔鼠后的第5天，采集乳汁。將采集的乳汁進(jìn)行4500rpm離心10min，去除乳脂。加入2倍體積滅菌水，調(diào)pH值至4.0左右去除酪蛋白，最后將pH值調(diào)到8.0，將乳清保存于-70℃冰箱。通過(guò)雜交的結(jié)果估算轉(zhuǎn)基因小鼠的溶菌酶的表達(dá)含量人乳汁溶菌酶的含量為0.5mg/ml，由此可以初步估測(cè)，6號(hào)乳清重組溶菌酶含量為0.2mg/ml；34號(hào)乳清重組溶菌酶含量為0.12mg/ml；41號(hào)沒(méi)有表達(dá)。(圖4)從圖中可看出34，6號(hào)小鼠奶樣可以檢測(cè)到重組人溶菌酶的表達(dá)，初步估測(cè)，6號(hào)乳清重組溶菌酶含量為0.2mg/ml；34號(hào)乳清重組溶菌酶含量為0.12mg/ml；41號(hào)沒(méi)有表達(dá)(6)、重組人溶菌酶的活性檢測(cè)a.溶菌酶對(duì)溶壁微球菌溶菌作用的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立配置標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶，濃度分別為50、75、100、125、150、175、200U/mL。取90ul細(xì)菌懸浮液置于比色皿中，加入酶液10ul，迅速用移液器吹勻，測(cè)定450nm下的光吸收值(OD450)。從加入酶液起計(jì)時(shí)，每隔1min記錄1次，每組數(shù)據(jù)要重復(fù)3次以上。以0至1分鐘的OD450的差值的平均值作為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)酶的濃度作為橫坐標(biāo)來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，我們可以得到回歸方程y＝0.0005x-0.002，y代表OD450的差值，x代表酶活力(U/ml)。由此公式可推導(dǎo)出x＝2000(y+0.002)。在乳清的制備過(guò)程中，被稀釋3倍，所以，乳清的酶活力計(jì)算公式為x＝2000(y+0.002)×3。
b.重組人溶菌酶的活性檢測(cè)根據(jù)上述方法，分別測(cè)定轉(zhuǎn)基因小鼠、人、陰性小鼠乳清對(duì)溶壁微球菌作用的OD450值變化，測(cè)定三次，取0至1分鐘的OD450差值。根據(jù)x＝2000(y+0.002)×3公式可以計(jì)算乳清中溶菌酶的濃度。轉(zhuǎn)基因小鼠6號(hào)的酶活力為480U/ml、34號(hào)301U/ml、41號(hào)37.98U/ml，陰性小鼠的酶活力為25.98U/ml，人的為1224U/ml。由此可見(jiàn)，與陰性小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠乳清的溶菌酶酶活力有非常明顯提高，其中6號(hào)小鼠提高了18倍，34號(hào)提高了11倍，但41號(hào)幾乎沒(méi)有提高。與人乳清相比，轉(zhuǎn)基因小鼠乳清中的溶菌酶酶活力度相對(duì)較低，其中6號(hào)占2/5，34號(hào)占1/4。由此可見(jiàn)，重組人溶菌酶的表達(dá)可以顯著提高小鼠乳汁中溶菌酶的活力，表明通過(guò)乳腺表達(dá)的重組人溶菌酶具有溶菌的生物學(xué)活性。
2.1.2 pBC2-sigHly表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因小鼠模型建立1).pBC2-sighLY表達(dá)載體的構(gòu)建策略為了構(gòu)建含有beta-casein信號(hào)肽DNA序列的溶菌酶表達(dá)載體，我們?cè)O(shè)計(jì)了如下構(gòu)建表達(dá)載體的策略。首先合成牛beta-casein信號(hào)肽DNA序列，5’和3’端分別含有XhoI和Csp45I，利用這兩個(gè)酶切位點(diǎn)連到pGEM-7zf質(zhì)粒上得到p7zf-sig質(zhì)粒。再利用長(zhǎng)片段PCR方法擴(kuò)增人溶菌酶基因的編碼區(qū)序列，5’端有Csp45I酶切位點(diǎn)，3’端依次有XhoI和HindIII兩個(gè)酶切位點(diǎn)。利用Csp45I和HindIII酶切位點(diǎn)連到p7zf-sig上得到p7zf-sighLY質(zhì)粒。構(gòu)建pBC2載體，用XhoI將牛信號(hào)肽和溶菌酶編碼區(qū)融合序列切下來(lái)，連到pBC2的XhoI位點(diǎn)。
2).牛beta-casein信號(hào)肽的設(shè)計(jì)與合成為了獲得牛beta-casein信號(hào)肽，我們分別合成了兩條單鏈DNA序列。序列分別為正向5`TCGAGATGA AGGTCCTCAT CCTTGCCTGC CTGGTGGCTC TGGCCCTTGC AAAGGTCTT 3`，反向5`C GAAGACCTTT GCAAGGGCCA GAGCCACCAG GCAGGCAAGG ATGAGGACCT TCATC3`。黑體劃線部分序列為牛beta-casein信號(hào)肽DNA序列。將兩條單鏈DNA退火成雙鏈后，5`端會(huì)形成XhoI酶切位點(diǎn)部分，3`端形成Csp45I酶切位點(diǎn)部分。將已合成的信號(hào)肽DNA溶解，終濃度達(dá)825ng/μl。然后各取10μl混勻，沸水煮5分鐘進(jìn)行變性，然后室溫冷卻進(jìn)行退火，這樣就可以形成5`端和3`端分別包含XhoI和Csp45I部分酶切位點(diǎn)的牛beta-casein信號(hào)肽DNA3).牛beta-casein信號(hào)肽DNA的克隆我們利用牛beta-casein信號(hào)肽DNA上的XhoI和Csp45I部分酶切位點(diǎn)將其連接到pGEM-7zf載體上得到p7zf-sig重組質(zhì)粒。為了鑒定連上信號(hào)肽的重組質(zhì)粒，我們利用KpnI進(jìn)行酶切鑒定。由于在7zf質(zhì)粒XhoI和Csp45I之間連上信號(hào)肽DNA片段，原有的KpnI酶切位點(diǎn)被去掉。因此，p7zf-sig不能被KpnI切開(kāi)，而pGEM-7zf可以被切開(kāi)。同時(shí)，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，再次證實(shí)信號(hào)肽序列已連到pGEM-7zf上，并完全正確。
4).溶菌酶基因編碼區(qū)(不含信號(hào)肽序列)的獲得為了獲得人溶菌酶基因的編碼區(qū)，我們利用探針從BAC庫(kù)調(diào)取含有溶菌酶基因的BAC克隆(BACRP11-1143G9)。在含有氯霉素的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，進(jìn)行搖菌。然后按上述方法提取BAC，，濃度約為100ng/L。接下來(lái)，我們用BAC RP11-1143G9作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)獲得溶菌酶基因的編碼區(qū)序列片段。
為了得到溶菌酶編碼區(qū)(不含信號(hào)肽序列)片段，我們以溶菌酶基因組DNA序列為模版設(shè)計(jì)引物進(jìn)行DNA擴(kuò)增。設(shè)計(jì)的引物為上游5`ATT CGA AAG GTG TGA GTT GGC CAG AAC TCT G 3`，5`端分別含有Csp45I酶切位點(diǎn)，下游5`TAA GCT TCT CGA GAC CAT CCT GGC TAA CAC G 3`，5`端包含HindIII和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)5255bp，不包含溶菌酶基因分泌肽部分的DNA片段。PCR條件94℃ 3min，94℃ 1min，60℃ 1min，68℃ 5min，68℃ 14min，4℃ 1∞；30cycles。再按上述的方法提取含有溶菌酶基因的BAC(RP11-1143G9)，以BAC為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR結(jié)果如下(圖5)。
5).PCR產(chǎn)物的克隆為了對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和驗(yàn)證，我們首先把它克隆到pPCR-XL-TOPO vector上得到pTOPO-sighLY重組載體。
6).p7zf-sighLY重組質(zhì)粒的獲得為了得到含有牛beta-casein信號(hào)肽DNA的溶菌酶基因編碼區(qū)，我們先利用HindIII和Csp45I將pTOPO-hLY重組載體上的溶菌酶基因編碼區(qū)(不含溶菌酶本身信號(hào)肽)切下來(lái)，連接到p7zf-sig質(zhì)粒上，從而得到牛beta-casein信號(hào)肽DNA和溶菌酶基因連在一起的重組質(zhì)粒p7zf-sighLY。為了鑒定p7zf-sighLY11為陽(yáng)性重組質(zhì)粒，利用KpnI和XhoI分別進(jìn)行酶切，由于在連接信號(hào)肽序列的過(guò)程中，KpnI酶切位點(diǎn)被去除，所以KpnI不能切開(kāi)重組質(zhì)粒。而由于信號(hào)肽的5’端和溶菌酶編碼區(qū)3’端分別含有XhoI酶切位點(diǎn)，所以酶切可以得到3kb的7zf骨架片段和5kb的信號(hào)肽和溶菌酶編碼區(qū)片段。酶切結(jié)果如圖6所示，證實(shí)11號(hào)質(zhì)粒確實(shí)為陽(yáng)性重組質(zhì)粒。
對(duì)p7zf-sighLY11進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明這個(gè)載體上包含牛beta-casein的信號(hào)肽序列和溶菌酶編碼區(qū)的部分序列，并且這些序列沒(méi)有發(fā)生任何突變。p7zf-sighLY11質(zhì)粒測(cè)得序列的比對(duì)結(jié)果如圖24，該測(cè)序結(jié)果表明beta-casein的信號(hào)肽序列與hly序列成功連接7).pBC-sighLY exprssion vector的構(gòu)建本發(fā)明采用pBC2作為構(gòu)建乳腺表達(dá)載體的骨架載體，pBC2是pBC1經(jīng)過(guò)修改所獲得的載體，即在pBC1的6407-6438bp處缺失31bp(GAATTCATTTCCTAATCATGCAGATTTCTAG)所構(gòu)建的載體。這段序列位于pBC1中beta-casein啟動(dòng)子區(qū)域，構(gòu)建pBC2的目的即是要檢測(cè)這段序列是否影響外源基因在哺乳動(dòng)物乳腺中的表達(dá)。
pBC2構(gòu)建過(guò)程如下用ClaI和XhoI酶切pBC1質(zhì)粒DNA，回收4kb的片段，通過(guò)ClaI和XhoI酶切位點(diǎn)與pGEM-7zf進(jìn)行連接獲得pGEM-CX1，通過(guò)EcoRI位點(diǎn)將缺失序列(pBC1 L1AATTCATTTCCTAATCATGCAGATTTCTAGG，和pBC1 L2AATTCCTAGAAATCTGCATGATTAGGAAATG，兩序列退火形成雙鏈)與pGEM-CX1連接得到pGEM-CX2，用ClaI和XhoI酶切pGEM-CX2并回收4kb的片段，通過(guò)ClaI和XhoI酶切位點(diǎn)與pBC1進(jìn)行連接即可獲得pBC2。
在構(gòu)建溶菌酶基因表達(dá)載體時(shí)，我們首先分別對(duì)pBC2和p7zf-sighLY進(jìn)行XhoI酶切與回收，再按1∶10的比例混勻于16℃過(guò)夜連接，再進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。挑單克隆菌落進(jìn)行搖菌提取質(zhì)粒，篩選組質(zhì)粒的XhoI位點(diǎn)已連入約5kb外源片段(如圖7)。由于上述連接屬于單酶切位點(diǎn)連接，所以必須進(jìn)行插入片段的方向鑒定。我們選擇限制性內(nèi)切酶KpnI和Csp45I與ClaI和Csp45I雙酶切進(jìn)行方向鑒定，Csp45I在外源片段的5’端有1個(gè)酶切位點(diǎn)，在pBC2上，ClaI酶切位點(diǎn)位于4529bp，KpnI位于13772bp，在19kb的位置存在一個(gè)Csp45I酶切位點(diǎn)。根據(jù)酶切產(chǎn)物的DNA片段大小，可以判斷外源片段的插入方向。13號(hào)重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果如圖8，表明13號(hào)重組質(zhì)粒為正向型重組質(zhì)粒。
8).載體外顯子部位的測(cè)序?yàn)榱吮ＷC所構(gòu)建溶菌酶基因表達(dá)載體的準(zhǔn)確性，我們要對(duì)載體的編碼區(qū)部位進(jìn)行測(cè)序。因?yàn)榍懊嬉呀?jīng)對(duì)外顯子1的部位完成了測(cè)序，所以這里主要對(duì)外顯子2、3、4進(jìn)行測(cè)序。如圖25、26、27.綜合測(cè)序的結(jié)果，表明pBC-sighLY表達(dá)載體的外顯子序列沒(méi)有發(fā)生任何突變和錯(cuò)配。這有利地保證了pBC-sighLY表達(dá)載體能夠正確轉(zhuǎn)錄和翻譯。
載體外顯子2的測(cè)序結(jié)果及其與溶菌酶基因序列的比對(duì)如圖25，經(jīng)比對(duì)，外顯子2的序列與溶菌酶基因本身序列完全一致。也顯示內(nèi)含子2的序列沒(méi)有發(fā)生突變。
載體外顯子3的測(cè)序結(jié)果及其與溶菌酶基因序列的比對(duì)如圖26，經(jīng)比對(duì)，外顯子3的序列也沒(méi)有發(fā)生任何突變。上行為溶菌酶的基因序列，下行為外顯子3及其側(cè)翼序列。
外顯子4的測(cè)序結(jié)果及其與溶菌酶基因序列的比對(duì)如圖27，經(jīng)與溶菌酶基因序列比對(duì)，CDS4和外顯子4均沒(méi)有發(fā)生突變。
10)pBC2-sighLY轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立及檢測(cè)(1).pBC2-sighLY expression vector的NotI和SalI酶切片段的回收與檢測(cè)用顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠，線形DNA比環(huán)形DNA整合效率高，因此必須將人pBC2-sighLY切成線形后(圖9)，方可進(jìn)行顯微注射；另外，多余的質(zhì)粒片段也影響DNA整合效率。所以本實(shí)驗(yàn)用NotI和SalI雙酶切，除去質(zhì)粒的多余部分，用Qigen試劑盒回收約26kb大小的片段，OD260/OD280值為1.75，將其濃度調(diào)至2ng/μl，通過(guò)顯微注射法建立轉(zhuǎn)基因小鼠。
(2).顯微注射共注射受精卵1500枚，移植受體鼠73只，受孕鼠34只，共生小鼠63只(3).轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR檢測(cè)取2-3周齡轉(zhuǎn)基因小鼠的尾巴組織樣，提取DNA。用前面已使用過(guò)的一對(duì)引物(上游5`TTA TACACA CGG CTT TAC 3`下游5`CAG CAT CAG CGA TGT TAT CT 3`)分別對(duì)小鼠DNA樣PCR擴(kuò)增，以普通小鼠基因組作為陰性對(duì)照，以人基因組作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有5只小鼠為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠，陽(yáng)性率為7.9％，如圖10.從檢測(cè)結(jié)果表明這些小鼠都轉(zhuǎn)有pBC-sighLY。
(4).轉(zhuǎn)基因小鼠的Southern blot檢測(cè)將PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的5只小鼠尾巴組織樣DNA，取大約10μg用PstI內(nèi)切酶消化，低壓慢速電泳，轉(zhuǎn)膜后，進(jìn)行Southern雜交，雜交所用探針為α-P32dCTP同位素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。雜交可得到5kb片段。結(jié)果如圖11所示，結(jié)果表明6、12、43、61和63號(hào)轉(zhuǎn)基因小鼠均為陽(yáng)性小鼠，與PCR檢測(cè)結(jié)果一致，而陰性小鼠的基因組沒(méi)有雜交信號(hào)(0)。轉(zhuǎn)基因小鼠拷貝數(shù)的計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照包括3條帶(5、3、1)，分別相當(dāng)于基因組的5、3、1拷貝。根據(jù)Southern雜交信號(hào)強(qiáng)度，估算轉(zhuǎn)基因小鼠的外源基因整合的拷貝數(shù)。6號(hào)，1拷貝；12號(hào)，2拷貝；43和61號(hào)，高于30拷貝，63號(hào)，8拷貝。
(5).轉(zhuǎn)基因遺傳的檢測(cè)Founder轉(zhuǎn)基因小鼠一經(jīng)鑒定后立刻與非轉(zhuǎn)基因小鼠一起進(jìn)行交配。共有6只陽(yáng)性Founder小鼠，F(xiàn)1代共44只，采用與鑒定始祖轉(zhuǎn)基因小鼠同樣的程序提取基因組DNA及PCR檢測(cè)。其中6、12、61號(hào)小鼠后代的陽(yáng)性率接近或小于50％；63號(hào)的后代為76.9％；43號(hào)的后代為100％。理論上，轉(zhuǎn)基因小鼠后代的陽(yáng)性率至少為50％，并符合盂德?tīng)柗蛛x規(guī)律。
(6).轉(zhuǎn)基因小鼠的Western blot檢測(cè)在轉(zhuǎn)基因小鼠生仔鼠后的第5天，采集乳汁，并采集一只陰性小鼠第5天的乳汁作為對(duì)照。在采集乳汁之前，需將母鼠與仔鼠隔離3小時(shí)以上，并通過(guò)腹腔注射一定劑量的催產(chǎn)素和按摩乳房才能順利采集到乳汁。以人奶作為陽(yáng)性對(duì)照，以陰性小鼠奶樣作為陰性對(duì)照進(jìn)行Western檢測(cè)。陰性小鼠的沒(méi)有雜交信號(hào)，人的有較強(qiáng)雜交信號(hào)作為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)于轉(zhuǎn)基因小鼠，61和63號(hào)小鼠的奶樣有較強(qiáng)雜交信號(hào)，檢測(cè)到重組溶菌酶的表達(dá)。人乳中含有溶菌酶0.5mg/ml，根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)估計(jì)，61號(hào)外源人溶菌酶的含量約為2mg/ml；63號(hào)約為0.5mg/ml；而12號(hào)沒(méi)有重組溶菌酶的表達(dá)，如圖12。
(7)、重組人溶菌酶的活性檢測(cè)A.溶菌酶對(duì)溶壁微球菌溶菌作用的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法如前所述B.重組人溶菌酶的活性檢測(cè)根據(jù)上述方法，分別測(cè)定轉(zhuǎn)基因小鼠、人、陰性小鼠乳清對(duì)溶壁微球菌作用的OD450值變化，測(cè)定三次，取0至1分鐘的OD450差值。根據(jù)x＝2000(y+0.002)×3公式可以計(jì)算乳清中溶菌酶的濃度。轉(zhuǎn)基因小鼠61號(hào)的酶活性為2160U/ml、63號(hào)948U/ml、12號(hào)30U/ml，陰性小鼠(ck)的酶活性為25.98U/ml，人的為1224U/ml。由此可見(jiàn)，與陰性小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠乳清的溶菌酶濃度有顯著提高，其中61號(hào)小鼠提高了83倍，63號(hào)提高了36倍，但12號(hào)幾乎沒(méi)有提高。與人乳清相比，61號(hào)的溶菌酶濃度提高了近1倍，63號(hào)也接近了人乳清的溶菌酶濃度，約為0.8倍。
從以上結(jié)果可以看出，我們構(gòu)建的pBC1-Hly和pBC2-sigHly表達(dá)載體，都能在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中特異表達(dá)具有溶菌活性的重組人溶菌酶，而具有牛beta-casein信號(hào)肽序列的pBC2-sigHly表達(dá)載體表達(dá)量以及相對(duì)溶菌活性都要明顯高于pBC1-Hly表達(dá)載體，因此pBC2-sigHly表達(dá)載體是我們進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)即進(jìn)行轉(zhuǎn)基因克隆牛制作所采用的主要載體。而且從轉(zhuǎn)基因小鼠的表達(dá)情況可以看出，在山羊beta-casein啟動(dòng)子區(qū)缺失31bp序列的pBC2與完整的pBC1的表達(dá)效果一致，證明我們構(gòu)建的pBC2也可以用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺特異表達(dá)研究。
2.1.3pBC-sigHly-EGFP-NEO和pBC-sigHly-NEO表達(dá)載體構(gòu)建
1).pBC-sighLY標(biāo)記表達(dá)載體的構(gòu)建策略為了便于篩選陽(yáng)性細(xì)胞，我們首先構(gòu)建了含綠色熒光蛋白基因(EGFP)和新霉素基因雙選擇標(biāo)記載體(pEGFP-NEO)以及新霉素基因單選擇標(biāo)記載體(pNEO)，然后分別將兩個(gè)標(biāo)記載體與此前構(gòu)建的pBC-sighLY載體連接構(gòu)建成pBC-sigHly-EGFP-NEO和pBC-sigHly-NEO表達(dá)載體2)pEGFP-NEO的構(gòu)建用NotI和SalI酶切pBC1回收約6kb的片斷，連接一個(gè)依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，構(gòu)建成pXM，用BamHI和NotI酶切pCMV-EGFP-IRES-NEO并回收4kb片斷EGFP-IRES-NEO，同時(shí)用BamHI和NotI酶切pXM，并與EGFP-IRES-NEO連接即構(gòu)成pEGFP-NEO，如圖13.
3)pNEO的構(gòu)建用NotI和SalI酶切pBC1回收約6kb的片斷，連接一個(gè)依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，構(gòu)建成pXM，用BamHI和NotI酶切pIRES-NEO并回收2kb片斷IRES-NEO，同時(shí)用BamHI和NotI酶切pXM，并與IRES-NEO連接即構(gòu)成pNEO，如圖14。
4)pBC-sigHly-EGFP-NEO表達(dá)載體構(gòu)建用NotI和SalI酶切pBC1-sigHLY和pEGFP-NEO，將兩者連接即構(gòu)成pBC-sigHIy-EGFP-NEO，通過(guò)酶切及測(cè)序分析，確定pBC-sigHly-EGFP-NEO載體構(gòu)建成功，載體圖如下(圖15)5)pBC-sigHly-NEO表達(dá)載體構(gòu)建用NotI和SalI酶切pBC-sigHLY和pNEO，將兩者連接即構(gòu)成pBC-sigHly-NEO，通過(guò)酶切及測(cè)序分析，確定pBC-sigHly-NEO載體構(gòu)建成功，載體圖如下(圖16)2.2細(xì)胞培養(yǎng)，基因轉(zhuǎn)染及陽(yáng)性細(xì)胞篩選2.2.1胎兒成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)中將胎兒浸泡在70％酒精中30sec，用PBS漂洗幾遍，以消毒過(guò)的手術(shù)器械取下耳部及脊背部的數(shù)塊表皮組織于DMEM+10％FCS培養(yǎng)液里。
↓在直徑60mm平皿中將胎兒組織切碎成為1mm3大小的組織碎塊，再將組織碎塊轉(zhuǎn)移至15mlmlml離心管中，1000rpm下離心洗滌數(shù)次。
↓用消毒玻璃彎頭吸管將小組織碎塊吸至25cm2培養(yǎng)瓶中，通過(guò)玻璃吸管彎頭使組織塊均勻分布在瓶壁上。
↓小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶(防止組織塊落下)讓組織塊黏附于瓶壁上，置于37度，5％CO2培養(yǎng)箱中放置2～4h，待組織塊貼壁后，再正置培養(yǎng)瓶，補(bǔ)加適量培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
2.2.2胎兒成纖維細(xì)胞的傳代、冷凍、及復(fù)蘇待種植的原代細(xì)胞生長(zhǎng)至80％匯合時(shí)，將細(xì)胞一部分冷凍，一部分傳代繼續(xù)培養(yǎng)。
2.2.2.1傳代用消毒玻璃彎頭吸管小心吸除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，沿著細(xì)胞生長(zhǎng)壁的對(duì)面瓶壁注入無(wú)鈣鎂PBS(37度溫育)沖洗細(xì)胞兩次，以祛除殘余血清及細(xì)胞代謝物。
↓用同樣方法加入0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化液，加入量為可覆蓋細(xì)胞單層即可(直徑100mm培養(yǎng)皿一般加入1ml消化液，35mm培養(yǎng)皿中加入200μL消化液)，放入培養(yǎng)箱中消化1-2min。在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞開(kāi)始變圓時(shí)，用手指敲打培養(yǎng)皿壁，使細(xì)胞徹底脫壁，然后加入培養(yǎng)液終止消化。
↓用消毒玻璃彎頭吸管反復(fù)吹打，細(xì)胞，使其分散成為單個(gè)細(xì)胞，1000rpm下離心5min收集細(xì)胞。用培養(yǎng)液按1∶2或1∶3比例稀釋并重新接種細(xì)胞至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。
2.2.2.2冷凍貼壁細(xì)胞消化后，收集細(xì)胞于離心管中，在1000rpm下離心5min以去盡上清。
↓加4度預(yù)冷的冷凍液(DMEM+20％FCS+10％DMSO)重懸細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞濃度約為107個(gè)細(xì)胞/ml，轉(zhuǎn)移細(xì)胞至凍存管中。
↓放入4度冰箱預(yù)冷30min，再把凍存管插于厚泡沫上后置于液氮液面熏蒸2h，然后迅速投入液氮保存。
2.2.2.3復(fù)蘇從液氮中取出凍存管，快速投入37度水浴中，并在水浴中不斷快速搖動(dòng)凍存管以迅速解凍。
↓待冷凍液徹底解凍后，以新鮮培養(yǎng)液稀釋10倍并將溶解液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm下離心5min去除DMSO以緩減冷凍液毒性。
↓用新鮮的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞稀釋至所需濃度，繼續(xù)培養(yǎng)。
2.2.3轉(zhuǎn)染用DNA的準(zhǔn)備大提質(zhì)粒pBC-sigHly-EGFP-NEO和pBC-sigHly-NEO，以SalI酶切質(zhì)粒，酶切反應(yīng)如下質(zhì)粒DNA 約10-20μg10×反應(yīng)buffer 20μl限制性內(nèi)切酶10-20Udd H2O 補(bǔ)足體系至200μl上述試劑加好后，混勻，37度水浴消化2h，取5μL酶切產(chǎn)物以0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切是否完全，若酶切完全，加酚、酚/氯仿各抽提一次，加2倍體積無(wú)水乙醇和0.1倍體積乙酸鈉(PH5.2)，混勻后置-20度過(guò)夜；12000rpm離心15min回收沉淀，70％乙醇洗滌一次，真空干燥，加TE溶解。
2.2.4牛胎兒成纖維細(xì)胞對(duì)G418毒性敏感性檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)到第3代后用0.25％胰蛋白酶消化，按每孔0.5～1×105個(gè)細(xì)胞接種到13個(gè)直徑35mm培養(yǎng)皿中以使細(xì)胞盡量分散。次日在其中12孔中以100μg/ml的梯度依次加入終濃度從100μg/ml到1200μg/ml的G418，還有一孔中不加入G418作為對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)三周，每3～4天換液一次，同時(shí)補(bǔ)加G418。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)或死亡情況。
2.2.5電擊轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前將10～50μg 1.2.1純化回收的DNA融入500μL 2×HeBS中，補(bǔ)充滅菌超純水至1m1，冰浴預(yù)冷。
↓在轉(zhuǎn)染前2～3天，用0.25％胰蛋白酶溶液消化培養(yǎng)細(xì)胞。將1×106個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)接于75cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入完全培養(yǎng)液，置37度、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
↓轉(zhuǎn)染前，在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞，確定細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。用0.25％胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，1000rpm離心5min沉淀細(xì)胞。
↓將細(xì)胞沉淀用冰浴預(yù)冷的1×HeBS離心洗滌1次，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
↓將一定數(shù)量的細(xì)胞重新懸浮于加有DNA的電極緩沖中，混合均勻后轉(zhuǎn)入電擊杯中，在電擊前冰浴10min。
↓當(dāng)細(xì)胞準(zhǔn)備好進(jìn)行電擊時(shí)，設(shè)置電場(chǎng)強(qiáng)度(E)和脈沖時(shí)間(t)，先試一下，確保產(chǎn)生了所需的脈沖。將電擊杯插入電擊槽中，按照選定的電場(chǎng)強(qiáng)度(E)和脈沖時(shí)間(t)，電擊細(xì)胞。
↓將經(jīng)電擊后的細(xì)胞冰浴10min后轉(zhuǎn)入75cm2的培養(yǎng)瓶中，加入含20％FCS的DMEM培養(yǎng)液中于37度、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
↓1-2天后待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)恢復(fù)，將細(xì)胞擴(kuò)大10倍培養(yǎng)，加入適量的G418進(jìn)行篩選。
↓每3～4天換液一次，同時(shí)補(bǔ)加G418。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)或死亡情況。6-10天后，挑選陽(yáng)性克隆細(xì)胞。
2.2.6陽(yáng)性細(xì)胞的單克隆培養(yǎng)在熒光顯微鏡下觀察上述方法所得細(xì)胞克隆的發(fā)光情況，用記號(hào)筆圈住分散良好(遠(yuǎn)離其它克隆)且細(xì)胞數(shù)量多的熒光克??；吸除培養(yǎng)液，用無(wú)鈣鎂PBS漂洗細(xì)胞二次，在高倍解剖鏡下，將30-50ul 0.25％胰蛋白酶消化液滴加在標(biāo)記好的細(xì)胞克隆上，待克隆的大多數(shù)細(xì)胞收縮脫壁后，不等細(xì)胞懸浮，快速吸取細(xì)胞克隆，但注意不要吸入附近其它克隆的細(xì)胞；轉(zhuǎn)移細(xì)胞到加有500μl培養(yǎng)液的四孔板中，吹打分散細(xì)胞團(tuán)塊；挑出的克隆繼續(xù)培養(yǎng)，降低G418濃度至300μg/ml維持篩選；待克隆細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大后或匯合后，將一部分細(xì)胞轉(zhuǎn)移到35mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，另一部分用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，其它擴(kuò)大后的細(xì)胞盡早冷凍。
2.3轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆2.3.1卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)從屠宰廠收集成年牛的卵巢，置于30℃的生理鹽水在4h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室，37℃的PBS液中清洗三遍后，以直徑為0.7mm針頭抽取直徑為2～8mm的卵泡，回收形態(tài)均勻、結(jié)構(gòu)致密的卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體(COCs)，以成熟液(M199+10％FBS+0.01U/ml bFSH+0.01U/ml bLH+1μg/ml estradiol)洗滌兩遍，然后將卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5％CO2培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)18～20h后，將成熟的卵母細(xì)胞放入0.1％透明質(zhì)酸酶的管內(nèi)振蕩2～3min后，再用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞完全脫離，選擇形態(tài)完整，細(xì)胞質(zhì)均勻并排出第一極體的卵母細(xì)胞為體細(xì)胞核受體。
2.3.2卵母細(xì)胞的去核將帶有第一極體的卵母細(xì)胞移入含M199+10％FBS+7.5μg/ml細(xì)胞松馳素B的操作液中，在200倍顯微鏡下用一玻璃針于極體上方將透明帶切一小口，再用內(nèi)徑為20μm的玻璃管將第一極體以及其下方的卵母細(xì)胞內(nèi)的染色體一并吸除，再放入M199+20％FBS的溶液中洗三遍后，置于培養(yǎng)箱中備用。
2.3.3移核與融合將血清饑餓2～4d的供體細(xì)胞用0.25％trypsin消化2～4min，選擇直徑為10～12μm的體細(xì)胞用20μm直徑玻璃管將其移入去了核的卵母細(xì)胞透明帶內(nèi)，然后將其放入Zimmerman液[15]中平衡3～5min后放入融合槽內(nèi)，轉(zhuǎn)動(dòng)卵細(xì)胞使供體細(xì)胞與卵母細(xì)胞接觸面與電場(chǎng)垂直，同時(shí)在直流脈沖的場(chǎng)強(qiáng)為2.5kV/cm、脈沖時(shí)間為10μs、脈沖次數(shù)為2次、脈沖間隔為1s的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)后，迅速將重構(gòu)胚移入M199+10％FBS液中，放置0.5h后觀察融合率，挑選融合胚進(jìn)行下一步激活處理。
2.3.4重構(gòu)胚的激活與培養(yǎng)將重構(gòu)胚放入5μmol/L lonomycin(Sigma)液中，4min后換到1.9mmol/L 6-DMAP液中，4h后再移入CRlaa+5％FBS液中，在38.5℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d后觀察分裂率，7d后觀察囊胚發(fā)育率2.3.5胚胎移植與妊娠檢測(cè)將形態(tài)優(yōu)良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體母牛的子宮角內(nèi)。受體母牛選擇的都是經(jīng)產(chǎn)母牛，其中紅系冀南黃牛的克隆胚胎被移入Holstein奶牛，Holstein奶牛的克隆胚胎被移入魯西黃牛。在移植后的第60d進(jìn)行直腸檢測(cè)，以確定妊娠率。
2.4轉(zhuǎn)基因克隆的PCR和Southern鑒定本發(fā)明共獲得四頭轉(zhuǎn)有pBC-sighLY-NEO的轉(zhuǎn)基因克隆牛，一頭轉(zhuǎn)有pBC-sighLY-EGFP-NEO的轉(zhuǎn)基因克隆牛。采集轉(zhuǎn)基因、非轉(zhuǎn)基因克隆牛和普通荷斯坦奶牛耳部組織樣，提取DNA，然后進(jìn)行PCR鑒定和Southern鑒定。
PCR檢測(cè)的引物序列為上游5`TTA TAC ACA CGG CTT TAC 3`下游5`CAG CAT CAG CGA TGT TATCT 3`。PCR條件94℃ 5min；94℃ 40sec，53℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃ 7min，4℃ 1∞，產(chǎn)物長(zhǎng)度為700bp。結(jié)果如圖17和18。
對(duì)于NEO基因，引物序列為上游5`AGG ATC TCC TGT CAT CTC ACC TTG CTC CTG 3`下游5`AAG AAC TCG TCA AGA AGG CGA TAG AAG GCG 3`。PCR條件94℃ 5min；94℃ 40sec，60℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃ 7min，4℃ 1∞，產(chǎn)物長(zhǎng)度為490bp。結(jié)果如圖19和20。
對(duì)于EGFP基因，引物序列為上游5`TGC AGT GCT TCA GCC GCT AC 3`下游5`CTC AGG TAG TGGTTG TCG GG 3`。PCR條件94℃ 5min；94℃ 40sec，62℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃ 7min，4℃ 1∞，產(chǎn)物長(zhǎng)度為380bp。結(jié)果如圖21。
我們所使用的pBC2載體啟動(dòng)子為山羊酪蛋白啟動(dòng)子，并在啟動(dòng)子區(qū)有31bp缺失。我們?cè)谌笔幵O(shè)計(jì)了一對(duì)引物(pBCF15′GGG GAC AGA AAA ATA GGA AG 3′，pBCF15′AGA GGA GAA GAA GTGAAG GA 3′)，PCR條件94℃ 5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec，30cycles；72℃ 7min，4℃ 1∞，完整pBC1的擴(kuò)增產(chǎn)物為174bp，而pBC2為143bp。擴(kuò)增結(jié)果如圖22，泳道3和6擴(kuò)增產(chǎn)物約為140bp，這是因?yàn)閜BC2-sighLY-NEO質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)基因小鼠DNA均含有缺失序列的pBC2；而1，2，3，4號(hào)牛，對(duì)照牛以及完整pBC的擴(kuò)增產(chǎn)物均含有一條約為170bp帶，這可能是由于牛與羊的酪蛋白啟動(dòng)子區(qū)同源性較高(pBCF1和2引物與牛酪蛋白啟動(dòng)區(qū)同源性為100％和95％)的緣故，而2和3號(hào)克隆牛則還含有一條約為140bp的條帶，進(jìn)一步證明2和3號(hào)克隆牛為轉(zhuǎn)有pBC2-sighLY-NEO的轉(zhuǎn)基因克隆牛。
從以上PCR結(jié)果可以看出，在我們得到的四頭克隆牛均轉(zhuǎn)有pBC-sighLY-NEO，而另有一頭轉(zhuǎn)有pBC-sighLY-EGFP-NEO。
取PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因克隆牛DNA約10μg用PstI內(nèi)切酶消化，低壓慢速電泳，轉(zhuǎn)膜后，進(jìn)行Southern雜交，雜交所用探針為α-P32dCTP同位素標(biāo)記的5kb的hLY基因。以pBC-sigHLY-NEO質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以非轉(zhuǎn)基因克隆?；蚪M為陰性對(duì)照，雜交可得到5kb片段，如圖23所示進(jìn)一步確定了金娃和盼娃轉(zhuǎn)有溶菌酶基因，可以估計(jì)金娃和盼娃轉(zhuǎn)有20個(gè)拷貝的人溶菌酶基因，根據(jù)轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)果，可以推測(cè)這兩頭轉(zhuǎn)基因牛將能在乳腺中高效表達(dá)人溶菌酶。
附SEQ ID NO 1本序列為人溶菌酶一級(jí)結(jié)構(gòu)即氨基酸序列，共148個(gè)氨基酸，其中前18個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。
1MKALIVLGLV LLSVTVQGKV FERCELARTL KRLGMDGYRG ISLANWMCLA51 KWESGYNTRA TNYNAGDRST DYGIFQINSR YWCNDGKTPG AVNACHLSCS101 ALLQDNIADA VACAKRVVRD PQGIRAWVAW RNRCQNRDVR QYVQGCGV
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)重組人溶菌酶的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器——人溶菌酶轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，其操作步驟如下(1)構(gòu)建含有人溶菌酶基因的乳腺特異表達(dá)載體，(2)構(gòu)建雙標(biāo)記選擇載體和單標(biāo)記選擇載體，通過(guò)電擊方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，(3)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為核供體進(jìn)行體細(xì)胞克隆，獲得轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)重組人溶菌酶的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器——人溶菌酶轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，所述人溶菌酶基因含有人溶菌酶基因信號(hào)肽序列，1-4外顯子，1-3內(nèi)含子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)重組人溶菌酶的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器——人溶菌酶轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，所述人溶菌酶基因的特異表達(dá)載體是pBC1-HLY或pBC2-HLY。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)重組人溶菌酶的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器——人溶菌酶轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，所述人溶菌酶基因還含有牛beta-casein信號(hào)肽序列，1-4外顯子，1-3內(nèi)含子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)重組人溶菌酶的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器——人溶菌酶轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，所述人溶菌酶基因的特異表達(dá)載體是pBC1-sigHLY或pBC2-sigHLY，重組人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中表達(dá)的人溶菌酶與天然人溶菌酶大小一致，具有與天然人乳中溶菌酶相同的免疫活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)重組人溶菌酶的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器——人溶菌酶轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，所述雙標(biāo)記選擇載體是pBC2-sigHLY-EGFP-NEO，單標(biāo)記選擇載體是pBC2-sigHLY-NEO。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)重組人溶菌酶的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器——人溶菌酶轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是通過(guò)G418進(jìn)行篩選獲得的陽(yáng)性細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)重組人溶菌酶的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器——人溶菌酶轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，所述大型家畜為牛、山羊、綿羊、豬或兔。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生產(chǎn)重組人溶菌酶的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器——人溶菌酶轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，所述大型家畜為牛。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)重組人溶菌酶的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器——人溶菌酶轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，其操作步驟如下(1)構(gòu)建含有人溶菌酶基因的乳腺特異表達(dá)載體，(2)構(gòu)建雙標(biāo)記選擇載體和單標(biāo)記選擇載體，通過(guò)電擊方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，(3)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為核供體進(jìn)行體細(xì)胞克隆，獲得轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物。利用體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因牛，從而通過(guò)高產(chǎn)奶牛的乳腺大量生產(chǎn)具有活性的人溶菌酶。本發(fā)明所研究的重組人溶菌酶，具有與天然人溶菌酶相同的生物活性，既可開(kāi)發(fā)出具有高附加值的保健牛奶，也可純化出人溶菌酶并開(kāi)發(fā)成藥品和保健品。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1669405SQ20051006611
公開(kāi)日2005年9月21日 申請(qǐng)日期2005年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者湯波, 戴蘊(yùn)平, 龔國(guó)春, 于政權(quán), 張磊, 李寧 申請(qǐng)人:李寧