一種測(cè)定血漿中skullcapflavone II濃度的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定血漿中5，2`?二羥基，6，7，8，5`?四甲氧基黃酮(skullcapflavone II)濃度的方法，采用液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)測(cè)定，先取待測(cè)樣品，加入一定量的有機(jī)溶劑進(jìn)行藥物液液提取，預(yù)處理后，經(jīng)色譜柱分離，用質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)，本發(fā)明方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，適合于測(cè)定血漿中skullcapflavone?II的濃度。
【專利說(shuō)明】
一種測(cè)定血漿中skul Icapf lavone I I濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種測(cè)定血漿中5,2'_二羥基，6,7,8,5 四甲氧基黃酮(skullcapflavone II)濃度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Skullcapf lavone-II，即5，2'-二羥基，6，7，8，5'-四甲氧基黃酮，是從藥用植物黃 芩中分離得到的黃酮類新化合物。SKul lcapf lavone-II具有對(duì)抗炎癥、病毒和免疫調(diào)節(jié)的 作用。此外，許多成分有止癢、調(diào)節(jié)代謝紊亂、神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)血管新生、抗癌和抗HIV的作 用。Skullcapflavone-II具有多種生物學(xué)特性，如細(xì)胞毒性的假定作用，對(duì)肥大細(xì)胞組胺釋 放的影響，通過(guò)胰蛋白酶抑制纖溶酶原激活物1型升高抑制劑和抗哮喘氣道炎癥反應(yīng)。
[0003] 其結(jié)構(gòu)式如下：
[0005] 目前尚未關(guān)于Skullcapf lavone-II體內(nèi)測(cè)定方法的文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明建立了 Skul 1 capf lavone-II在beagle犬體內(nèi)的測(cè)定方法，通過(guò)該方法對(duì)Skul lcapf lavone-II的藥 物代謝情況進(jìn)行探索性研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是建立一種準(zhǔn)確高效測(cè)定血衆(zhòng)中skul lcapf lavone-II濃度的方法。
[0007] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0008] 一種測(cè)定血衆(zhòng)中skul lcapf lavone-II濃度的方法，血衆(zhòng)樣品經(jīng)預(yù)處理后經(jīng)液質(zhì)聯(lián) 用系統(tǒng)檢測(cè)其濃度，具體方法包括如下步驟：
[0009] (1)血漿樣品預(yù)處理：取血漿樣品，加入內(nèi)標(biāo)新補(bǔ)骨脂異黃酮，加入一定量的乙酸 乙酯進(jìn)行有機(jī)溶劑萃取，取上清液在40°C氮?dú)獯蹈珊螅昧鲃?dòng)相溶解后進(jìn)樣分析；
[0010] (2)將步驟（1)預(yù)處理后的血漿樣品進(jìn)行液相色譜分離：色譜條件中色譜柱為 Agilent Z0RBAX SB-Cis柱；流動(dòng)相：體積比為80:20的乙腈與水；流速：0.2mL· min-S柱 溫:40°C ;洗脫方式為等度洗脫；
[0011] (3)質(zhì)譜測(cè)定，條件為：
[0012] 離子源：電噴霧離子化電離源ESI;離子檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM;離子極性:正離 子；skullcapf lavone-II碰撞電壓23eV;內(nèi)標(biāo)新補(bǔ)骨脂異黃酮碰撞電壓29eV;毛細(xì)管電壓 4.5kV;氣簾氣Curtain gas: 20psi ;離子源Gas 1:70psi ;離子源Gas2:80psi ;脫溶劑溫度： 400°C ;CXP:9V;碰撞氣CAD: 10V;DP: 100V;EP: 10V。檢測(cè)對(duì)象的離子通道：81〇111〇3口€13￥〇116-II m/z 375.1-345.1，內(nèi)標(biāo)新補(bǔ)骨脂異黃酮m/z 323.3-255.1
[0013] (4)計(jì)算:采用內(nèi)標(biāo)法，以skullcapflavone-II和內(nèi)標(biāo)新補(bǔ)骨脂異黃酮的峰面積比 值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算skul lcapf lavone-II的濃度。
[0014] 具體地，步驟（1)中，取血漿樣品500yL，加入100ng · mL-1內(nèi)標(biāo)新補(bǔ)骨脂異黃酮20μ L，加入4mL乙酸乙酯，震蕩3min后3500 X g離心10min，取上清液3.5mL在40 °C氮?dú)獯蹈珊螅?100yL流動(dòng)相溶解后，10yL進(jìn)樣分析。
[0015] 步驟(2)中，色譜柱長(zhǎng)度為150_，內(nèi)徑為2.1_，填料粒徑為5μηι。
[0016] 其中，所述的血衆(zhòng)為給予了含skullcapflavone-II藥物的血衆(zhòng)。
[0017] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述血漿為人或動(dòng)物的血漿。
[0018] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述血楽;為犬血楽;。所述的犬為beagle犬。
[0019] 有益效果:本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢(shì)：
[0020] (1)預(yù)處理方法簡(jiǎn)便:使用有機(jī)溶劑液頁(yè)萃取法，適用于常規(guī)測(cè)定。
[0021] (2)專屬性強(qiáng):采用Agilem Z0RBAX SB-C18色譜柱作為固定相，乙腈和水的混合液 作為流動(dòng)相，等度洗脫，Skul lcapf lavone-II保留時(shí)間為3.09min左右，內(nèi)標(biāo)新補(bǔ)骨脂異黃 酮保留時(shí)間為2.88min左右，4.5min完成測(cè)定，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾二者的測(cè)定。
[0022] (3)靈敏度高:血漿最低定量限為lng · mL一、
[0023] (4)本發(fā)明方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，為Skullcapflavone-II的血藥濃 度測(cè)定提供依據(jù)，具有新藥開(kāi)發(fā)的前景。本方法的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為1~4000ng· mL-S曰內(nèi)和曰間精密度RSD均小于10%。
【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為犬空白血漿的質(zhì)譜圖；
[0025] 圖2為犬空白血衆(zhòng)加入Skullcapflavone-II和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品的質(zhì)譜圖；
[0026]圖3為犬給予Skul lcapf lavone-II后血衆(zhòng)樣品再加入內(nèi)標(biāo)對(duì)照品的的質(zhì)譜圖；
[0027]注：圖中離子通道 1 為Skullcapf lavone-II，[M-H] +，m/z 375 · 1-345.1，保留時(shí)間 為3.09min左右;離子選擇通道2為內(nèi)標(biāo)新補(bǔ)骨脂異黃酮，[M-H] +，m/z 323.3-255.1，保留 時(shí)間為2.88min左右。
【具體實(shí)施方式】
[0028]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0029] 實(shí)施例:犬血衆(zhòng)中Skul lcapf lavone-II濃度的測(cè)定
[0030] 一、實(shí)驗(yàn)材料與儀器
[0031] skul lcapf lavone-II:由澤朗醫(yī)藥集團(tuán)提供（南京，中國(guó)）；新補(bǔ)骨脂異黃酮（內(nèi) 標(biāo)）：購(gòu)于國(guó)家藥品生物制品檢定所購(gòu)買（北京，中國(guó)）；試驗(yàn)用水：超純水；甲醇：色譜純 (Merck Company)。
[0032] Agilent Z0RBAX SB_Ci8柱（150mmX2·1mm I·D·，5ym，Agilent Technologies， Wilmington，DE，USA);API4000 LC-MS/MS三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國(guó)AB有限公司），色譜工作 站為Analyst 1.4.2;CPA225D電子分析天平(德國(guó)賽多利斯有限公司）；WH-2微型旋渦混合 儀(上海滬西分析儀器廠）;Milli-Q系統(tǒng)純水機(jī)(微孔，貝德福德，MA，USA);Biofuge PrimoR 冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司）。
[0033]二、液質(zhì)條件 [0034] 1.液相色譜條件
[0035] 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18 柱（150mmX 2. 1mm I .D.，5ym，Agilent Technologies，Wilmington，DE，USA);流動(dòng)相：乙腈和水溶液（80: 20, v/v);流速：0 · 2mL · min-1;柱溫:40°C。
[0036] 2 ·質(zhì)譜條件
[0037] 離子源：電噴霧離子化電離源ESI;離子檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM;離子極性:正離 子；skullcapf lavone-II碰撞電壓23eV;內(nèi)標(biāo)新補(bǔ)骨脂異黃酮碰撞電壓29eV;毛細(xì)管電壓 4 · 5kV; Curtain gas: 20;Gas 1:70;Gas2:80;脫溶劑溫度：400Γ ; CXP: 9; CAD: 10;DP: 100;EP: 10。檢測(cè)對(duì)象的離子通道:skullcapflavone_II m/z 375.1-345.1，內(nèi)標(biāo)新補(bǔ)骨脂異黃酮 m/z 323.3-255.1〇
[0038] 三、實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
[0039] 1 · Skullcapf lavone-II 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：
[0040] 精密稱取Skullcapflavone-II 10·08mg，置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定 容至刻度，搖勻，即得l.〇〇8mg ?mI/1SkullCapflaV〇ne-II的儲(chǔ)備液。精密量取適量?jī)?chǔ)備液以 甲醇依次稀釋，配成濃度分別為1，5，10,50，100,500，1000,40001^.1111^ 1的 Skul lcapf lavone-II 標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0041] 2.beagle犬血衆(zhòng)樣品的采集與處理：
[0042] beagle犬靜脈注射Skullcapflavone-II溶液，給藥量為5mg · kg^1，于注射前及注 射后5，10，15，30，45min和 1，1.5,2,3,4,6,8，12h 靜脈采血lmL，注入肝素管內(nèi)，3000rpm 離心 10min，制備血衆(zhòng)。取beagle犬血衆(zhòng)500yL，加入100ng · mL-1內(nèi)標(biāo)新補(bǔ)骨脂異黃酮20yL，加入 4mL乙酸乙酯，震蕩3min后3500 X g離心10min，取上清液3.5mL在40°C氮?dú)獯蹈珊螅?00yL 流動(dòng)相溶解后，l〇yL進(jìn)樣分析。
[0043] 3.專屬性：
[0044] 取沒(méi)有給予過(guò)Skul lcapf lavone-II的beagle犬空白血衆(zhòng)500yL，加入4mL乙酸乙 酯，震蕩3min后3500 X g離心10min，取上清液3.5mL在40°C氮?dú)獯蹈珊?，?00yL流動(dòng)相溶解 后，10yL進(jìn)樣分析。
[0045] 取離心管數(shù)支，加入Skullcapf lavone-II標(biāo)準(zhǔn)溶液10yL，40°C氮?dú)獯蹈桑尤霙](méi)有 給予過(guò)Skul lcapf lavone-II的beagle犬空白血衆(zhòng)500yL，旋禍30s混勾，加入新補(bǔ)骨脂異黃 酮（內(nèi)標(biāo)，lOOng.mL-3 10yL，加入4mL乙酸乙酯，震蕩3min后3500 X g離心10min，取上清液 3.5mL在40°C氮?dú)獯蹈珊?，?00yL流動(dòng)相溶解后，10yL進(jìn)樣分析。
[0046]結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)所采用的LC-MS/MS條件下，血漿樣品無(wú)雜峰對(duì)檢測(cè)組分造成 干擾，Skullcapf lavone-II保留時(shí)間在3.09min左右，內(nèi)標(biāo)補(bǔ)骨脂異黃酮保留時(shí)間在 2 · 88min左右。Skul lcapf lavone-II和內(nèi)標(biāo)互不干擾，峰形良好，基線平穩(wěn)。
[0047] 4.線性試驗(yàn)
[0048] b e a g 1 e犬血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線：取離心管數(shù)支，分別精密加入不同濃度的 Skullcapf lavone-II 標(biāo)準(zhǔn)溶液 10yL，40 °C 氮?dú)獯蹈?，加入沒(méi)有給予過(guò) Skul lcapf lavone-II 的空白血漿500yL旋渦30s混勻，配成含Skullcapflavone-II的濃度分別為0.001，0.005， 0.01，0.05,0.1，0.5,1，4yg/mL的含藥血漿。加入新補(bǔ)骨脂異黃酮（內(nèi)標(biāo)，100ng · mL-1) 10yL， 加入4mL乙酸乙酯，震蕩3min后3500 X g離心10min，取上清液3.5mL在40°C氮?dú)獯蹈珊螅?100μ?^動(dòng)相溶解后，10yL進(jìn)樣分析。計(jì)算Skullcapflavone-II和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y，以峰 面積比值Y對(duì)血藥濃度X作回歸計(jì)算，得回歸方程:Y = (0.00171 ±0.00035)X+(0.00067 土 0·00029)(η = 5)，Skullcapflavone_II血衆(zhòng)濃度在1~4000ng · mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。 最低定量限為lng · mL一、
[0049] 5.準(zhǔn)確度和精密度
[0050] 按照beagle犬血衆(zhòng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方法配制含Skullcapflavone-II濃度為0 · 002， 0·02and2yg/mL的低、中、高的含Skul 1 capf lavone-II血衆(zhòng)樣品，按"beagle犬血衆(zhòng)樣品的處 理"處理方法分別處理。連續(xù)做3天，每天每個(gè)濃度各做5份樣品，計(jì)算Skullcapflavone-II 峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f，代入當(dāng)天的血衆(zhòng)標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得Skullcapflavone-II 實(shí)測(cè)濃度，由實(shí)測(cè)濃度計(jì)算日內(nèi)、日間精密度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，實(shí)測(cè)濃度與加入濃度 的比值即為準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，日內(nèi)和日間精密度RSD均小于10%，準(zhǔn)確度符合要求。
[0051 ] 6.測(cè)定結(jié)果
[0052] 上述 6 只給予過(guò) 31〇111〇&口;1^1&￥〇116-11的匕6&816犬血楽_中31〇111〇&口;1^1&￥〇116-11含量 (給藥后 5min)分別為 2.17、2.04、2.35、2.23、2.19、2.24yg/mL。
[0053] 本發(fā)明通過(guò)采用Agilent Z0RBAX SB-C18色譜柱作為固定相，乙腈和水的混合液作 為流動(dòng)相，等度洗脫，Skullcapflavone-II保留時(shí)間為3.09min左右，內(nèi)標(biāo)新補(bǔ)骨脂異黃酮 保留時(shí)間為2.88min左右，4.5min完成測(cè)定，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾二者的測(cè)定，同時(shí)預(yù)處理方 法簡(jiǎn)便;使用有機(jī)溶劑液頁(yè)萃取法，適用于常規(guī)測(cè)定；靈敏度高，血漿最低定量限為lng· ml/ 1，且本發(fā)明方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，為Skul lcapf lavone-II的血藥濃度測(cè) 定提供依據(jù)，具有新藥開(kāi)發(fā)的前景。本方法的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為1~4000ng · ml/1，日 內(nèi)和日間精密度RSD均小于10 %。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)定血衆(zhòng)中skullcapflavone II濃度的方法，其特征在于，血衆(zhòng)樣品經(jīng)預(yù)處理 后經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)其濃度，具體方法包括如下步驟： (1) 血漿樣品預(yù)處理：取血漿樣品，加入內(nèi)標(biāo)新補(bǔ)骨脂異黃酮，加入一定量的乙酸乙酯 進(jìn)行有機(jī)溶劑萃取，取上清液氮?dú)獯蹈珊?，用流?dòng)相溶解得到預(yù)處理后的血漿樣品； (2) 將步驟（1)預(yù)處理后的血漿樣品進(jìn)行液相色譜分離:色譜條件中，色譜柱為Agilent 201^4乂38-(：18柱;流動(dòng)相為體積比為80:20的乙腈與水;流速為0.2-0.51111^1^11- 1;柱溫為 40°C;洗脫方式為等度洗脫； (3) 質(zhì)譜測(cè)定，條件為： 離子源：電噴霧離子化電離源ESI;離子檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM;離子極性：正離子； skullcapflavone-II碰撞電壓23eV;內(nèi)標(biāo)新補(bǔ)骨脂異黃酮碰撞電壓29eV;毛細(xì)管電壓 4.5kV;氣簾氣Curtain gas: 20psi ;離子源Gas 1:70psi ;離子源Gas2:80psi ;脫溶劑溫度： 400°C;CXP:9V;CAD:10V;DP:100V;EP:10V，檢測(cè)對(duì)象的離子通道：skullcapflavone-II m/z 375 · 1-345 · 1，內(nèi)標(biāo)新補(bǔ)骨脂異黃酮m/z 323 · 3-255 · 1 (4) 計(jì)算:采用內(nèi)標(biāo)法，以skul lcapflavone-II和內(nèi)標(biāo)新補(bǔ)骨脂異黃酮的峰面積比值代 入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算skul lcapflavone-II的濃度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定血衆(zhòng)中skul lcapflavone-II濃度的方法，其特征在于，步 驟（1)中，取血漿樣品500yL，加入100ng .1111/1內(nèi)標(biāo)新補(bǔ)骨脂異黃酮20yL，加入4mL乙酸乙酯， 震蕩3min后3500 X g離心10min，取上清液3.5mL在40 °C氮?dú)獯蹈珊螅?00yL流動(dòng)相溶解后， 10yL進(jìn)樣分析。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定血衆(zhòng)中skul lcapflavone-II濃度的方法，其特征在于，步 驟(2)中，色譜柱長(zhǎng)度為150_，內(nèi)徑為2.1mm，填料粒徑為5μηι。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定血衆(zhòng)中skul lcapflavone-II濃度的方法，其特征在于，所 述的血衆(zhòng)為給予了含skul lcapflavone-II藥物的血衆(zhòng)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定血衆(zhòng)中skul lcapflavone-II濃度的方法，其特征在于，所 述血漿為人或動(dòng)物的血漿。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定血衆(zhòng)中skul lcapflavone-II濃度的方法，其特征在于，所 述血漿為犬血漿。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK106018580SQ201610308527
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月11日
【發(fā)明人】劉史佳, 張農(nóng)山, 戴國(guó)梁, 居文政, 儲(chǔ)繼紅, 李長(zhǎng)印, 許美娟, 吳婷, 張軍, 馮麗雯
【申請(qǐng)人】江蘇省中醫(yī)院