梔子提取物在制備具有抗輻射和抗衰老功效的保健食品或化妝品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了梔子提取物在制備具有抗輻射、抗炎和抗衰老功效的保健食品和化妝品中的應(yīng)用，本發(fā)明中的梔子提取物具有抗UVA輻射作用，能顯著降低UV輻射引起的細胞損傷，同時對巨噬細胞炎癥因子表達具有明顯的抑制作用，可發(fā)揮抗炎抗衰老作用；本發(fā)明還從細胞和分子水平闡明了梔子提取物具有抗UV輻射和抗衰老作用。另外，本發(fā)明還公開了上述具有抗輻射和抗衰老功效的梔子提取物的一種優(yōu)選的制備方法。
【專利說明】梔子提取物在制備具有抗輻射和抗衰老功效的保健食品或化妝品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于桅子【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及桅子提取物在制備具有抗輻射和抗衰老功效的保健食品或化妝品中的應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]近年來，來源于植物的活性成分已越來越多的用于藥物、治療、美容目的的組合物。目前，植物桅子提取物被用于各種醫(yī)藥和保健方面。
[0003]衰老是一種生理性現(xiàn)象，生理上表現(xiàn)就是各器官的功能衰退，導(dǎo)致各種老化疾病的產(chǎn)生。而最直觀的證據(jù)即皮膚的老化。在分子水平表現(xiàn)為細胞的衰老，這是與機體老化相伴的一個漸進的事件。衰老不但導(dǎo)致機體的生理功能退化，機體的免疫體統(tǒng)也在逐漸退化。在人體衰老過程中不但由于自身的生理和免疫系統(tǒng)的原因，還有很多外因也會加速衰老，其中紫外的輻射就是引起衰老最為常見的原因，并且由于老化引起的慢性炎癥也是免疫系統(tǒng)退化的一個表征。
[0004]紫外線照射是導(dǎo)致皮膚衰老最主要的環(huán)境因素，紫外線照射使皮膚組織內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，使組織抗氧化防御體系能力減弱，最終導(dǎo)致皮膚衰老。自由基極易侵害細胞膜中的不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成過氧化脂質(zhì)，脂質(zhì)過氧化物的降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)與氨基酸，核酸，蛋白質(zhì)和磷脂等和游離氨基反應(yīng)形成脂自由基，它廣泛地參與機體的生理與病理過程。在正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)氧自由基不易發(fā)生蓄積和過氧化損傷，其中S0D對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，當機體長期受紫外線輻射，體內(nèi)超氧陰離子自由基的產(chǎn)生與清除便失去平衡，氧自由基產(chǎn)生過多時，會對機體產(chǎn)生毒害作用。并且紫外線的輻射還可以引起DNA的損傷。
[0005]衰老或老化是機體代謝過程中的一個必然階段，主要表現(xiàn)為機體對環(huán)境的適應(yīng)能力減弱以至喪失。衰老的機制頗為復(fù)雜，涉及到機體的各個系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能的改變，有關(guān)老化的假說頗多。主要包括神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)說，自由基學(xué)說，免疫學(xué)說，體細胞突變學(xué)說，應(yīng)激學(xué)說等。隨著近現(xiàn)代免疫學(xué)的發(fā)展，人們開始認識到衰老和老年性疾病在許多方面與免疫功能的改變有密切關(guān)系。認為免疫系統(tǒng)與體內(nèi)大多數(shù)器官和細胞保持持續(xù)接觸，它的改變勢必影響這些器官和組織細胞。隨著年齡的增長，免疫機能減退，由此誘發(fā)出一些嚴重影響組織器官的疾病，加劇了機體各系統(tǒng)的衰老過程。阻止或逆轉(zhuǎn)免疫功能的衰竭，可以延緩衰老，并改變衰老病變組織器官的嚴重程度。衰老的免疫學(xué)表現(xiàn)有免疫器官功能衰退，隨著年齡增加，各免疫器官的功能日漸衰退，其中最明顯的是胸腺，胸腺萎縮是老年人免疫功能下降的關(guān)鍵。細胞免疫和體液免疫功能也在衰老的過程中有所改變，細胞免疫是依賴胸腺分化成熟的T細胞發(fā)揮作用的，因此隨著年老胸腺萎縮，T細胞的質(zhì)和量都受到影響是無疑的。免疫和衰老的關(guān)系密切，從免疫的角度提高機體的免疫力來抗衰老和延緩衰老有著重要的意義。
[0006]另外，衰老和炎癥之間也有著密切的聯(lián)系，炎性衰老受到越來越多的關(guān)注，炎癥衰老是指隨著年齡的增長機體出現(xiàn)一個慢性炎癥的過程。炎癥是宿主系統(tǒng)對病原體感染以及各種組織損傷等產(chǎn)生的一系列復(fù)雜的應(yīng)答事件，它通過影響機體微環(huán)境中多種細胞與因子的相互作用，調(diào)控機體多種生理與病理信號網(wǎng)絡(luò)的平衡走向，表現(xiàn)出了高度的兩面性:在一般情況下當致炎因素如感染或組織損傷消除后，炎癥反應(yīng)隨即終結(jié)，之后轉(zhuǎn)變成為一種高度活躍、精細調(diào)控的平衡狀態(tài)，這種炎癥被稱為可控性炎癥。但是在某些不確定因素的作用下，如持續(xù)的或低強度的刺激，靶組織處于長期或過度反應(yīng)時，炎癥無法從抗感染組織損傷模式下轉(zhuǎn)變成為平衡穩(wěn)定的狀態(tài)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的持續(xù)進行表現(xiàn)為非可控性炎癥狀態(tài)。炎性衰老的炎癥具有非可控炎癥的特征。炎癥如同免疫反應(yīng)一樣是機體的正常生理功能，適度的炎癥反應(yīng)對機體有利，反之則有害。炎癥細胞因子網(wǎng)絡(luò)包括促炎癥細胞因子網(wǎng)絡(luò)和抗炎癥細胞因子網(wǎng)絡(luò)。這兩個既相互對立又相互依存的子網(wǎng)絡(luò)的變化控制著炎癥的有利或有害作用的方向。正常情況下他們之間處于一個動態(tài)平衡的關(guān)系，炎性衰老中的病理性炎癥是炎癥細胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡所致，還與炎癥介質(zhì)的異常密切相關(guān)。
[0007]免疫衰老與炎性衰老相伴而行，炎性衰老的機制可以歸納成如下:應(yīng)激學(xué)說，應(yīng)激是機體在各種內(nèi)外環(huán)境因素及社會心理因素刺激時所出現(xiàn)的全身性非特異性適應(yīng)反應(yīng)。應(yīng)激是一把雙刃劍，對機體有利也有害。炎性衰老進程中機體長期處在應(yīng)激原所形成的環(huán)境中。應(yīng)激原是導(dǎo)致和維持慢性促炎性反應(yīng)狀態(tài)存在的原因。氧化炎癥學(xué)說，氧化應(yīng)激、炎性衰老與免疫衰老三者密切相關(guān)。細胞因子學(xué)說，促炎癥細胞因子在慢性炎癥所致機體的炎性衰老中發(fā)揮著重要的作用。
[0008]目前，關(guān)于將桅子提取物在制備具有抗輻射和抗衰老功效的保健食品或化妝品中的應(yīng)用方面的研究，還未見公開。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供桅子提取物在制備具有抗輻射和抗衰老功效的保健食品和化妝品中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明對桅子提取物進行了抗輻射、抗炎和抗衰老的功效細胞生物學(xué)驗證，由于輻射引起炎癥，而炎癥可以引起衰老，因此 申請人:研究了桅子提取物抵抗UVA輻射作用，并且目前關(guān)于此類的應(yīng)用很少。本申請?zhí)峁┑奈ψ犹崛∥锞哂锌筓VA輻射作用，顯著降低UVA輻射引起的真皮細胞和表皮細胞損傷，另外，衰老與炎癥之間也有密切的聯(lián)系， 申請人:同時研究了桅子提取物在體外的抗炎效果，發(fā)現(xiàn)其能有效地抑制巨噬細胞炎癥因子表達。促炎細胞因子能誘導(dǎo)細胞衰老，促炎細胞因子(如TNF-α，IFN-Y，IFN-13 )等通過產(chǎn)生活性氧和激活A(yù)TM/P53/P21信號通路誘導(dǎo)上皮細胞衰老，趨化因子受體CXCR2通過P53通路誘導(dǎo)成纖維細胞衰老，DNA損傷激活NF-KB等信號通路產(chǎn)生促炎細胞因子(IL-1，IL-6，IL-8等)，從而阻滯細胞周期，誘導(dǎo)和維持細胞衰老表型。DNA損傷學(xué)說，由于DNA損傷積累使得干細胞和基質(zhì)成纖維細胞分化為促炎癥細胞因子過表達細胞，使多層狀細胞因子網(wǎng)絡(luò)崩潰，導(dǎo)致炎性而導(dǎo)致衰老。
[0011]本發(fā)明中上述具有抗輻射和抗衰老功效的桅子提取物，可以是市售產(chǎn)品，也可以是采用下述本發(fā)明提供的優(yōu)選的方法制備的桅子提取物。
[0012]本發(fā)明提供的上述具有抗輻射和抗衰老功效的桅子提取物的制備方法，含以下步驟:[0013](1)前處理:將原料桅子清洗，粉碎；
[0014](2)提取:水超聲室溫提取后，過濾，得到B提取液；
[0015](3)陶瓷膜過濾:將B提取液采用陶瓷膜錯流過濾，得到C過濾液；
[0016](4)上樣:將C過濾液采用PIP0-02大孔樹脂分離柱上樣；
[0017](5)分離:將步驟(4)中的PIP0-02大孔樹脂分離柱進行除雜和分離純化處理獲得洗脫液；
[0018](6)濃縮干燥:將步驟(5)獲得的洗脫液經(jīng)真空減壓濃縮并真空干燥后得到桅子提取物。
[0019]在上述步驟中:
[0020]本發(fā)明步驟(1)中粉碎后過篩至30?60目。
[0021]本發(fā)明步驟(2)中水的用量占桅子原料總重量的8-10倍，水超聲室溫提取2次，每次20-40分鐘。
[0022]本發(fā)明步驟(2)中過濾時采用500-800目濾布。
[0023]本發(fā)明步驟(3)中陶瓷膜的孔徑為0.3微米，所述陶瓷膜使用經(jīng)再生處理，再生處理為依次用水、質(zhì)量百分含量為2%的NaOH、水、質(zhì)量百分含量為2%的ΗΝ03清洗再生。
[0024]本發(fā)明步驟(4)中將C過濾液采用PIP0-02大孔樹脂分離柱上樣的具體過程為:將C過濾液上到PIP0-02大孔樹脂第一節(jié)粗分離柱CF01，至流出液為微紅色串接上PIP0-02大孔樹脂第二節(jié)粗分離柱CF02，同樣至流出液為微紅色，在第二節(jié)粗分離柱CF02下方串接上PIP0-02大孔樹脂第三節(jié)粗分離柱至流出液微紅色，取下PIP0-02大孔樹脂第三節(jié)粗分離柱CF03，在第二節(jié)粗分離柱CF02下方串接上PIP0-02第四節(jié)粗分柱CF04上樣至流出液為微紅色，將四節(jié)粗分離柱CF01、CF02、CF03和CF04拆開備用。
[0025]本發(fā)明步驟(5)中將步驟(4)中的PIP0-02大孔樹脂分離柱進行除雜和分離純化處理獲得洗脫液的具體過程為:將步驟(4)中的粗分離柱CF01按照以下程序進行除雜和分離純化處理，取粗分離柱CF01，用5-8倍原料桅子重量的水洗柱，再分別接上一根PIP0-02精分離柱，用體積百分含量為20%的乙醇洗脫5-8倍原料桅子重量的洗脫液后，在PIP0-02精分離柱下方再接上一根PIP0-01雜質(zhì)柱，用體積百分含量為25%的乙醇洗脫20倍原料桅子重量的洗脫液后，在PIP0-02精分離柱下方換上新的第二根PIP0-01雜質(zhì)柱，再洗脫20倍原料桅子重量的洗脫液后，再換上新的第三根PIP0-01雜質(zhì)柱，洗脫20倍原料桅子重量的洗脫液后，再換上第四根PIP0-01雜質(zhì)柱，完成第四根PIP0-01雜質(zhì)柱的洗脫后，去掉第四根PIP0-01雜質(zhì)柱，用3-5倍原料桅子重量的體積百分含量為50%的乙醇洗脫粗分離柱CF01和PIP0-02精分離柱，獲得洗脫液XT01，對粗分離柱CF02、CF03和CF04采用與粗分離柱CF01同樣的方式除雜和分離純化處理，分別獲得洗脫液XT02，XT03和ΧΤ04，將各洗脫液合并后備用。
[0026]本發(fā)明步驟(4)中優(yōu)選在40_70°C真空減壓濃縮。
[0027]本發(fā)明步驟(4)中桅子提取物中經(jīng)HPLC檢測藏紅花素的質(zhì)量百分含量在70%以上。
[0028]以上是本發(fā)明優(yōu)選的桅子提取物的制備方法。
[0029]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0030](1)采用本發(fā)明方法提取的桅子提取物，其中藏紅花素成分占到70% (質(zhì)量百分含量)以上，藏紅花素通常在保健品或化妝品中應(yīng)用量小，含量明確容易質(zhì)量控制；
[0031](2)采用本發(fā)明方法制備獲得的桅子提取物色澤淺談，適合化妝品中應(yīng)用，不影響化妝品的原有色澤；
[0032](3)采用本發(fā)明方法提取桅子提取物的提取效率高，能充分利用資源；
[0033](4)本發(fā)明的桅子提取物生產(chǎn)制備成本低，宜于在保健品或化妝品中應(yīng)用，具有市場競爭力；
[0034](5)本發(fā)明經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，桅子提取物能顯著降低UV輻射引起的細胞損傷，同時對巨噬細胞炎癥因子表達具有明顯的抑制作用，因而發(fā)揮抗衰老作用，從細胞和分子水平闡明了本發(fā)明中的桅子提取物產(chǎn)品具有抗UV輻射、保護細胞和抗衰老作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1是本發(fā)明實施例4中(1.2)桅子提取物對UVA照射下的3T3細胞保護作用；
[0036]圖2是本發(fā)明實施例4中(1.3)彗星電泳檢測細胞DNA損傷的實驗結(jié)果，其中左圖為加入了桅子提取物的3T3細胞，中圖為有UVA照射的3T3細胞，右圖為無UVA照射的3T3細胞的細胞DNA產(chǎn)生彗星拖尾率，其中橫標依次為無UVA照射的3T3細胞，有UVA照射的3T3細胞，加入了桅子提取物的3T3細胞；縱標為細胞DNA產(chǎn)生彗星拖尾率；
[0037]圖3是本發(fā)明實施例4中(1.4)流式細胞儀檢測桅子提取物對UVA輻射3T3細胞周期的保護作用，其中A圖為無UVA照射的3T3細胞，B圖為有UVA照射的3T3細胞，C圖為加入了桅子提取物的3T3細胞，縱坐標為細胞數(shù)目；
[0038]圖4是本發(fā)明實施例4中(1.5) MTT法檢測桅子提取物對RAW264.7細胞毒性；
[0039]圖5是本發(fā)明實施例4 (1.5)中PCR檢測桅子提取物在轉(zhuǎn)錄水平抑制或降低炎癥因子IL-6的產(chǎn)生，其中橫標:RAW624.7細胞控制組，LPS組和桅子提取物組；縱標:mRNA的相關(guān)表達水平；
[0040]圖6是本發(fā)明實施例4 (1.5)中PCR檢測桅子提取物在轉(zhuǎn)錄水平抑制或降低炎癥因子IL-1的產(chǎn)生，其中橫標:RAW624.7細胞控制組，LPS組和桅子提取物組；縱標:mRNA的相關(guān)表達水平；
[0041]圖7是本發(fā)明實施例4 (1.5)中PCR檢測桅子提取物在轉(zhuǎn)錄水平抑制或降低炎癥因子TNF-alpha的產(chǎn)生，其中橫標:RAW624.7細胞控制組，LPS組和桅子提取物組；縱標:mRNA的相關(guān)表達水平；
[0042]圖8是本發(fā)明實施例4 (1.5)中PCR檢測桅子提取物在轉(zhuǎn)錄水平抑制或降低炎癥因子MCP-1的產(chǎn)生，其中橫標:RAW624.7細胞控制組，LPS組和桅子提取物組；縱標:mRNA的相關(guān)表達水平；
[0043]圖9是本發(fā)明實施例4 (1.5)中PCR檢測桅子提取物在轉(zhuǎn)錄水平抑制或降低炎癥因子MCP-1的產(chǎn)生。
【具體實施方式】
[0044]下面是結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0045](一)本發(fā)明優(yōu)選的桅子提取物的提取方法
[0046]實施例1[0047]本發(fā)明提供的桅子提取物的優(yōu)選的制備方法，步驟如下:
[0048]A:前處理:將原料桅子用水洗凈，粉碎，過篩至30-60目，稱重1千克；
[0049]B:提取:用8-10千克的水超聲室溫提取2次，每次20_40分鐘，500-800目濾布過濾，得到B提取液；
[0050]C:陶瓷膜過濾:將B提取液過0.3微米的陶瓷膜，得到C過濾液，陶瓷膜錯流過濾，膜再生可依次用水、2% (質(zhì)量百分含量，下同)NaOH、水、2% (質(zhì)量百分含量，下同)的ΗΝ03清洗再生；
[0051]D:上樣:將C過濾液上到PIP0-02第一節(jié)粗分離柱(CF01)，至流出液為微紅色接上PIP0-02第二節(jié)粗分離柱(CF02)，同樣流出微紅色串上PIP0-02第三節(jié)粗分離柱至流出液微紅色，取下PIP0-02第三節(jié)粗分離柱(CF03)，在第二節(jié)粗分離柱CF02下方接上PIP0-02第四節(jié)粗分柱(CF04)上樣至流出液為微紅色即可；
[0052]E:分離:以CF01為例，按照下述的程序洗脫雜質(zhì)和分離純化，將CF01用5_8千克水洗柱，再接上一根PIP0-02精分離柱，用20% (體積百分含量，下同)乙醇洗脫5-8千克，在PIP0-02精分離柱下方接上第一根PIP0-01雜質(zhì)柱，用25% (體積百分含量，下同)乙醇洗脫20千克，換上新的第二根PIP0-01雜質(zhì)柱再洗脫20千克，接著換上新的第三根PIP0-01雜質(zhì)柱再洗脫20千克，最后換上新的第四根PIP0-01雜質(zhì)柱再洗脫20千克，如此這樣，完成第四根PIP001雜質(zhì)柱的洗脫，再用3-5千克50% (體積百分含量，下同)乙醇洗脫CF01和PIP0-02精分離柱，獲得洗脫液XT01，對粗分離柱CF02、CF03和CF04采用與粗分離柱CF01同樣的方式除雜和分離純化處理，分別獲得洗脫液XT02，XT03和XT04，將各洗脫液合并后備用;
[0053]F:濃縮干燥:在40-70度真空減壓濃縮洗脫液，并真空干燥得到桅子提取物，用HPLC藏紅花素對照品測試發(fā)現(xiàn)，桅子提取物中藏紅花素的質(zhì)量百分含量在70%以上，稱重為30-50克。
[0054]實施例2
[0055]本發(fā)明提供的桅子提取物的優(yōu)選的制備方法，步驟如下:
[0056]A前處理:將原料桅子用水洗凈，粉碎，過篩至30-60目，稱重10千克；
[0057]B提取:用80-100千克的水超聲室溫提取2次，每次20_40分鐘，500-800目濾布過濾，得到B提取液；
[0058]C陶瓷膜過濾:將B提取液過0.3微米的陶瓷膜，得到C過濾液，陶瓷膜錯流過濾，膜再生可依次用水、2%Na0H、水、2%HN03清洗再生；
[0059]D上樣:將C過濾液上到PIP002第一節(jié)粗分離柱(CF01)，至流出液為微紅色接上PIP002第二節(jié)粗分離柱(CF02)，同樣流出微紅色串上PIP002第三節(jié)粗分離柱至流出液微紅色，取下PIP002第三節(jié)粗分離柱(CF03)，接上PIP002第四節(jié)粗分柱(CF04)上樣至流出液為微紅色即可。
[0060]E分離:以CF01為例，按照下述的程序洗脫雜質(zhì)和分離純化，將CF01用50_80千克水洗柱，再接上一根PIP0-02精分離柱，用20%乙醇洗脫50-80千克，在PIP0-02精分離柱下方接上第一根PIP0-01雜質(zhì)柱，用25%乙醇洗脫200千克，換上新的第二根PIP0-01雜質(zhì)柱再洗脫200千克，接著換上新的第三根PIP0-01雜質(zhì)柱再洗脫200千克，最后換上新的第四根PIP0-01雜質(zhì)柱再洗脫200千克，如此這樣，完成第四根PIP001雜質(zhì)柱的洗脫，再用30-50千克50%乙醇洗脫CF01和PIP0-02精分離柱，獲得洗脫液XT01，對粗分離柱CF02、CF03和CF04采用與粗分離柱CF01同樣的方式除雜和分離純化處理，分別獲得洗脫液XT02，XT03和XT04，將各洗脫液合并后備用；
[0061]F:濃縮干燥:在40-70度真空減壓濃縮洗脫液，并真空干燥得到桅子提取物，用HPLC藏紅花素對照品測試發(fā)現(xiàn)，桅子提取物中藏紅花素的質(zhì)量百分含量在70%以上，稱重為 300-500 克。
[0062]實施例3
[0063]本發(fā)明提供的桅子提取物的優(yōu)選的制備方法，步驟如下:
[0064]A前處理:將原料桅子用水洗凈，粉碎，過篩至30-60目，稱重100千克；
[0065]B提取:用800-1000千克的水超聲室溫提取2次，每次20-40分鐘，500-800目濾布過濾，得到B提取液；
[0066]C陶瓷膜過濾:將B提取液過0.3微米的陶瓷膜，得到C過濾液，陶瓷膜錯流過濾，膜再生可依次用水、2%Na0H、水、2%HN03清洗再生；
[0067]D上樣:將C過濾液上到PIP002第一節(jié)粗分離柱(CF01)，至流出液為微紅色接上PIP002第二節(jié)粗分離柱(CF02)，同樣流出微紅色串上PIP002第三節(jié)粗分離柱至流出液微紅色，取下PIP002第三節(jié)粗分離柱(CF03)，接上PIP002第四節(jié)粗分柱(CF04)上樣至流出液為微紅色即可。
[0068]E分離:以CF01為例，按照下述的程序洗脫雜質(zhì)和分離純化，將CF01用500-800千克水洗柱，再接上一根PIP0-02精分離柱，用20%乙醇洗脫500-800千克，在PIP0-02精分離柱下方接上第一根PIP0-01雜質(zhì)柱，用25%乙醇洗脫2000千克，換上新的第二根PIP0-01雜質(zhì)柱再洗脫2000千克，接著換上新的第三根PIP0-01雜質(zhì)柱再洗脫200千克，最后換上新的第四根PIP0-01雜質(zhì)柱再洗脫2000千克，如此這樣，完成第四根PIP001雜質(zhì)柱的洗脫，再用300-500千克50%乙醇洗脫CF01和PIP0-02精分離柱，獲得洗脫液XT01，對粗分離柱CF02、CF03和CF04采用與粗分離柱CF01同樣的方式除雜和分離純化處理，分別獲得洗脫液XT02，XT03和XT04，將各洗脫液合并后備用；
[0069]F:濃縮干燥:在40-70度真空減壓濃縮洗脫液，并真空干燥得到桅子提取物，用HPLC藏紅花素對照品測試發(fā)現(xiàn)，桅子提取物中藏紅花素的質(zhì)量百分含量在70%以上，稱重為 3kg-5kg。
[0070](二)桅子提取物的功效試驗
[0071 ] 實施例4桅子提取物抗輻射和抗衰老功效驗證
[0072]4.1實驗原料
[0073]以下采用本發(fā)明實施例1中制備獲得桅子提取物，進行抗輻射和抗衰老功效驗證。
[0074]4.2抗輻射功效驗證實驗
[0075]采用本發(fā)明實施例1中制備得桅子提取物對UVA輻射3T3細胞的防護作用，方法如下:
[0076]通過MTT法檢測細胞增殖情況來測定化合物對UVA輻射3T3細胞的防護作用。
[0077](1)收集對數(shù)期3T3細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100 μ L，鋪板使待測細胞調(diào)密度至1000-10000孔；[0078](2)2.5%C02，37°C孵育，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，梯度濃度依次為:200 μ g/mL , 100 μ g/mL , 50 μ g/mL , 25 μ g/mL , 12.5 μ g/mL , 6.25 μ g/mL,每個梯度設(shè)置3個復(fù)孔，每組設(shè)置3個空白孔，對照組不作處理5%C02，37°C孵育16-24小時；
[0079](3)輻射組各組細胞按UVA輻射劑量條件摸索實驗的得到的紫外條件進行紫外輻射:輻照時間45min ;輻射劑量1.4J/cm2，對照組不作處理，5%C02，37°C孵育16-24小時；
[0080](4)每孔加入10 μ LMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；
[0081](5)每孔加入100 μ L 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀0D570nm處測量各孔的吸光值；
[0082]結(jié)果如圖1中所示，試驗結(jié)果表明，采用本發(fā)明實施例1中提取的桅子提取物對UVA輻射3T3細胞具有防護的活性(≤90%cell viability)。
[0083]4.3抗炎抗衰老作用功效驗證實驗
[0084]采用彗星電泳檢測本發(fā)明實施例1中制備得桅子提取物對UVA輻射3T3細胞DNA的保護作用，方法如下:DNA損傷越嚴重，導(dǎo)致DNA超螺旋結(jié)構(gòu)越松散，產(chǎn)生的斷裂點越多，DNA片段越小，從而在彗星尾部出現(xiàn)的DNA斷片越多，則慧尾的長度、面積和熒光強度越大。通過測量彗星尾部的長度、面積或熒光強度等指標，可以對DNA的損傷程度進行定量分析。
[0085](1)3Τ3細胞預(yù)12孔板，細胞密度為70% ；
[0086](2)化合物處理:將上述實驗篩選出的化合物稀釋至200 μ g/mL (我們采用有效最大濃度作為該實驗的藥物工作濃度)，吸棄培養(yǎng)基，加入稀釋的化合物稀釋液，每孔lmL，37度，5%C02的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h ；
[0087](3)將處理的細胞UVA輻照lh，60uff/cm2, 37°C，5%C02的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h ；
[0088](4)胰酶消化細胞，含血清的培養(yǎng)基終止消化，將細胞液轉(zhuǎn)入15mL離心管內(nèi)，1000rpm/min,離心5min,棄上清，加入適量PBS重懸細胞，同上離心5min,棄PBS,加入適量的PBS重懸細胞，調(diào)細胞濃度至106cells/mL ；
[0089](5)制膠:溶解0.7%濃度的正常熔點瓊脂糖，快速滴加70 μ L至干凈的載玻片，快速用蓋玻片壓膠，4°C凝膠20min，輕輕剝離蓋玻片，將細胞懸液和0.8%低熔點瓊脂糖混勻，快速滴加至第一層膠上，快速蓋玻片壓膠，4°C凝膠20min ；
[0090](6)輕輕剝離第二層膠上的蓋玻片，將膠放入堿性裂解液中，4°C裂解1.5~2h ;
[0091](7)輕輕取出載玻片，用單蒸水洗膠2次；
[0092](8)將膠放入堿性電泳液中，靜置20min，25V，電泳15min，pH7.5的Tris_HCl中和三次，每次5min ；
[0093](9) PI染色鏡檢，拍照。
[0094]彗星電泳檢測細胞DNA損傷的實驗結(jié)果如圖2中所示，本發(fā)明實施例1中制備得桅子提取物對UVA輻射引起的DNA損傷具有顯著地抑制作用。
[0095]4.4抗炎抗衰老作用功效驗證實驗
[0096]流式細胞儀檢測藥物本發(fā)明實施例1中制備得桅子提取物對UVA輻射3T3細胞周期的保護作用，方法如下:細胞DNA損傷，發(fā)動細胞基因組修復(fù)機制，調(diào)節(jié)細胞周期進而完成基因組的損傷修復(fù)，保證細胞基因組的完整。UV輻射對細胞的基因組DNA造成斷裂損傷，必將導(dǎo)致細胞周期發(fā)生變化。因此利用細胞流式儀來檢測化合物對變化的細胞周期是否具有調(diào)節(jié)抑制作用。[0097](1) 3T3細胞預(yù)12孔板，培養(yǎng)過夜；
[0098](2)細胞藥物處理:將藥物做濃度稀釋，加入細胞，24h后UVA輻射lh，60 μ ff/cm2,細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后收樣品；
[0099](3)胰酶消化細胞，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管，1000rpm/min離心5min,棄上清，PBS洗兩遍，離心條件同上，棄PBS，加入500 μ L的70%乙醇4度固定過夜；
[0100](4)棄PBS，加入500μ L的70%乙醇4°C固定過夜；
[0101](5) 1000rpm/min, 4°C，離心5min,棄乙醇，加入PBS重懸，同上離心；
[0102](6)棄PBS，加入含有DNA酶I和PI染料的PBS中，200目的篩網(wǎng)過濾；
[0103](7)上細胞流式儀測周期；
[0104]流式細胞儀檢測細胞周期，結(jié)果如圖3中所示，其中G1是DNA合成前期，細胞靜止期；S為DNA復(fù)制時期；G2是DNA合成后期，為增殖期的細胞。如果G1加藥前>G1加藥后，S期和G2期的細胞比例增加，細胞則表現(xiàn)增殖活躍。
[0105]圖3中的流式結(jié)果表明:本發(fā)明實施例1中制備得桅子提取物1與UVA組數(shù)據(jù)相比，桅子提取物具有保護作用。
[0106]4.5抗炎抗衰老作用機理驗證實驗
[0107]MTT法檢測篩選的本發(fā)明實施例1中制備得桅子提取物對RAW264.7細胞毒性，方法如下:
[0108](1)收集對數(shù)期RAW264.7細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100 μ L，鋪板使待測細胞調(diào)密度至1000-10000孔；
[0109](2)2.5%C02，37°C孵育，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，隨機分為60組，每個藥物一組，每組加入濃度梯度的桅子提取物，梯度濃度依次為:200 μ g/mL、100 μ g/mL、50 μ g/mL、25 μ g/mL、12.5 μ g/mL、6.25 μ g/mL,每個梯度設(shè)置3個復(fù)孔，每組設(shè)置3個空白孔，5%C02，37°C孵育16-48小時；
[0110](3)每孔加入10 μ LMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；
[0111](4)每孔加入100 μ L 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀0D570nm處測量各孔的吸光值；
[0112]本發(fā)明實施例1中制備得桅子提取物對RAW264.7細胞的毒性如圖4中所示，從圖4中可以看出，桅子提取物對細胞無毒害的最大無毒濃度。
[0113]4.6抗炎抗衰老作用功效驗證實驗
[0114]PCR檢測本發(fā)明實施例1中制備得桅子提取物在轉(zhuǎn)錄水平抑制或降低炎癥因子的產(chǎn)生，方法如下:對篩選得到的具有抗UVA輻射的化合物桅子提取物在巨噬細胞RAW264.7細胞模型進行抗炎活性實驗。
[0115](1)取對數(shù)期RAW264.7細胞，預(yù)24孔板，鋪板調(diào)整細胞密度為3 X 105cellS/mL ；
[0116](2)加入50ng/mL的PMA,培養(yǎng)48h,在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)；
[0117](3)小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS沖洗2遍后，加入無血清的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h ；
[0118](4)加入100ng/mL的LPS以及桅子提取物，培養(yǎng)18?24h ；
[0119](5)抽提給藥組細胞的RNA，使用real-time PCR法對IL-6和IL-1 (Interleukin-6, nterleukin-1，白細胞介素 6 白細胞介素 1)，TNF- a (tumor necrosisfactor-alpha,腫瘤壞死因子)，MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1,巨卩遼細胞趨化蛋白1)、和iNOS進行定性定量分析，觀察活性物對炎性因子表達的影響，本發(fā)明實施例1中制備得桅子提取物對炎癥因子的表達的抑制作用。
[0120]IL-6 和 IL-1 (Interleukin-6, nterleukin-1,白細胞介素 6 白細胞介素 1)的結(jié)果如圖5和6中所不,TNF_a (tumor necrosis factor-alpha,腫瘤壞死因子)的結(jié)果如圖7中所不，MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1,巨卩遼細胞趨化蛋白1)和iNOS結(jié)果如圖8和9中所示，
[0121]從圖5-9中可以看出:檢測本發(fā)明實施例1中制備的桅子提取物表現(xiàn)出不同的抑炎作用，本發(fā)明實施例1中制備的桅子提取物對MCP-1和iNos的抑制作用顯著。
[0122]實際上，本發(fā)明 申請人:還同時對其他來源的桅子提取物如市售的桅子提取物以或市售產(chǎn)品的上述試驗，結(jié)果表明，也具有上述試驗效果，具有抗輻射和抗衰老功效。
[0123]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.桅子提取物在制備具有抗輻射和抗衰老功效的保健食品或化妝品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桅子提取物在制備具有抗輻射和抗衰老功效的保健食品或化妝品中的應(yīng)用，其特征是:所述的桅子提取物中藏紅花素的質(zhì)量百分含量在70%以上。
3.一種具有抗輻射和抗衰老功效的桅子提取物的制備方法，其特征是:含以下步驟:(1)前處理:將原料桅子清洗，粉碎；(2)提取:水超聲室溫提取后，過濾，得到B提取液；(3)陶瓷膜過濾:將B提取液采用陶瓷膜錯流過濾，得到C過濾液；(4)上樣:將C過濾液采用PIP0-02大孔樹脂分離柱上樣；(5)分離:將步驟(4)中的PIP0-02大孔樹脂分離柱進行除雜和分離純化處理獲得洗脫液；(6 )濃縮干燥:將步驟(5 )獲得的洗脫液真空減壓濃縮和真空干燥后得到桅子提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗輻射和抗衰老功效的桅子提取物的制備方法，其特征是:步驟(1)中粉碎后過篩至30~60目。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗輻射和抗衰老功效的桅子提取物的制備方法，其特征是:步驟(2)中水的用量占桅子原料總重量的8-10倍，水超聲室溫提取2次，每次20-40分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗輻射和抗衰老功效的桅子提取物的制備方法，其特征是:步驟(2)中過濾時采用500-800目濾布。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗輻射和抗衰老功效的桅子提取物的制備方法，其特征是:步驟(3)中陶瓷膜的孔徑為0.3微米，所述陶瓷膜使用經(jīng)再生處理，再生處理為依次用水、質(zhì)量百分含量為2%的NaOH、水、質(zhì)量百分含量為2%的ΗΝ03清洗再生。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗輻射和抗衰老功效的桅子提取物的制備方法，其特征是:步驟(4)中將C過濾液采用PIP0-02大孔樹脂分離柱上樣的具體過程為:將C過濾液上到PIP0-02大孔樹脂第一節(jié)粗分離柱CF01，至流出液為微紅色串接上PIP0-02大孔樹脂第二節(jié)粗分離柱CF02，同樣至流出液為微紅色，在第二節(jié)粗分離柱CF02下方串接上PIP0-02大孔樹脂第三節(jié)粗分離柱至流出液微紅色，取下PIP0-02大孔樹脂第三節(jié)粗分離柱CF03，在第二節(jié)粗分離柱CF02下方串接上PIP0-02第四節(jié)粗分柱CF04上樣至流出液為微紅色，將四節(jié)粗分離柱CF01、CF02、CF03和CF04拆開備用。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗輻射和抗衰老功效的桅子提取物的制備方法，其特征是:步驟(5)中將步驟(4)中的PIP0-02大孔樹脂分離柱進行除雜和分離純化處理獲得洗脫液的具體過程為:將步驟(4)中的粗分離柱CF01按照以下程序進行除雜和分離純化處理，取粗分離柱CF01，用5-8倍原料桅子重量的水洗柱，再分別接上一根PIP0-02精分離柱，用體積百分含量為20%的乙醇洗脫5-8倍原料桅子重量的洗脫液后，在PIP0-02精分離柱下方再接上一根PIP0-01雜質(zhì)柱，用體積百分含量為25%的乙醇洗脫20倍原料桅子重量的洗脫液后，在PIP0-02精分離柱下方換上新的第二根PIP0-01雜質(zhì)柱，再洗脫20倍原料桅子重量的洗脫液后，再換上新的第三根PIP0-01雜質(zhì)柱，洗脫20倍原料桅子重量的洗脫液后，再換上第四根PIP0-01雜質(zhì)柱，完成第四根PIP0-01雜質(zhì)柱的洗脫后，去掉第四根PIP0-01雜質(zhì)柱，用3-5倍原料桅子重量的體積百分含量為50%的乙醇洗脫粗分離柱CF01和PIP0-02精分離柱，獲得洗脫液XT01，對粗分離柱CF02、CF03和CF04采用與粗分離柱CF01同樣的方式除雜和分離純化處理，分別獲得洗脫液XT02，XT03和XT04，將各洗脫液合并后備用。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗輻射和抗衰老功效的桅子提取物的制備方法，其特征是:步驟(4)中在40-70°C真空減壓濃縮。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗輻射和抗衰老功效的桅子提取物的制備方法，其特征是:步驟(4)中桅子提取物中經(jīng)HPLC`檢測藏紅花素的質(zhì)量百分含量在70%以上。
【文檔編號】A61P39/06GK103652854SQ201310521803
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】趙宏偉, 王一飛, 吳志韻, 袁曉, 唐青濤, 馬忠華 申請人:無限極（中國）有限公司