一種測定肌鈣蛋白i的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定肌鈣蛋白I的試劑盒及其制備方法，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分：試劑R1：Tris緩沖液、氯化鈉、聚乙二醇?6000、疊氮鈉，試劑R2：Tris緩沖液、牛血清白蛋白、疊氮鈉、吐溫?80、甘油、膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體，制備方法為：按照組分含量配制好試劑；將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合；用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值；根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的肌鈣蛋白I的濃度。本發(fā)明具有測定準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種測定肌鈣蛋白I的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測定肌鈣蛋白I的試劑盒 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在諸多診斷急性心肌梗死(AMI)的臨床生化指標(biāo)中，CK-MB曾一度被認(rèn)為是診斷 AMI的"金標(biāo)準(zhǔn)"，已廣泛應(yīng)用多年，但隨著對心肌肌鈣蛋白（cTn)的深入研究，無論是對心肌 的特異性還是診斷敏感性，CK-MB的地位都受到了嚴(yán)重挑戰(zhàn)，肌鈣蛋白（cTn)被認(rèn)為是目前 最好的確定標(biāo)志物，正逐步取代CK-MB成為AMI的診斷"金標(biāo)準(zhǔn)"。
[0003] 患有各種冠狀動脈疾患的病人必然會發(fā)生心肌細(xì)胞損傷，有些病人的臨床表現(xiàn)可 能不完全符合WHO關(guān)于AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)，例如不穩(wěn)定心絞痛，但卻伴有某些心肌損傷標(biāo)志物升 高，例如肌鈣蛋白（cTn)，cTnI在AMI后(3-6h)血中濃度很快升高，和CK-MB(3~8h)相當(dāng)或稍 早，它們測定的特異性和靈敏度明顯高于CK-MB^Tn具有相當(dāng)長的診斷窗口期，cTnl為7~9 天。cTn對急性胸痛病人(無論有無骨豁肌損傷）的診斷均優(yōu)于CK-MB。對心肌炎的診斷與CK 活性相比，心肌炎時(shí)cTnT因其相對較高的血清檢測值和較長的上升時(shí)間而具有較高的檢測 敏感性，血清cTnT可作為急性心肌炎的診斷標(biāo)志物。
[0004] 目前，主要采取化學(xué)發(fā)光、酶聯(lián)熒光分析法對肌鈣蛋白I (cTnl)進(jìn)行檢測，化學(xué)發(fā) 光和酶聯(lián)熒光分析法成本較高，且酶聯(lián)熒光分析法操作繁瑣，因此都不適合臨床大量標(biāo)本 的檢測，而且上述檢測方法的測定準(zhǔn)確度低，需要作出進(jìn)一步的改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)成本高、操作復(fù)雜以及測定準(zhǔn)確 度低的缺陷，而提供一種測定肌鈣蛋白I的試劑盒及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是:本發(fā)明公開了一種測定肌鈣蛋白I 的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 30~210 mmol/L 氯化鈉 150~300 mmol/L 聚乙二醇-6000 10-30 g/L 疊氮鈉 0.2~0.8 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 30~210 mmol/L 牛血清白蛋白 6~24 g/L 疊氮鈉 0.5~1.0 g/L 吐溫-80 0.5-1.5 mL/L 甘油 20~45 mmol/L 膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體1~8g/L 其溶劑為純化水。
[0007] 作為優(yōu)選，本發(fā)明公開了一種測定肌鈣蛋白I的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和 試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 120 mmol/L 氯化鈉 200 mmol/L 聚乙二醇-6000 20 g/L 疊氮鈉 0.4 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 120 mmol/L 牛血清白蛋白 15 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 吐溫-80 1.0 mL/L 甘油 30 mmol/L 膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體4 g/L 其溶劑為純化水。
[0008] 作為優(yōu)選，所述的試劑R1中，所述的Tris緩沖液的pH值為8~10。
[0009]作為優(yōu)選，所述的試劑R2中，所述的Tris緩沖液的pH值為8~10。
[0010] 作為優(yōu)選，所述的的試劑R2中，所述的膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體的制備方法如下： 用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為80-500nm的聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙 烯微球的質(zhì)量濃度為1 %_5%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg的1 -乙基-3-(3-二甲基 胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在20-37Γ的條件下反應(yīng)1小時(shí)，然后加入猝滅劑，使用離心機(jī)， 在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，再將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液繼續(xù)稀 釋，在超聲分散儀上超聲分散，再使用離心機(jī)，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上 清，再將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，直至聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為2.0%，超聲 分散，然后邊攪拌邊加入等體積的抗人肌鈣蛋白I抗體，直至聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為 1%，再加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的最終濃度為20 g/L為止，在4°C的條件下封 閉8小時(shí)，即可制備得到膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體。
[0011] 作為優(yōu)選，所述的猝滅劑采用2,2'_硫代雙鎳、2-甲基-1，3-丁二烯、反-1，3-戊二 烯中的一種。
[0012] 作為優(yōu)選，本發(fā)明還公開了上述測定肌鈣蛋白I的試劑盒的制備方法和使用方法， 包括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 30~210 mmol/L 氯化鈉 150~300 mmol/L 聚乙二醇-6000 10-30 g/L 疊氮鈉 0.2~0.8 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 30~210 mmol/L 牛血清白蛋白 6~24 g/L 疊氮鈉 0.5~1.0 g/L 吐溫-80 0.5-1.5 mL/L 甘油 20~45 mmol/L 膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體1~8g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (d) 根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的肌鈣蛋白I的濃度。
[0013]作為優(yōu)選，步驟(b)中，所述的試劑R1和試劑R2的體積比為3:1。
[0014]作為優(yōu)選，步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1: 5到1:20之間。
[0015]本發(fā)明的檢測原理是:本發(fā)明所采用的原理為抗原抗體反應(yīng)原理，樣品中肌鈣蛋 白I可與試劑中相應(yīng)的特異性抗-cTnl抗體結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，產(chǎn)生一定濁度，該濁 度高低在一定抗體存在時(shí)與抗原的含量成正比，在一定波長下測定池度并通過多點(diǎn)定標(biāo)曲 線可進(jìn)行肌鈣蛋白I的定量測定。
式中：△ AT以空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值 Δ As以空白管吸光度作對照的校準(zhǔn)管吸光度值 Cs校準(zhǔn)液中cTnl的濃度。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點(diǎn)： 在牛血清白蛋白作為穩(wěn)定劑的前提價(jià)下，添加了表面活性劑吐溫-80，使得甘油作為助 懸劑的溶解度增加，大大增加了膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體懸浮穩(wěn)定性的增加，試劑的穩(wěn) 定性也就隨之增加，也就有效的提高了對肌鈣蛋白I測定的準(zhǔn)確度的提高，再加上防腐劑疊 氮鈉使得整個(gè)試劑保存時(shí)間更長。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。
[0019] 實(shí)施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris緩沖液 120 mmol/L 氯化鈉 200 mmol/L 聚乙二醇-6000 20 g/L 疊氮鈉 0.4 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 120 mmol/L 牛血清白蛋白 15 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 吐溫-80 1.0 mL/L 甘油 30 mmol/L 膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體4 g/L 其溶劑為純化水。 實(shí)施例2 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris緩沖液 30 mmol/L 氯化鈉 300 mmol/L 聚乙二醇-6000 30 g/L 疊氮鈉 0.2 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 30 mmol/L 牛血清白蛋白 24 g/L 疊氮鈉 1.0 g/L 吐溫-80 1.5 mL/L 甘油 45 mmol/L 膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體8g/L 其溶劑為純化水。 實(shí)施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體的制備：用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為120nm的聚 苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為3%的溶液，然后每毫升溶液中加入 1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在26°C的條件下反應(yīng)1小時(shí)，然 后加入2，2 硫代雙鎳，使用離心機(jī)，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，再將 沉淀用5 0 m m ο 1 / L的Μ E S緩沖液繼續(xù)稀釋，在超聲分散儀上超聲分散，再使用離心機(jī)，在 25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，再將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中， 直至聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為2.0%，超聲分散，然后邊攪拌邊加入等體積的抗人肌鈣蛋 白I抗體，直至聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為1%，再加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的 最終濃度為20 g/L為止，在4°C的條件下封閉8小時(shí)，即可制備得到膠乳包被抗人肌鈣蛋白I 抗體； 2、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 120 mmol/L 氯化鈉 200 mmol/L 聚乙二醇-6000 20 g/L 疊氮鈉 0.4 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 120 mmol/L 牛血清白蛋白 15 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 吐溫-80 1.0 mL/L 甘油 30 mmol/L 膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體4 g/L 其溶劑為純化水； 3、 全自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長520nm，副波長700nm; (c) 反應(yīng)時(shí)間：10min，其中，孵育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：正反應(yīng)； 4、 檢測步驟 (a) 取180μ1試劑R1與24μ1待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入60μ1試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 Δ A = A2-A1； (d) 根據(jù)樣本中肌鈣蛋白I(cTnl)的活性計(jì)算出樣本中 的肌鈣蛋白I的濃度。
[0020] 實(shí)施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體的制備：用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為80nm的聚 苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為4%的溶液，然后每毫升溶液中加入 1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在25°C的條件下反應(yīng)1小時(shí)，然 后加入2-甲基-1,3-丁二稀，使用離心機(jī)，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清， 再將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液繼續(xù)稀釋，在超聲分散儀上超聲分散，再使用離心機(jī)，在 25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，再將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中， 直至聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為2.0%，超聲分散，然后邊攪拌邊加入等體積的抗人肌鈣蛋 白I抗體，直至聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為1%，再加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的 最終濃度為20 g/L為止，在4°C的條件下封閉8小時(shí)，即可制備得到膠乳包被抗人肌鈣蛋白I 抗體； 2、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 30 mmol/L 氯化鈉 300 mmol/L 聚乙二醇-6000 30 g/L 疊氮鈉 0.2 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 30 mmol/L 牛血清白蛋白 24 g/L 疊氮鈉 1.0 g/L 吐溫-80 1.5 mL/L 甘油 45 mmol/L 膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體8g/L 其溶劑為純化水； 3、 全自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長520nm，副波長700nm; (c) 反應(yīng)時(shí)間：10min，其中，孵育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：正反應(yīng)； 4、 檢測步驟 (a) 取180μ1試劑R1與24μ1待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入60μ1試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 ΔΑ = A2-A1; (d) 根據(jù)樣本中肌鈣蛋白I(cTnl)的活性計(jì)算出樣本中 的肌鈣蛋白I的濃度。
[0021]表1為實(shí)施例1所制得的測定肌鈣蛋白I的試劑盒以及實(shí)施例2所制得的測定肌鈣 蛋白I的試劑盒分別對質(zhì)控品1進(jìn)行測定的結(jié)果，其中質(zhì)控品1中的肌鈣蛋白I的濃度為 2.44 ng/mL，測定結(jié)果見表1: 表1
由表1可知，本發(fā)明所制得的測定肌鈣蛋白I的試劑盒對質(zhì)控品1的測定結(jié)果偏差較小， 因此測定準(zhǔn)確度高，而且實(shí)施例1為最優(yōu)的選擇。
[0022] 表2為實(shí)施例1所制得的測定肌鈣蛋白I的試劑盒以及實(shí)施例2所制得的測定肌鈣蛋白I 的試劑盒分別對質(zhì)控品2進(jìn)行測定的結(jié)果，其中質(zhì)控品2中的肌鈣蛋白I的濃度為4.71 ng/ mL，測定結(jié)果見表2:
由表2可知，本發(fā)明所制得的測定肌鈣蛋白I的試劑盒對質(zhì)控品2的測定結(jié)果偏差較小， 因此測定準(zhǔn)確度高，而且實(shí)施例1為最優(yōu)的選擇。
[0023] 表3為實(shí)施例3所制得的測定肌鈣蛋白I的試劑盒對同一待測樣本進(jìn)行的多次反復(fù)測定 以及實(shí)施例4所制得的測定肌鈣蛋白I的試劑盒對同一待測樣本進(jìn)行的多次反復(fù)測定，對所 得的結(jié)果進(jìn)行SD和CV的計(jì)算，結(jié)果如下： 表3
由表3可知本發(fā)明所制得的測定肌鈣蛋白I的試劑盒的精密度比較好，而且由表3可知， 實(shí)施例3為最優(yōu)的選擇。
[0024] 上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測定肌鈣蛋白I的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體 組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 30~210 mmol/L 氯化鈉 150~300 mmol/L 聚乙二醇-6000 10-30 g/L 疊氮鈉 0.2~0.8 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 30~210 mmol/L 牛血清白蛋白 6~24 g/L 疊氮鈉 0.5~1.0 g/L 吐溫-80 0.5-1.5 mL/L 甘油 20~45 mmol/L 膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體1~8g/L 其溶劑為純化水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定肌鈣蛋白I的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú)立的 試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 120 mmol/L 氯化鈉 200 mmol/L 聚乙二醇-6000 20 g/L 疊氮鈉 0.4 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 120 mmol/L 牛血清白蛋白 15 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 吐溫-80 1.0 mL/L 甘油 30 mmol/L 膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體 4 g/L 其溶劑為純化水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定肌鈣蛋白I的試劑盒，其特征在于:所述的試劑R1 中，所述的Tris緩沖液的pH值為8~10。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定肌鈣蛋白I的試劑盒，其特征在于:所述的試劑R2 中，所述的Tris緩沖液的pH值為8~10。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定肌鈣蛋白I的試劑盒，其特征在于:所述的的試劑 R2中，所述的膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體的制備方法如下：用50 mmol/L的MES緩沖液將粒 徑為80-500nm的聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為1%-5%的溶液， 然后每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在20-37 °C的條件下反應(yīng)1小時(shí)，然后加入猝滅劑，使用離心機(jī)，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分 鐘，去上清，再將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液繼續(xù)稀釋，在超聲分散儀上超聲分散，再使 用離心機(jī)，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，再將沉淀懸浮于50 mmol/L的 MES緩沖液中，直至聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為2.0%，超聲分散，然后邊攪拌邊加入等體積 的抗人肌鈣蛋白I抗體，直至聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為1 %，再加入牛血清白蛋白，直至牛 血清白蛋白的最終濃度為20 g/L為止，在4°C的條件下封閉8小時(shí)，即可制備得到膠乳包被 抗人肌鈣蛋白I抗體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種測定肌鈣蛋白I的試劑盒，其特征在于:所述的猝滅劑采 用2,2'_硫代雙鎳、2-甲基-1，3-丁二烯、反-1，3-戊二烯中的一種。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定肌鈣蛋白I的試劑盒的制備方法和使用方法，其 特征在于:包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 30~210 mmol/L 氯化鈉 150~300 mmol/L 聚乙二醇-6000 10-30 g/L 疊氮鈉 0.2~0.8 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 30~210 mmol/L 牛血清白蛋白 6~24 g/L 疊氮鈉 0.5~1.0 g/L 吐溫-80 0.5-1.5 mL/L 甘油 20~45 mmol/L 膠乳包被抗人肌鈣蛋白I抗體 1~8g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (d )根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的肌鈣蛋白I的濃度。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種測定肌鈣蛋白I的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征 在于:步驟(b)中，所述的試劑R1和試劑R2的體積比為3:1。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種測定肌鈣蛋白I的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征 在于:步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:5到1:20之間。
【文檔編號】G01N33/68GK106093418SQ201610358119
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運(yùn)
【申請人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司