專利名稱：豬慢收縮型肌鈣蛋白編碼基因tnni1作為豬生產(chǎn)性狀的遺傳標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬的分子生物學(xué)技術(shù)及育種領(lǐng)域，具體涉及豬的與生產(chǎn)性狀相關(guān)基因TNNI1基因第3內(nèi)含子的突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
通過生產(chǎn)性狀的表型值估算出的育種值進(jìn)行動(dòng)物選擇性育種，已大大促進(jìn)了家畜生產(chǎn)性狀的遺傳改良。九十年代以來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步以及在豬領(lǐng)域中的應(yīng)用，逐步出現(xiàn)了以分子標(biāo)記為核心的分子標(biāo)記輔助選擇和滲入等分子育種技術(shù)，這些技術(shù)與常規(guī)育種相結(jié)合，大大加速了豬育種進(jìn)程。能夠應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇的基因或標(biāo)記必須對(duì)目標(biāo)性狀具有較大的遺傳貢獻(xiàn)率，即主效基因或標(biāo)記，因此尋找這些主效基因和與之緊密連鎖的分子標(biāo)記成為分子標(biāo)記輔助選擇的前提和基礎(chǔ)，也是當(dāng)前和今后一段時(shí)間豬分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和急需解決的問題。
目前已有多個(gè)位于功能基因內(nèi)部的與生產(chǎn)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記被發(fā)現(xiàn)并申請(qǐng)專利。例如，在傳統(tǒng)的豬育種計(jì)劃中，由于消費(fèi)者對(duì)瘦肉的興趣，因此選擇主要強(qiáng)調(diào)降低脂肪。脂肪降低主要以背膘厚降低來衡量。然而，背膘厚下降同樣導(dǎo)致了肌內(nèi)脂肪的下降，脂肪最后的沉積部位是肌肉，因此肌內(nèi)脂肪與味道以及肌肉的接受程度呈正相關(guān)。為防止肌內(nèi)脂肪進(jìn)一步的下降，必須找到影響此性狀的分子標(biāo)記，因?yàn)榧?nèi)脂肪是很難在活體中度量的。Gerbens等證實(shí)了位于豬6號(hào)染色體上肌肉組織特異候選基因心臟脂肪酸結(jié)合蛋白與豬中肌內(nèi)脂肪含量和其它生產(chǎn)性狀的關(guān)系，該基因已被申請(qǐng)專利，其專利號(hào)為WO 97/35878；另外，Rothschild等發(fā)現(xiàn)了leptin受體基因內(nèi)與瘦肉率有關(guān)的分子標(biāo)記，其專利號(hào)為US.Pat.Nos.5972621。
根據(jù)ATP酶組化法，肌纖維被分為I型(慢收縮型)和II型(快收縮型)肌纖維兩大主要類型(Staronet al.1986.Correlation between myofibrillar ATPase activity and myosin heavy chain composition in rabbitmuscle fibers.Histochemistry.8619-23)。I型纖維肌漿肌紅蛋白和細(xì)胞色素多，肌纖維周圍的血管分布密度大，具有較高線粒體酶濃度，而肌原纖維ATP酶和磷酸化酶活性低，僅能進(jìn)行有氧氧化代謝，與紅肌纖維對(duì)應(yīng)；II型中IIA型纖維既能進(jìn)行酵解，又能進(jìn)行有氧氧化，為中間型；IIB型纖維僅能進(jìn)行酵解代謝，與白肌纖維對(duì)應(yīng)(Karlsson et al.1999.Skeletal muscle fibres as factors for pork quality.Livest Prod Sci.3255-269)。I型(紅肌纖維)較II型(白肌纖維)纖維細(xì)，產(chǎn)酸能力弱，pH值和脂肪含量較高，提高肌肉I型纖維比例有利于提高肉色、嫩度與多汁性。
肌鈣蛋白復(fù)合體屬于獨(dú)立的多基因家族，它與原肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白-肌凝蛋白肌原纖維相互作用參與了Ca2+介導(dǎo)的橫紋肌收縮。這個(gè)復(fù)合體包括3個(gè)緊密聯(lián)系的蛋白質(zhì)肌鈣蛋白C(TnC)、肌鈣蛋白I(TnI)和肌鈣蛋白T(TnT)，其表達(dá)產(chǎn)物都表現(xiàn)出肌纖維特異性。TnI為肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，TnI基因家族包括3個(gè)亞型2個(gè)骨骼肌亞型，即TnI-快收縮型和TnI-慢收縮型，1個(gè)心肌亞型，即TnI-心臟型。Wade等(1990.cDNA sequence，tissue-specific expression，and chromosomal mapping of the hunan slow-twitchskeletal muscle isoform of troponin I.Genomics.7346-357)首先分離出了人慢收縮骨骼肌TNNI1基因的cDNA全長序列，用該cDNA為探針檢測(cè)嚙齒類動(dòng)物和人成肌細(xì)胞中的組織特異性調(diào)控和發(fā)育調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNNI1信號(hào)似乎只局限在含有慢收縮型骨骼肌肌纖維的肌肉組織中。
生物學(xué)上，生產(chǎn)性狀體現(xiàn)在動(dòng)物的特定組織中，比如，肌肉組織對(duì)應(yīng)于瘦肉生產(chǎn)。因此，在動(dòng)物育種計(jì)劃中，各種水平的選擇壓力都會(huì)施加于不同組織中。而關(guān)于不同組織中特異表達(dá)基因與個(gè)體生產(chǎn)性能之間的關(guān)系還沒有完全揭示出來。本發(fā)明提供了肌肉特異表達(dá)基因-慢收縮型肌肉肌鈣蛋白(TNNI1)編碼基因第3內(nèi)含子內(nèi)的遺傳變異與豬生長、胴體和肉質(zhì)生產(chǎn)性狀間的關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克隆豬TNNI1基因的部分基因組DNA序列，尋找TNNI1基因的突變位點(diǎn)以及基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，為豬的分子育種提供輔助選擇方法。
本發(fā)明提供了大白豬、長白豬、通城豬、清平豬和二花臉豬包括豬TNNI1基因第3內(nèi)含子的455bp的基因組核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5所示；通過5個(gè)豬種〔大白豬、長白豬、通城豬、清平豬和二花臉豬)的上述序列進(jìn)行Cluster W比對(duì)提供了位于該455bp擴(kuò)增片段內(nèi)部的5處單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其SNP位點(diǎn)如圖1所示。
制備該基因片段的步驟如下選擇三個(gè)中國地方品種(通城豬、清平豬和二花臉豬)和2個(gè)外來(國外)品種(大白豬、長白豬)為試驗(yàn)材料，從豬血液中提取DNA，根據(jù)豬TNNI1基因cDNA序列(GeneBank登錄號(hào)AY282922)，設(shè)計(jì)引物，其序列分別如序列表SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示，PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化、克隆測(cè)序，序列比較分析。
本發(fā)明提供了鑒定上述序列383bp處C/T變異的XbaI-RFLP(限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性)基因型分型方法。其步驟包括根據(jù)豬TNNI1基因cDNA序列(GeneBank登錄號(hào)AY282922)和所獲得的上述SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5序列，設(shè)計(jì)引物，其引物序列分別如序列表SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9所示，在豬基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增片段XbaI酶切分型及檢測(cè)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了利用XbaI-RFLP方法確定的不同基因型個(gè)體與生產(chǎn)性狀間的相關(guān)關(guān)系。
序列表

1、序列表SEQ ID NO.1是外來豬種“大白豬”的核苷酸序列；2、序列表SEQ ID NO.2是外來豬種“長白豬”的核苷酸序列；3、序列表SEQ ID NO.3是中國豬種“通城豬”的核苷酸序列。
4、序列表SEQ ID NO.4是中國豬種“清平豬”的核苷酸序列。
5、序列表SEQ ID NO.5是中國豬種“二花臉豬”的核苷酸序列。
6、序列表SEQ ID NO.6是制備SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5特異基因片段所用的正向引物。
7、序列表SEQ ID NO.7是制備SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5特異基因片段所用的反向引物。
8、序列表SEQ ID NO.8是實(shí)施豬TNNI1基因第3內(nèi)含子C/T變異XbaI-RFLP(限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性)基因型分型方法的正向引物。
9、序列表SEQ ID NO.9是實(shí)施豬TNNI1基因第3內(nèi)含子C/T變異XbaI-RFLP(限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性)基因型分型方法的反向引物。
圖1五個(gè)豬種TNNI1基因序列比對(duì)結(jié)果和SNP位點(diǎn)。
圖2包括豬TNNI1基因第3內(nèi)含子的基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖譜。
瓊脂糖凝膠濃度為1.5％；M泳道DNA Marker DL2,000；泳道1-4代表序列表SEQ ID NO.6和SEQID NO.7所示引物在不同豬種中的擴(kuò)增片段，片段大小為455bp。
圖3TNNI1基因XbaI-RFLP檢測(cè)結(jié)果。
瓊脂糖膠濃度為2.5％；泳道M為DL 2000 Markers；1、4、5、8、9泳道為AA基因型，188bp；3、7泳道為AB基因型，188bp，111bp，77bp；2、6泳道為BB基因型，111bp，77bp。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于開發(fā)成診斷方法或試劑盒，從而在育種計(jì)劃中利用這些方法來選擇攜帶有利等位基因的豬，從而可以達(dá)到較好的選擇效果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1；基因片段的獲得及多態(tài)性檢測(cè)方法的建立選擇2個(gè)外來豬種(大白豬、長白豬)和3個(gè)中國豬種(通城豬、清平豬、二花臉豬)為試驗(yàn)材料，根據(jù)豬TNNI1基因cDNA序列(GeneBank登錄號(hào)AY282922)，設(shè)計(jì)以下引物，引物序列如下正向引物F1TCACTGCCTCCCGCAAACT反向引物R1GAGCCTTCTCAGCCTCTCGC用此引物在五個(gè)豬種(大白豬、長白豬、通城豬、清平豬和二花臉豬)基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25μl，其中模板DNA為50ng，dNTPs濃度為200μmol/L，每條引物濃度為0.4μmol/L，3U的Taq DNA聚合酶(Biostar International，Canada)，加去離子水至總體積25μl；PCR反應(yīng)程序94℃預(yù)變性4min；然后94℃變性50s、64℃退火50s、72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。
不同豬種的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化(UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物技術(shù)公司)、克隆后，進(jìn)行序列測(cè)定，序列測(cè)定由上海生工生物技術(shù)公司完成。不同豬種的PCR產(chǎn)物序列經(jīng)ClusterW軟件進(jìn)行序列比對(duì)，序列間比對(duì)結(jié)果見圖1。上述擴(kuò)增片段大小為455bp，共存在5個(gè)堿基變異，其中位于該片段的383bp處的C/T變異表現(xiàn)了中、外豬種間差異，并引起了XbaI酶切位點(diǎn)(↓TCTAGA)多態(tài)性。據(jù)此，設(shè)計(jì)以下引物，并采用XbaI-RFLP方法進(jìn)行SNP分型，引物序列如下正向引物F2GAGTGGTAGGAGATTGACGGA反向引物R2GTAGCGAGCCTTCTCAGCCPCR反應(yīng)體系為20μl，其中模板DNA為50ng，dNTPs濃度為200μmol/L，每條引物濃度為0.5μmol/L，1U的Taq DNA聚合酶(Biostar International，Canada)，加去離子水至總體積25μl；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min；然后94℃變性50s、60℃退火50s、72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。
取8.5μl PCR產(chǎn)物加入0.5μl(10U/μl)限制性內(nèi)切酶和1μl 10×buffer(含10×BSA)，37℃ XbaI酶切4h，取5μl酶切產(chǎn)物用瓊脂糖或聚丙烯酰胺膠電泳檢測(cè)，在紫外燈下或銀染后觀察并記錄酶切結(jié)果。此擴(kuò)增片段大小為188bp，XbaI酶切多態(tài)性位點(diǎn)位于該片段的111bp處，若111bp處的堿基為C，則不存在Xbal酶切位點(diǎn)，用XbaI酶切檢測(cè)結(jié)果只有一條188bp片段(A等位基因)，當(dāng)該位點(diǎn)為T時(shí)，結(jié)果導(dǎo)致一個(gè)Xbal酶切位點(diǎn)的產(chǎn)生，酶切得到兩個(gè)片段，長度分別為111bp和77bp(B等位基因)。
實(shí)施例2分子標(biāo)記在不同豬群中的多態(tài)性分布在3個(gè)國外豬群(大白豬、長白豬、杜洛克豬)和6個(gè)中國豬群(通城豬、清平豬、八眉豬、淮南豬、梅山豬、二花臉豬)中檢測(cè)豬TNNI1第3內(nèi)含子的XbaI-RFLP多態(tài)性，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。在所檢測(cè)的幾個(gè)豬種中，大白、長白和杜洛克豬群占優(yōu)勢(shì)的A等位基因的基因頻率分別為0.804、0.825和0.883，而二花臉、梅山、清平和八眉豬中優(yōu)勢(shì)的B等位基因的基因頻率分別為1、0.865、0.679和0.636，在通城豬和淮南豬中A等位基因和B等位基因的頻率接近，A等位基因的基因頻率分別為0.522和0.52。
表1 TNNI1基因XbaI酶切多態(tài)性在不同豬種中的分布結(jié)果

實(shí)施例3分子標(biāo)記與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析為了確定TNNI1基因多態(tài)性與豬表型差異是否相關(guān)，選擇華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部豬遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室組建的295頭大白×梅山F2代資源群體為試驗(yàn)材料，采用實(shí)施例2所建立的XbaI-RFLP方法進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，并分析豬TNNI1基因XbaI-PFLP不同基因型與豬生產(chǎn)性狀的相關(guān)關(guān)系。采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件(SASInstitute Inc，Version 8.0)glm程序進(jìn)行單標(biāo)記方差分析，同時(shí)采用reg程序計(jì)算基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，所采用模型為Yijkl＝μ+Gi+Fj+Sk+Yl+bijklXijkl+eijklYij為性狀表型值，μ為平均值，Gi為基因型效應(yīng)(包括基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)；加性效應(yīng)用-1，0和1分別代表AA、AB和BB基因型，顯性效應(yīng)用1，-1和1分別代表AA、AB和BB基因型)；Sk、Yl、Fj為固定效應(yīng)，分別為性別、年度、家系效應(yīng)，bijkl為屠宰體重或屠宰日齡的回歸系數(shù)，胴體性狀以屠宰體重為協(xié)變量，肉質(zhì)性狀以屠宰日齡為協(xié)變量，生長不考慮協(xié)變量；eijkl為殘差效應(yīng)。
在所檢測(cè)的295頭大×梅F2代個(gè)體中，AA基因型有74個(gè)，AB基因型有154個(gè)，BB基因型有67個(gè)。不同基因型與生產(chǎn)性狀間的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果總結(jié)于表2和3。
由表2可以看出，XbaI-RFLP基因型不同時(shí)，初生重、皮率、骨率、肥肉率、瘦肥比率、眼肌高、眼肌面積、背膘厚性狀存在顯著或極顯著差異。該位點(diǎn)在初生重、皮率、骨率、肥肉率、瘦肥比率、眼肌面積、6-7腰椎間背膘厚和胸腰椎間背膘厚主要以加性作用方式為主，但效應(yīng)方向與品種間的表型效應(yīng)并不完全一致。來源于大白品種的A等位基因在降低肥肉率、6-7腰椎間背膘厚和胸腰椎間背膘厚的同時(shí)，提高了初生重和瘦肥比率，這與大白品種表型效應(yīng)方向是一致的，而在皮率、骨率、眼肌面積性狀上卻與品種效應(yīng)方向相反。該位點(diǎn)在肩部背膘厚和眼肌高性狀上顯性效應(yīng)顯著，分別為-0.099±0.041和-0.142±0.047。
表2 TNNI1基因XbaI-RFLP基因型與生長、胴體性狀的統(tǒng)計(jì)分析表

注以上數(shù)值為最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；含有相同字母表示差異不顯著，小寫字母表示差異顯著，大寫字母表示差異極顯著；加性效應(yīng)負(fù)值表示B等位基因降低性狀表型值*表示p＜0.05，**表示p＜0.01(下表同)。
由表3可以看出，TNNI1基因XbaI-RFLP不同基因型時(shí)，股二頭肌pH值和背最長肌色值差異顯著，背最長肌pH值差異極顯著性。對(duì)于背最長肌肌肉pH值，該位點(diǎn)加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)均顯著，分別為-0.031±0.016和0.022±0.011；背最長肌肌肉色值加性效應(yīng)顯著，其值為0.558±0.257；來源于大白品種的A等位基因提高了背最長肌肌肉pH值，同時(shí)降低了背最長肌肌肉色值。
表3 TNNI1基因XbaI-RFLP基因型與肉質(zhì)性狀的統(tǒng)計(jì)分析表

序列表SEQUENCE LISTING<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>豬慢收縮型肌鈣蛋白編碼基因TNNI1作為豬生產(chǎn)性狀的遺傳標(biāo)記<130>
<141>2004-06-25<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>455<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
<221>gene<222>(1)..(455)<223>
<400>1tcactgcctc ccgcaaactc ctgctgaagg tgtgctgggt cctggttttg gggagatgtc 60caggggaggc agaggggcac agggcagcct tgggggttgg gggaagggtc atgggagggt120gacagggggc caaagcctgg gaggaggcag gaccagcttc agggcacaat cccccatctc180ccgatctccc aatctcccaa tctcccagtg ggagcctggg agaagagctt tattttgcta240agagtctttg aagctctggg ggcgcaaaga gagtggtagg agattgacgg acaggagaga300
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<221>gene<222>(1)..(19)<223>
<400>6tcactgcctc ccgcaaact19<210>7<211>20<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
<221>gene<222>(1)..(20)<223>
<400>7
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<221>gene<222>(1)..(21)<223>
<400>8gagtggtagg agattgacgg a21<210>9<211>19<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
<221>gene<222>(1)..(19)<223>
<400>9gtagcgagcc ttctcagcc19
權(quán)利要求
1.包含豬慢收縮型肌鈣蛋白編碼基因TNNI1第3內(nèi)含子的特異基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述DNA序列，獲得該DNA序列的引物序列如序列表SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述DNA序列，其特征在于序列表SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5序列383位堿基處有一個(gè)堿基突變C383-T383，導(dǎo)致Xba I-RFLP多態(tài)性。
4.一種篩選豬生產(chǎn)性狀的分子標(biāo)記的方法，按照以下步驟從豬血液中提取基因組DNA，根據(jù)豬TNNI1基因cDNA序列和序列表SEQID NO.1-SEQ ID NO.5所示的序列設(shè)計(jì)引物，該引物的序列如序列表SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9所示，用該引物在豬基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增片段XbaI酶切分型及檢測(cè)。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的豬生產(chǎn)性狀相關(guān)基因TNNI1在豬標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于豬的分子生物學(xué)技術(shù)與育種領(lǐng)域，具體涉及豬慢收縮性肌鈣蛋白(Troponin 1，Slow－twitch skeletal muscle isoform，TNNI1)編碼基因第3內(nèi)含子的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。其步驟包括從豬血液中提取基因組DNA，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序，序列比較分析，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)檢測(cè)，標(biāo)記與性狀間相關(guān)性分析。本發(fā)明公開了豬TNNI1基因第3內(nèi)含子的DNA序列和SNP分型的檢測(cè)技術(shù)，為豬的分子標(biāo)記輔助選擇提供了新的標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1715408SQ20041001338
公開日2006年1月4日 申請(qǐng)日期2004年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月29日
發(fā)明者熊遠(yuǎn)著, 左波, 鄧昌彥 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)