一種婦科再造丸uplc指紋圖譜的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種婦科再造丸UPLC指紋圖譜的建立方法。該方法可快速、準確地鑒別產(chǎn)品的真?zhèn)蝺?yōu)劣，具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點；用該方法還能較為全面地反映婦科再造丸中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進而對其質(zhì)量進行整體描述和評價，可將婦科再造丸質(zhì)量與其藥效真正結(jié)合起來，有助于闡明其作用機理為本婦科再造丸的技術(shù)提升與深度開發(fā)提供了依據(jù)。且用該方法檢測到的婦科再造丸指紋圖譜化學(xué)成分相對較多、各特征峰高度比例適中，基線較平穩(wěn)，分離度、峰形和柱效好。
【專利說明】
一種婦科再造丸UPLC指紋圖譜的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種婦科再造丸UPLC指紋圖譜的建立方法，屬于藥品技術(shù)的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 婦科再造丸婦科再造丸是著名的治療婦科病的藥物，由42味地道藥材組成，具有 養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，補益肝腎，暖宮止痛的功效，用于月經(jīng)先后不定期，帶經(jīng)日久，淋漓出血，痛經(jīng)，帶 下等癥。
[0003] 婦科再造丸由傳統(tǒng)中藥古方發(fā)展而來，受當(dāng)時科研水平限制，其質(zhì)量標準起點不 夠高，對藥理藥效等基礎(chǔ)研究較為有限。為進一步探索其作用機理與藥用基礎(chǔ)，確保產(chǎn)品安 全有效、質(zhì)量可控，迫切需要運用現(xiàn)代醫(yī)藥科研手段對本產(chǎn)品進行質(zhì)量標準的提升與藥理 藥效實驗研究。
[0004] 中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng) 研究的基礎(chǔ)上，主要用于評價中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。 中藥及其制劑均為多組分復(fù)雜體系，因此評價其質(zhì)量應(yīng)采用與之相適應(yīng)的，能提供豐富鑒 別信息的檢測方法，建立中藥指紋圖譜將能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分 的種類與數(shù)量，進而對藥品質(zhì)量進行整體描述和評價。在此基礎(chǔ)上，如果進一步開展譜效學(xué) 研究，可使中藥質(zhì)量與其藥效真正結(jié)合起來，有助于闡明中藥作用機理。目前，尚無婦科再 造丸超高液指紋圖譜研究工作的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于，提供一種婦科再造丸UPLC指紋圖譜的建立方法。該方法可快速、 準確地鑒別產(chǎn)品的真?zhèn)蝺?yōu)劣，具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點；用該方法還 能較為全面地反映婦科再造丸中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進而對其質(zhì)量進行整體描述 和評價，可將婦科再造丸質(zhì)量與其藥效真正結(jié)合起來，有助于闡明其作用機理為本婦科再 造丸的技術(shù)提升與深度開發(fā)提供了依據(jù)。且用該方法檢測到的婦科再造丸指紋圖譜化學(xué)成 分相對較多、各特征峰高度比例適中，基線較平穩(wěn)，分離度、峰形和柱效好。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實現(xiàn):一種婦科再造丸UPLC指紋 圖譜的建立方法，所述婦科再造丸由按重量份計算的酒當(dāng)歸60-70份、醋炙香附60-70份、白 芍40-50份、熟地黃15-30份、阿膠5-20份、茯苓60-70份、黨參15-30份、黃芪15-30份、山藥 25-40份、白術(shù)10-20份、酒蒸女貞子40-50份、醋炙龜甲25-40份、山茱萸15-30份、續(xù)斷15-30 份、鹽杜仲15-30份、肉蓯蓉5-20份、覆盆子10-20份、鹿角霜2-10份、川芎40-50份、丹參15-30份、牛膝10-20份、益母草15-30份、延胡索10-20份、油酥三七2-10份、醋炙艾葉40-50份、 小茴香15-30份、藁本15-30份、海螵蛸25-40份、醋炙地榆25-40份、益智5-20份、澤瀉15-30 份、醋炙荷葉10-20份、秦艽15-30份、地骨皮15-30份、白薇40-50份、椿皮25-40份、琥珀2-10 份、酒黃芩25-40份、酸棗仁5-20份、制遠志10-20份、陳皮25-40份和甘草15-30份按下述方 法進行制備而成：以上四十二味，黃芪、鹽杜仲、熟地黃、續(xù)斷、秦艽、肉蓯蓉、牛膝、地骨皮加 水煎煮2次，每次2h合并煎煮液，濾過，濾液濃縮;領(lǐng)取阿膠適量水烊化與上述濃縮液合并， 濃縮至相對密度為1.10(80°C)的浸膏，其余三十二味粉碎成細粉，過篩，混勻，用上述浸膏 泛丸，制成濃縮丸，60-80°C干燥，包糖衣，打光，即得。
[0007] 所述UPLC指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟：
[0008] (1)對照品溶液的制備:精密稱取橙皮苷、黃芩苷適量，放入25mL棕色容量瓶中，加 入甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成橙皮苷0.30-0.45mg · mL-1、黃芩苷0.10-0.35mg · mL 一1的對照品溶液，即得；
[0009] (2)供試品溶液的制備:取婦科再造丸，粉碎成粉末后，稱取0.5g，精密稱定，置具 塞錐形瓶中，精密加入55-65%甲醇40-60mL，稱定質(zhì)量，超聲提取0.5-1.5h，放冷，再稱定質(zhì) 量，用40-60%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過慮，即得。
[0010] (3)色譜條件：色譜柱:ACQUITYUPLC Hss T3l.8ym2.1X100mm Column;流動相： 0.1 %甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫;柱溫:50°C ;流速:0.3mL · mirT1;檢測波長:280nm; 進樣量2yL;
[0011] (4)指紋圖譜的制作：按上述方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣，記錄 譜圖得到婦科再造丸的UPLC指紋圖譜；
[0012] (5)指紋譜圖的確認:按照上述提供的方法，對多批次婦科再造丸建立了 UPLC指紋 圖譜，通過分析比較確定了 15個共有峰，這些共有峰構(gòu)成了婦科再造丸的指紋特征，作為婦 科再造丸的指紋圖譜。
[0013] 前述的婦科再造丸UPLC指紋圖譜的建立方法中，所述對照品溶液這樣制備:精密 稱取橙皮苷、黃芩苷適量，放入25mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制 成橙皮苷〇.3452mg · mL'黃芩苷0.2204mg · ml/1的對照品溶液，即得。
[0014] 前述的婦科再造丸UPLC指紋圖譜的建立方法中，所述供試品溶液這樣制備:取婦 科再造丸，粉碎成粉末后，稱取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 %甲醇50mL， 稱定質(zhì)量，超聲提取lh，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過慮，即得。
[0015] 前述的婦科再造丸UPLC指紋圖譜的建立方法中，所述梯度洗脫條件為:0~22min， 2 ~20%B;22 ~30min，20 ~28%B;30 ~36min，28 ~50%B。
[0016] 前述的婦科再造丸UPLC指紋圖譜的建立方法中，所述15個共有峰，以10號峰黃芪 苷為參照峰，其余峰相對保留時間分別為0.098-0.099，0.114-0.18，0.0151，0.246，0.364， 0·474，0·817，0·887，0·905，1·081，1·196，1·330，1·464，1·607。
[0017]前述的婦科再造丸UPLC指紋圖譜的建立方法中，所述流速為0.3mL · min-1;所述 檢測波長為280nm〇
[0018] 發(fā)明人進行了大量的實驗，以下是部分實驗研究
[0019] 實驗例
[0020] 1實驗材料
[0021] ACQUITY型UPLC(Empower3色譜數(shù)據(jù)工作站，美國Waters公司），AE240型電子分析 天平(METTLER公司），TGL-16C型臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠制造），WBZ-2型微波真空 干燥機（功率2kw，貴陽新奇微波工業(yè)有限責(zé)任公司），遠紅外鼓風(fēng)快速干燥箱（型號YHG-500-BS-II，加熱功率2kw，上海費德試驗設(shè)備有限公司），超聲波清洗器(型號SK8210HP，上 ?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。
[0022 ] 婦科再造丸(批次1，批次2，批次3，批次4，批次5，批次6，批次7，批次8，批次9，批次 10,20111247,20140172，均由貴陽德昌祥有限公司提供），婦科再造丸濕丸（貴陽德昌祥有 限公司提供）；橙皮苷(批號C-006-140728)，黃芩苷(批號H-016-140729)均購于成都瑞芬思 生物科技有限公司，純度彡98 %，甲醇(TEDIA，色譜純），乙腈(TEDIA，色譜純），甲酸(CNW，色 譜純）；屈臣氏蒸餾水。其他試劑均為分析純。
[0023] 2 方法
[0024] 2.1色譜條件
[0025] 色譜柱:ACQUITY UPLC Hss Τ31·8μπι 2· IX 100mm Column;流動相：0.1 % 甲酸水 溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫;柱溫:50°C ;流速:0.3mL · min-1;檢測波長:280nm;進樣量2yL。 梯度洗脫條件：〇~22min，2~20%B;22~30min，20~28%B;30~36min，28~50%B。
[0026] 2.2對照品溶液的制備
[0027]精密稱取橙皮苷、黃芩苷適量，放入25mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解，并稀釋至 刻度，搖勻，制成橙皮苷〇.3452mg · mL'黃芩苷0.2204mg · ml/1對照品溶液。
[0028] 2.3供試品溶液的制備
[0029] 取婦科再造丸粉末0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，稱 定質(zhì)量，超聲提取lh，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過慮，即得。 [0030] 2.4婦科再造丸UPLC特征圖譜測定
[0031] 2.4.1方法學(xué)考察
[0032] 2.4.1.1精密度試驗
[0033] 取婦科再造丸，上述方法制成供試品溶液，按2.1項下的色譜條件連續(xù)進樣6次，分 別記錄圖譜的保留時間和峰面積，以黃芩苷作為參照峰，計算各色譜峰的相對保留時間和 相對峰面積及相似度，結(jié)果見表1、表2、表3和圖1。結(jié)果精密度試驗各圖譜的相似度結(jié)果均 大于0.989，相對保留時間的RSD均小于0.18%，相對峰面積的RSD均小于2.25%，說明儀器 精密度良好，符合特征圖譜要求。
[0034] 表1精密度試驗的相似度比較結(jié)果
[0036]表2精密度試驗相對保留時間
[0039] 表3精密度試驗相對峰面積
[0040]
[0041 ] 2.4.1.2重復(fù)性試驗
[0042]取同一婦科再造丸(批號20140172)，按上述方法制成供試品溶液，按照2.3項方法 平行制備6份，分別注入UPLC測定，以黃芩苷作為參照峰，計算各色譜峰的相對峰面積與相 對保留時間。結(jié)果見表3、表4、表5和圖2，從，表中可知，6份樣品色譜圖的相似度達0.997以 上，相對峰面積RSD均小于2.91 %，相對保留時間的RSD均小于1.69%，表明試驗重復(fù)性良 好，符合特征圖譜要求。
[0043]表3重復(fù)性試驗相似度結(jié)果
[0045]表4重復(fù)性試驗相對保留時間
[0046]
[0047] 表5相對峰面積結(jié)果

[0050] 2.4.1.3穩(wěn)定性試驗
[0051] 取同一份婦科再造丸供試品溶液，分別在〇,2,4,8，12,2處進樣，計算各共有峰的 相對峰面積與相對保留時間，結(jié)果見表6、表7、表8和圖3。結(jié)果共有峰的相對峰面積RSD均小 于1.69 %，相對保留時間的RSD均小于2.93 %，相似度大于0.996，說明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。 [0052]表6穩(wěn)定性試驗相似度比較結(jié)果
[0054]表7穩(wěn)定性試驗相對保留時間
[0056]
[0057] 表8穩(wěn)定性試驗相對峰面積
[0060] 2.4.2婦科再造丸UPLC特征圖譜的建立
[0061] 12個批次婦科再造丸樣品，編號為S1~S12。分別按照2.3項下方法制備供試品溶 液，2.1項下分別進樣并記錄色譜圖。對12批婦科再造丸樣品的圖譜數(shù)據(jù)進行處理分析，得 到15個共有峰。特征圖譜中共有峰編號見圖4。將12批樣品的特征圖譜信號數(shù)據(jù)分布導(dǎo)入 "中藥指紋圖譜相似度評價軟件2004A版"，進行多點校正后生成共有模式。12批樣品對照圖 譜及共有模式見圖5A1~S12批樣品的特征圖譜相似度結(jié)果分別為0.999,0.999,0.999， 0·999,0·999，1·000,0·999,0·999,0·999,0·990,0·937,0·978,1.000。
[0062] 以上試驗表明，該測定方法穩(wěn)定可靠，指紋圖譜相對穩(wěn)定，可以用于控制婦科再造 丸的質(zhì)
[0063] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法可快速、準確地鑒別產(chǎn)品的真?zhèn)蝺?yōu)劣，具有方法簡 便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點；用該方法還能較為全面地反映婦科再造丸中所含化 學(xué)成分的種類與數(shù)量，進而對其質(zhì)量進行整體描述和評價，可將婦科再造丸質(zhì)量與其藥效 真正結(jié)合起來，有助于闡明其作用機理，為本婦科再造丸的技術(shù)提升與深度開發(fā)提供了依 據(jù)。且用該方法檢測到的婦科再造丸指紋圖譜化學(xué)成分相對較多、各特征峰高度比例適中， 基線較平穩(wěn)，分離度、峰形和柱效好。
【附圖說明】
[0064] 圖1是精密度試驗UPLC特征圖譜；
[0065] 圖2是重復(fù)性試驗UPLC特征圖譜；
[0066] 圖3是穩(wěn)定性試驗UPLC特征圖譜；
[0067]圖4是本發(fā)明婦科再造丸共有峰的標定圖；（9號峰為橙皮苷，10號峰為黃芩苷）； [0068] 圖5是12批婦科再造丸UPLC特征圖譜。
[0069]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
【具體實施方式】 [0070] 實施例1:
[0071 ] -種婦科再造丸UPLC指紋圖譜的建立方法，
[0072] 婦科再造丸處方:酒當(dāng)歸65.14g、醋香附65.14g、白芍43.43g、熟地黃21.71g、阿膠 10.868、茯苓65.148、黨參21.718、黃芪21.718、山藥32.578、白術(shù)16.288、酒女貞子43.43 8、 龜甲（醋炙）32.57g、山茱萸21.71g、續(xù)斷21.71g、鹽杜仲21.71g、肉蓯蓉10.86g、覆盆子 16.288、 鹿角霜5.438、川芎43.438、丹參21.7 4、牛膝16.288、益母草21.718、延胡索 16.288、 三七(油酥)5.438、艾葉(醋炙)43.438、小茴香21.718、藁本21.718、海螵蛸32.57 8、 地榆（醋炙）32.57g、益智10.86g、澤瀉21.71g、荷葉（醋炙）16.28g、秦艽21.71g、地骨皮 21.718、白薇43.438、椿皮32.578、琥珀5.438、酒黃芩32.578、酸棗仁10.86 8、制遠志 16 · 28g、陳皮 32 · 57g 和甘草 21 · 71g。
[0073]婦科再造丸制作工藝：以上四十二味，黃芪、鹽杜仲、熟地黃、續(xù)斷、秦艽、肉蓯蓉、 牛膝、地骨皮加水煎煮2次，每次2h合并煎煮液，濾過，濾液濃縮;領(lǐng)取阿膠適量水烊化與上 述濃縮液合并，濃縮至相對密度為1.10(80°C)的浸膏，其余三十二味粉碎成細粉，過篩，混 勾，用上述浸膏泛丸，制成濃縮丸，60-80 °C干燥，包糖衣，打光，即得。
[0074]所述UPLC指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟：
[0075] (1)對照品溶液的制備精密稱取橙皮苷、黃芩苷適量，放入25mL棕色容量瓶中，加 入甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成橙皮苷〇.3452mg · ml/1、黃芩苷0.2204mg · ml/1的對 照品溶液，即得。
[0076] (2)供試品溶液的制備:取婦科再造丸，粉碎成粉末后，稱取0.5g，精密稱定，置具 塞錐形瓶中，精密加入50 %甲醇50mL，稱定質(zhì)量，超聲提取lh，放冷，再稱定質(zhì)量，用50 %甲 醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過慮，即得。
[0077] (3)色譜條件：色譜柱：ACQUITYUPLC Hss T3l.8ym2.1X100mm Column;流動相： 0.1 %甲酸水溶液（A)-乙腈（B)梯度洗脫；柱溫：50°C ;流速：0.3mL · min-1;檢測波長： 280nm;進樣量2yL;所述梯度洗脫條件為：0~22min，2~20 ; 22~30min，20~28 ; 30~ 36min，28 ~50%B;
[0078] (4)指紋圖譜的制作：按上述方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣，記錄 譜圖得到婦科再造丸的UPLC指紋圖譜，
[0079] (5)指紋譜圖的確認:按照上述提供的方法，對多批次婦科再造丸建立了 UPLC指紋 圖譜，通過分析比較確定了 15個共有峰，這些共有峰構(gòu)成了婦科再造丸的指紋特征，作為婦 科再造丸的指紋圖譜，結(jié)果見圖4。
【主權(quán)項】
1. 一種婦科再造丸UPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于:所述婦科再造丸由按重量 份計算的酒當(dāng)歸60-70份、醋炙香附60-70份、白芍40-50份、熟地黃15-30份、阿膠5-20份、茯 苓60-70份、黨參15-30份、黃芪15-30份、山藥25-40份、白術(shù)10-20份、酒蒸女貞子40-50份、 醋炙龜甲25-40份、山茱萸15-30份、續(xù)斷15-30份、鹽杜仲15-30份、肉蓯蓉5-20份、覆盆子 10-20份、鹿角霜2-10份、川芎40-50份、丹參15-30份、牛膝10-20份、益母草15-30份、延胡索 10-20份、油酥三七2-10份、醋炙艾葉40-50份、小茴香15-30份、藁本15-30份、海螵蛸25-40 份、醋炙地榆25-40份、益智5-20份、澤瀉15-30份、醋炙荷葉10-20份、秦艽15-30份、地骨皮 15-30份、白薇40-50份、椿皮25-40份、琥珀2-10份、酒黃芩25-40份、酸棗仁5-20份、制遠志 10-20份、陳皮25-40份和甘草15-30份按下述方法進行制備而成：以上四十二味，黃芪、鹽杜 仲、熟地黃、續(xù)斷、秦艽、肉蓯蓉、牛膝、地骨皮加水煎煮2次，每次2h合并煎煮液，濾過，濾液 濃縮;領(lǐng)取阿膠適量水烊化與上述濃縮液合并，濃縮至相對密度為1.10 (80°C)的浸膏，其余 三十二味粉碎成細粉，過篩，混勻，用上述浸膏泛丸，制成濃縮丸，60-80°C干燥，包糖衣，打 光，即得。 所述UPLC指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟： (1) 對照品溶液的制備:精密稱取橙皮苷、黃芩苷適量，放入25mL棕色容量瓶中，加入甲 醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成橙皮苷0.30-0.4511^*1111/ 1、黃芩苷0.10-0.351^*1111/1的 對照品溶液，即得； (2) 供試品溶液的制備：取婦科再造丸，粉碎成粉末后，稱取0.5g，精密稱定，置具塞錐 形瓶中，精密加入55-65 %甲醇40-60mL，稱定質(zhì)量，超聲提取0.5-1.5h，放冷，再稱定質(zhì)量， 用40-60%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過慮，即得； (3) 色譜條件:色譜柱:ACQUITY UPLC Hss Τ3 1·8μπι2· IX 100mm Column;流動相:0.1% 甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫；柱溫：50°C ;流速:0.2-0.4mL · min-1;檢測波長：250-310歷;進樣量241^ (4) 指紋圖譜的制作：按上述方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣，記錄譜圖 得到婦科再造丸的UPLC指紋圖譜； (5) 指紋譜圖的確認：按照上述提供的方法，對多批次婦科再造丸建立了 UPLC指紋圖 譜，通過分析比較確定了 15個共有峰，這些共有峰構(gòu)成了婦科再造丸的指紋特征，作為婦科 再造丸的指紋圖譜。2. 如權(quán)利要求1所述的婦科再造丸UPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于:所述對照品 溶液這樣制備:精密稱取橙皮苷、黃芩苷適量，放入25mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解，并稀 釋至刻度，搖勻，制成橙皮苷〇. 3452mg · mL'黃芩苷0.2204mg · ml/1的對照品溶液，即得。3. 如權(quán)利要求1所述的婦科再造丸UPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于:所述供試品 溶液這樣制備:取婦科再造丸，粉碎成粉末后，稱取〇. 5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密 加入50%甲醇50mL，稱定質(zhì)量，超聲提取lh，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì) 量，搖勾，過慮，即得。4. 如權(quán)利要求1所述的婦科再造丸UPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于:所述梯度洗 脫條件為：〇~22min，2~20%B;22~30min，20~28%B;30~36min，28~50%B。5. 如權(quán)利要求1所述的婦科再造丸UPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于:所述15個共 有峰，以10號峰黃芪苷為參照峰，其余峰相對保留時間分別為0.098-0.099，0.114-0.18， 0.0151，0·246,0·364,0·474,0·817,0·887,0·905，1.081，1·196,1.330,1.464,1.607。6.如權(quán)利要求1所述的婦科再造丸UPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于:所述流速為 0 · 3mL · min-1;所述檢測波長:280nm。
【文檔編號】G01N30/02GK106018576SQ201610304060
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】徐劍, 張永萍, 楊立勇, 繆艷燕, 劉耀
【申請人】貴陽中醫(yī)學(xué)院