血漿樣品中2,3-吲哚醌的濃度的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種血漿樣品中2,3-吲哚醌的濃度的測定方法，所述測定方法包括：血漿樣品前處理步驟：在0～4℃下，按體積比為1：5混合動物給予2,3-吲哚醌后采集的血漿樣品和內(nèi)標物甲醇溶液，渦旋30～90秒后離心取上清液；以及通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對經(jīng)前處理的血漿樣品進行檢測的檢測步驟，其中液相色譜條件包括：色譜柱為Ascentis，RP-Amide，5μm，50×2.1mm；色譜流動相A為5mM甲酸銨/5mM甲酸水溶液，流動相B為甲醇，流動相A與B的體積百分比分別為55%和45%；質(zhì)譜條件包括：質(zhì)譜掃描類型為正離子多反應監(jiān)測；離子源為電噴霧離子源；霧化氣壓力為50psi；氣體流速為9L/min；毛細管電壓為4500V；離子源溫度為350℃，內(nèi)標法定量。
【專利說明】血漿樣品中2, 3-吲哚醌的濃度的測定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥檢測領(lǐng)域，涉及一種內(nèi)源性活性化合物2，3_吲哚醌的生物體內(nèi)血漿樣品中的濃度的測定方法。

【背景技術(shù)】
[0002]2，3-Π引哚醌(2，3-1ndolined1ne, Isatin, ISA),又名靛紅,是近年發(fā)現(xiàn)存在于人和動物體內(nèi)的一種內(nèi)源性活性因子,具有多種生物活性。
[0003]液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)，尤其是其中的液相色譜-大氣壓電離質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-AP1-MS)，是目前分析生物樣品中痕量物質(zhì)的首選。它兼具了液相色譜與質(zhì)譜兩種技術(shù)的優(yōu)點，具有高靈敏度和專一性，，并大大縮短分析時間。
[0004]目前，已有報道的2，3-吲哚醌測定方法有ECL、GC-MS、LC-MS以及HPLC等方法，這些方法大多樣品前處理復雜，有些需要對生物樣品進行多步純化處理，實驗操作過程比較繁瑣，而且樣品分析時間較長，被用于2，3-吲哚醌的體內(nèi)藥代動力學研究中大批生物樣品的分析測試方法還很少，且存在以上問題，因此在處理藥代動力學研究中所產(chǎn)生的大量樣品就需要開發(fā)高通量的快速分析方法，特別是樣品前處理簡便、檢測手段靈敏的快速分析方法。例如中國專利CN102735764A公開一種血漿中利巴韋林含量的測定方法，該方法使用較為簡便的血漿預處理方法，并使用LC-MS法檢測，靈敏度較高。但是目前關(guān)于血漿樣品中2，3-吲哚醌濃度的快速簡便靈敏的測定方法還鮮有報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]基于2，3-吲哚醌的臨床前藥代動力學研究中存在的生物樣品濃度分析方法中的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種高通量快速檢測血漿中2，3-吲哚醌濃度的一種液質(zhì)聯(lián)用分析方法。
[0006]在此，本發(fā)明提供一種血漿樣品中2，3-吲哚醌的濃度的測定方法，包括:
血漿樣品前處理步驟:
在O?4°C下，按體積比為1:5混合動物給予2，3-吲哚醌后采集的血漿樣品(含2，3-吲哚醌的血漿樣品)和內(nèi)標溶液，渦旋30?90秒后離心取上清液，其中所述內(nèi)標溶液為10ng/mL的奎硫平甲醇溶液；通過液相色譜_質(zhì)譜聯(lián)用對經(jīng)前處理的血漿樣品進行檢測的檢測步驟，其中
液相色譜條件包括:色譜柱為Ascentis, RP-Amide, 5 μ m, 50 X 2.1mm ;色譜流動相A為5mM甲酸銨/5mM甲酸水溶液，流動相B為甲醇，流動相A與B的體積百分比分別為55%和45% ；
質(zhì)譜條件包括:質(zhì)譜掃描類型為正離子多反應監(jiān)測；離子源為電噴霧離子源；霧化氣壓力為50psi ;氣體流速為9L/min ;毛細管電壓為4500V ;離子源溫度為350°C，內(nèi)標法定量。
[0007]本發(fā)明通過甲醇蛋白沉淀法處理血漿樣品，用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀器分析血漿樣品中2，3-吲哚醌的濃度。因此，本發(fā)明的方法具有前處理簡便、檢測手段靈敏專一、檢測速度快的優(yōu)點。本發(fā)明的方法的準確度、精密度及檢測限符合生物樣品分析方法學驗證要求，能夠滿足2，3-吲哚醌的藥代動力學研究中血漿樣品的濃度測定需要。
[0008]在所述血漿樣品前處理步驟中，所述內(nèi)標物甲醇溶液優(yōu)選為10ng/mL的奎硫平甲醇溶液。又，所述離心優(yōu)選為以15000r/min的速度離心5min。
[0009]又，在所述檢測步驟中，所述液相色譜條件還包括:柱溫為40°C ；自動進樣器溫度為6°C ;洗針液為異丙醇水溶液，其中，異丙醇與水的體積比為1:1 ;分析時間為2分鐘,流速為400 μ L/min,進樣量為5 μ L。
[0010]在所述檢測步驟中，所述質(zhì)譜條件還包括:用于定量分析的離子對為:2，3-吲哚醌:148 — 65.1 ;奎硫平:384.1 — 253.1。
[0011]本發(fā)明中，所述血漿樣品是哺乳動物的血漿。
[0012]在一個示例中，所述血漿樣品是動物給予2，3-吲哚醌后采集的新鮮血漿樣品。
[0013]在又一個示例中，所述血漿樣品是動物給予2，3-吲哚醌后采集的血漿樣品存放于-80°C冰箱的儲備血漿樣品，所述血漿樣品前處理步驟還包括在與所述內(nèi)標物甲醇溶液混合前先將所述儲備血漿樣品從_80°C冰箱取出，于O?4°C下自然融化后漩渦20?40秒。
[0014]本發(fā)明中，所述測定方法的最低檢測限為10ng/mL。能夠滿足于低含量2，3_吲哚醌的檢測。
[0015]本發(fā)明中，所述測定方法的相對誤差和相對標準偏差均在20%以內(nèi)，重現(xiàn)性和可靠性較高，具有較高的穩(wěn)定性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是大鼠血漿中選擇性樣品色譜圖，其中圖1 (a)是空白血漿的2，3_吲哚醌色譜圖，圖1 (b)是空白血漿的奎硫平色譜圖，圖1 (C)是空白血漿加內(nèi)標的2，3-吲哚醌色譜圖，圖1 (d)是空白血漿加內(nèi)標的奎硫平色譜圖；
圖2是大鼠血漿中最低定量下限樣品色譜圖，其中圖2 Ca)是2，3-吲哚醌色譜圖，圖
2(b)是奎硫平色譜圖；
圖3是大鼠血漿系統(tǒng)殘留樣品色譜圖，其中圖3 (a)是2，3-吲哚醌色譜圖，圖3 (b)是奎硫平色譜圖；
圖4是Beagle犬(比格犬)血漿中選擇性樣品色譜圖，其中圖4 Ca)是空白血漿的2，3-吲哚醌色譜圖，圖4 (b)空白血漿的是奎硫平色譜圖，圖4 (c)是空白血漿加內(nèi)標的2，3-吲哚醌色譜圖，圖4 Cd)是空白血漿加內(nèi)標的奎硫平色譜圖；
圖5是Beagle犬(比格犬)血漿中最低定量下限樣品色譜圖，其中圖5 (a)是2，3_吲哚醌色譜圖，圖5 (b)是奎硫平色譜圖；
圖6是Beagle犬(比格犬)血漿系統(tǒng)殘留樣品色譜圖，其中圖6 Ca)是2，3_吲哚醌色譜圖，圖6 (b)是奎硫平色譜圖。

【具體實施方式】
[0017]以下，參照附圖，并結(jié)合下述實施方式進一步說明本發(fā)明。應理解這些實施方式和實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明。
[0018]本發(fā)明提供了一種高通量快速檢測血漿中2，3-吲哚醌濃度的一種液質(zhì)聯(lián)用分析方法，涉及:(I)血漿樣品的蛋白沉淀前處理方法；(2)血漿樣品中2，3-吲哚醌標準曲線的制備；(3)液相色譜分離方法；(4)質(zhì)譜檢測方法；(5)結(jié)果的計算。
[0019]本發(fā)明通過甲醇蛋白沉淀法處理血漿樣品，用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀器分析血漿樣品中2，3-吲哚醌的濃度。本方法的準確度，精密度及檢測限符合生物樣品分析方法學驗證要求，能夠滿足2，3-吲哚醌的藥代動力學研究中血漿樣品的濃度測定需要。
[0020]作為一個示例，本發(fā)明的方法可涉及以下方面。
[0021](I)血漿樣品的蛋白沉淀前處理:取50 μ L血漿樣品至1.5mL離心管中，加入250 μ L內(nèi)標溶液(例如，10ng/mL奎硫平甲醇溶液)，渦旋30~90秒后離心(例如15000r/min，離心5分鐘4°C);取上清液100 μ L至Agilent色譜進樣小瓶中。整個前處理過程在40C (或冰上(約為O~4°C))下進行。血漿樣品可以是從哺乳動物(例如大鼠或犬)中取出的新鮮血漿，將其直接置于冰上進行上述前處理，也可以將從哺乳動物中取出的新鮮血漿預先保存在-80 V冰箱中，需要用的時候從-80 V冰箱中取出樣品，在4°C (或冰上(約為O~4°C))自然溶化后渦旋30秒后再與內(nèi)標溶液混合。
[0022](2)標準曲線樣品的配制:
a)2，3-吲哚醌儲備液(Stock A)的配制:精密稱取2，3-吲哚醌標準品1.30mg,置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為260 μ g/mL的2，3-吲哚醌儲備液(Stock A)，儲存在4°C冰箱中待用；
b)2，3-吲哚醌標準溶液的配制:將2，3-吲哚醌儲備液(Stock A)用甲醇稀釋到200 μ g/mL,然后用甲醇逐級稀釋，配制成2，3-吲哚醌濃度為100，40，20，10, 4，2，0.4 μ g/mL的標準溶液，如表1，其中表1中的CSS表示標準曲線樣品添加溶液(Calibrat1nStandard Spiking Solut1n)，
表1，2，3-吲哚醌標準溶液配制:

【權(quán)利要求】
1.一種血漿樣品中2，3-吲哚醌的濃度的測定方法，其特征在于，所述測定方法包括:血漿樣品前處理步驟: 在O?4°C下，按體積比為1:5混合動物給予2，3-吲哚醌后采集的血漿樣品和內(nèi)標物甲醇溶液，渦旋30?90秒后離心取上清液；以及 通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對經(jīng)前處理的血漿樣品進行檢測的檢測步驟，其中 液相色譜條件包括:色譜柱為Ascentis, RP-Amide, 5 μ m, 50 X 2.1mm ;色譜流動相A為5mM甲酸銨/5mM甲酸水溶液，流動相B為甲醇，流動相A與B的體積百分比分別為55%和45% ； 質(zhì)譜條件包括:質(zhì)譜掃描類型為正離子多反應監(jiān)測；離子源為電噴霧離子源；霧化氣壓力為50psi ;氣體流速為9L/min ;毛細管電壓為4500V ;離子源溫度為350°C，內(nèi)標法定量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，在所述血漿樣品前處理步驟中，所述內(nèi)標物甲醇溶液為10ng/mL的奎硫平甲醇溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測定方法，其特征在于，所述血漿樣品前處理步驟中，所述離心是以15000r/min的速度離心5min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的測定方法，其特征在于，液相色譜條件還包括:柱溫為40°C ；自動進樣器溫度為6°C ;洗針液為異丙醇水溶液，其中異丙醇與水的體積比為I:1 ;分析時間為2分鐘，流速為400μ L/min，進樣量為5μ L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的測定方法，其特征在于，所述質(zhì)譜條件還包括:用于定量分析的離子對為'2, 3-吲哚醌:148 — 65.1 ;奎硫平:384.1 — 253.1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的測定方法，其特征在于，所述血漿樣品是哺乳動物的血漿。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的測定方法，其特征在于，所述血漿樣品是動物給予2，3-吲哚醌后采集的新鮮血漿樣品。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的測定方法，其特征在于，所述血漿樣品是動物給予2，3-吲哚醌后采集的血漿樣品存放于-80°C冰箱的儲備血漿樣品，所述血漿樣品前處理步驟還包括在與所述內(nèi)標物甲醇溶液混合前先將所述儲備血漿樣品從_80°C冰箱取出，于O?4°C下自然融化后鏇渦20?40秒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1?8中任一項所述的測定方法，其特征在于，所述測定方法的最低檢測限為10ng/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求1?9中任一項所述的測定方法，其特征在于，所述測定方法的相對誤差和相對標準偏差均在20%以內(nèi)。
【文檔編號】G01N30/02GK104133004SQ201310161192
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年5月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月3日
【發(fā)明者】陳春麟, 呂文旭, 王濤, 陳昊, 汪俊 申請人:上海美迪西生物醫(yī)藥有限公司