一種固定化蚯蚓纖溶酶的磁性微球及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于磁性微球技術(shù)領(lǐng)域，具體是設(shè)及用于固定化版蝴纖溶酶的磁性微球的 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 磁性高分子微球是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型磁性材料，是通過(guò)適當(dāng)方法將磁性無(wú) 機(jī)粒子與有機(jī)高分子結(jié)合形成的具有一定磁性及特殊結(jié)構(gòu)的復(fù)合微球。磁性復(fù)合微球不僅 具有普通高分子微球的眾多特性還具有磁響應(yīng)性，所W不僅能夠通過(guò)共聚及表面改性等方 法賦予其表面功能基（如-0H、-C00H、-C冊(cè)、-畑2,等），還能在外加磁場(chǎng)作用下具有導(dǎo)向功 能。磁性微球在固定化酶、細(xì)胞分離、蛋白質(zhì)分離和純化、免疫測(cè)定、祀向藥物和DNA分離與 核酸雜交等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。目前常用于制備磁性微球的方法有包埋法、懸浮聚 合法，運(yùn)些方法制備得到的磁性微球粒徑分布較寬，形狀不規(guī)則。
[0003] 綠豆膜蛋白酶抑制劑屬于Bowman-Birk型絲氨酸蛋白酶抑制劑，含有7對(duì)二硫 鍵，72個(gè)氨基酸殘基，分子量為7. 98kD，具有2個(gè)同源的結(jié)構(gòu)域。抑制活性由活性中屯、及 附近的氨基酸殘基決定，綠豆膜蛋白酶抑制劑含有兩個(gè)活性中屯、，分別為L(zhǎng)ys20-Ser21和 Arg47-Ser48,運(yùn)兩個(gè)活性片段可被消化酶消化分離，并都具有膜蛋白酶抑制活性，其中Arg 活性片段有27個(gè)氨基酸殘基組成，而Lys活性片段有兩個(gè)膚鏈組成，由26個(gè)氨基酸殘基組 成的長(zhǎng)鏈和9個(gè)氨基酸殘基組成的短鏈，它們分別由分子內(nèi)二硫鍵形成環(huán)狀，綠豆膜蛋白 酶抑制劑對(duì)熱、酸、堿的穩(wěn)定性很高。綠豆中含有的膜蛋白酶抑制劑的比活力是大豆膜蛋白 酶抑制劑的2. 76倍。
[0004] 版蝴纖溶酶又稱(chēng)蝴激酶，是從版蝴體內(nèi)提取出來(lái)的既具有直接溶解纖維蛋白的纖 溶酶活性，又具有類(lèi)尿激酶的纖溶酶原激活活性的一類(lèi)蛋白質(zhì)，既能溶解陳舊血栓又能抑 制新血栓形成，實(shí)驗(yàn)表明該酶具有抗凝、溶纖、改善血液流變學(xué)性質(zhì)，是預(yù)防和治療血栓疾 病的有效藥物，該酶屬于絲氨酸蛋白酶，可被絲氨酸蛋白酶抑制劑如大豆膜蛋白酶抑制劑 抑制，近幾年的臨床應(yīng)用表明，它在治療腦血栓、半身不遂、屯、肌梗塞等血栓類(lèi)疾病方面具 有見(jiàn)效快、療效良好、口服有效、且較安全等優(yōu)點(diǎn)。大量研究表明版蝴纖溶酶無(wú)論靜脈注射 或口服給藥，均具有溶栓作用，是一種目前較為理想的血栓病治療藥物，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前 景。通常纖溶酶的提取是通過(guò)版蝴勻漿、鹽析、凝膠層析、離子交換層析及高效液相色譜 0PLC)等一系列步驟進(jìn)行分離純化得到，該方法提取得到的纖溶酶純度高，但由于純化工 序復(fù)雜成本高，耗時(shí)長(zhǎng)經(jīng)濟(jì)效益低，只能用于實(shí)驗(yàn)室研究，很難用于工業(yè)生產(chǎn)，如何得到穩(wěn) 定的高活性的版蝴纖溶酶，可W為版蝴資源的利用開(kāi)辟一條道路。
[0005] 目前還沒(méi)有關(guān)于綠豆膜蛋白酶抑制劑偶聯(lián)殼聚糖磁性微球用于固定化版蝴纖溶 酶的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種固定化版蝴纖溶酶的磁性微球及其制備方法。其W綠 豆膜蛋白酶抑制劑為配基，與磁性微球偶聯(lián)，運(yùn)用用于版蝴纖溶酶的分離純化，提高了版蝴 纖溶酶的分離純化選擇性，而且磁性微球易于與版蝴纖溶酶分離。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] -種固定化版蝴纖溶酶的磁性微球，其酶活性為25-3抓/mg，在抑6. 5~8. 0之間 的穩(wěn)定性能保持在75%W上，儲(chǔ)藏時(shí)間在30天內(nèi)固定化版蝴纖溶酶的磁性微球的酶活性 為80%W上。
[0009] 本發(fā)明的固定化版蝴纖溶酶的磁性微球的制備方法，其包括如下步驟：
[0010] (1)磁性殼聚糖微球的偶聯(lián)：將綠豆膜蛋白酶抑制劑溶于抑3~9的緩沖液中得 到蛋白酶緩沖液，再將其加入到經(jīng)過(guò)活化的磁性殼聚糖微球中，水浴振蕩偶聯(lián)2~1地，振 蕩溫度40~60°C，后得到偶聯(lián)綠豆膜蛋白酶抑制劑的磁性殼聚糖微球；
[0011] (2)版蝴纖溶酶的固定化：再將偶聯(lián)綠豆膜蛋白酶抑制劑的磁性殼聚糖微球加入 蟲(chóng)丘蝴纖溶酶粗酶溶液在30-60°C恒溫水浴搖床中振蕩固化反應(yīng)0. 5-化；反應(yīng)結(jié)束后，用去 離子水和抑為6-8的憐酸緩沖液反復(fù)洗涂固定化版蝴纖溶酶的磁性殼聚糖微球粗品，至洗 涂液中檢測(cè)不出蛋白為止，磁鐵分離收集即可得到固定化版蝴纖溶酶的磁性微球。
[0012] 作為技術(shù)方案的優(yōu)選，所述步驟（1)中的緩沖液為巧樣酸-憐酸二氨鋼。所述蛋 白酶緩沖液與活化的磁性殼聚糖微球的液固比為5~30 : 1，水浴振蕩偶聯(lián)4~6h。運(yùn)個(gè) 工藝條件得到的偶聯(lián)綠豆膜蛋白酶抑制劑的磁性殼聚糖微球性能特別好。
[0013] 作為技術(shù)方案的優(yōu)選，所述步驟（2)中，每克偶聯(lián)綠豆膜蛋白酶抑制劑的磁性殼 聚糖微球則加入1~5ml酶活為1-2萬(wàn)U/mL的版蝴纖溶酶粗酶溶液。
[0014] 本發(fā)明中活化的磁性殼聚糖微球的制備是將磁性殼聚糖微球，加入化0H溶液和 NaBH4溶液，在30~80°C水浴振蕩30~40min，再加入二甲基亞諷為活化劑，再加入體積分 數(shù)為10%~60%的環(huán)氧氯丙烷，振蕩活化2~1化后，抽濾，用蒸饋水洗涂即可得到活化的 磁性殼聚糖微球。
[0015] 作為技術(shù)方案的進(jìn)一步優(yōu)選，所述磁性殼聚糖微球與化0H溶液的重量比為 1 : 5~10,磁性殼聚糖微球與NaBH4溶液的重量比為1 : 4~12;每克磁性殼聚糖微球加 體積分?jǐn)?shù)為40%~60%的二甲基亞諷1. 5~9血，環(huán)氧氯丙烷為1~12血。
[0016] 作為技術(shù)方案的進(jìn)一步優(yōu)選，化0H溶液的濃度為1. 2~2.Omol/l，NaBH4溶液的 濃度為5~lOg/l，環(huán)氧氯丙烷的體積分?jǐn)?shù)為30%~50%，在30~50°C下振蕩活化2~化 時(shí)磁性殼聚糖微球的活化效果最好。
[0017] 本發(fā)明中磁性殼聚糖微球的制備方法：
[001引 （1)將液體石蠟和Span-80按照重量比為20~40 : 1混合，在30~50°C攬拌 1~化制備成油相；
[0019] (2)稱(chēng)取一定量的殼聚糖，用3~5%的醋酸溶液溶解，待殼聚糖完全溶解后得到 殼聚糖溶液，加入化3〇4粉末，超聲分散10~2〇min，制得到水相；
[0020] (3)將水相與油相按照體積比為1 : 5~6,將水相緩慢加入油相中，攬拌0. 5~ 比使溶液形成乳液體系；
[0021] (4)再向乳液體系中滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醒，繼續(xù)攬拌1~化，用化0H溶 液調(diào)抑至9~10,繼續(xù)反應(yīng)1~化后停止反應(yīng)，磁鐵分離，用石油酸，乙醇和去離子水洗涂 至中性，真空干燥，即可得到磁性殼聚糖微球。
[0022] 作為技術(shù)方案的優(yōu)選，本發(fā)明中所用的四氧化=鐵為納米級(jí)別，配制的殼聚糖溶 液濃度為5~lOmg/mU攬拌轉(zhuǎn)速為600~70化pm/min，運(yùn)樣制備得到的磁性殼聚糖微球的 粒徑最小，為215皿。
[0023] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0024] 1.本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單、操作易行，處理過(guò)程溫和，對(duì)設(shè)備要求不高。
[00巧]2.本發(fā)明W綠豆膜蛋白酶抑制劑為配基，與磁性殼聚糖微球偶聯(lián)，運(yùn)用用于版蝴 纖溶酶的分離純化，提高了版蝴纖溶酶的分離純化選擇性，而且磁性殼聚糖微球易于與蟲(chóng)丘 蝴纖溶酶分離。
[0026] 3.本發(fā)明的版蝴纖溶酶固定在磁性微球上，因微球具有磁性，在外加磁場(chǎng)的作用 下，纖溶酶可與反應(yīng)物很快地分離。且固定化纖溶酶的抑穩(wěn)定性較好，能夠在pH6. 5~8. 0 的范圍內(nèi)，穩(wěn)定性能保持在75%W上，熱穩(wěn)定性較游離酶高，在60°C下加熱，相對(duì)活性仍能 保持70 %W上，且較長(zhǎng)時(shí)間的存儲(chǔ)，酶活性保持80 %W上。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1是本發(fā)明的磁性殼聚糖微球的7000倍的電鏡圖；
[0028]圖2是本發(fā)明的磁性殼聚糖微球的10萬(wàn)倍的電鏡圖；
[002引圖3是本發(fā)明的磁性殼聚糖微球的紅外光譜分析圖，圖中3415cm1是N-H和0-H的伸縮振動(dòng)峰，2923cm1和