專利名稱：鉀離子濃度檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言涉及一種鉀離子濃度檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)的鉀是維持細(xì)胞生理活動的主要陽離子，是保持機(jī)體的正常滲透壓及酸堿平衡，參與糖及蛋白質(zhì)代謝，保證神經(jīng)肌肉的正常功能所必需，其含量是人體生理活動的重要指標(biāo)。尿液、血清中鉀離子的含量水平在臨床上可用了診斷一些腎臟、心臟等方面的疾病。正常情況下，人體的鉀離子濃度有一個合理的參考范圍，如血清中3.5
5.5mmol/L ;尿液中25 125mmol/24h。當(dāng)鉀離子高于參考值，表現(xiàn)出高鉀癥，其原因主要有急性腎功能衰竭、嚴(yán)重溶血或組織損傷、急性酸中毒或組織缺氧、腎上腺皮質(zhì)功能減退、 醛固酮缺乏、長期應(yīng)用利尿劑、家族性高血鉀等。血清鉀高還可引起嚴(yán)重的肌肉、心肌和呼吸功能的抑制性應(yīng)激紊亂，以及特異的心電圖改變。血清鉀高于7mmol/L時，就有這些現(xiàn)象出現(xiàn)，超過lOmmol/L時，即可發(fā)生心室纖顫，心臟停搏而導(dǎo)致死亡。反之當(dāng)鉀的攝入量不足、鉀丟失嚴(yán)重、腎臟疾病轉(zhuǎn)入多尿期等情況時則會出現(xiàn)低鉀癥。現(xiàn)有技術(shù)中測定鉀離子濃度的方法主要有中子活化法、同位素稀釋質(zhì)譜法、化學(xué)測定法、火焰光度法、離子選擇電極法、酶動力學(xué)法、原子分光光度法等。目前，臨床上經(jīng)常使用的方法是火焰光度法和離子選擇電極法。(I)火焰光度法火焰光度法是一種發(fā)射光譜分析法，利用火焰中激發(fā)態(tài)原子回降至基態(tài)時發(fā)射的光譜強(qiáng)度進(jìn)行含量分析，可檢測血清、尿液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+，該方法屬于經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)參考法，優(yōu)點是結(jié)果準(zhǔn)確可靠，廣為臨床采用。通常采用的定量方法有外標(biāo)準(zhǔn)法和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法。外標(biāo)準(zhǔn)法一般操作誤差較大，不常采用。內(nèi)標(biāo)法是標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)液采用加進(jìn)相同濃度的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)元素進(jìn)行測定，一般是加入鋰內(nèi)標(biāo)，測定的是鋰/鉀電流的比值，而不是單獨鉀的電流，這樣，可減小燃?xì)夂突鹧鏈囟炔▌拥纫蛩匾鸬恼`差，因而有較好的準(zhǔn)確性。(2)離子選擇電極法(ISE法):在專用儀器上進(jìn)行血清和尿液的鉀、鈉離子測定。因其具有標(biāo)本用量少，快速準(zhǔn)確，操作簡便等優(yōu)點，是目前所有方法中最為簡便準(zhǔn)確的方法，幾乎有取代其他方法的趨勢。其原理是離子選擇電極是一種電化學(xué)傳感器，其結(jié)構(gòu)中有一個對特定離子具有選擇性響應(yīng)的敏感膜電極，將離子活度轉(zhuǎn)換成電位信號，在一定范圍內(nèi)，其電位與溶液中特定離子活度的對數(shù)呈線性關(guān)系，通過與已知離子濃度的溶液比較可求得未知溶液的離子活度，按其測定過程又分為直接測定法和間接測定法，目前大部分采用間接測定法，由于間接測定法將待測樣本稀釋后測定，所測離子活度更接近離子濃度。目前主要的電極種類有玻璃膜電極，感應(yīng)材料為玻璃膜；固相電極，由難溶金屬物質(zhì)加壓成型；液態(tài)膜電極，將環(huán)氧樹脂或內(nèi)裝聚氯乙烯作為感應(yīng)膜；纈氨霉素膜制成的K+電極。這些電極都具有一定壽命，使用一段時問后，電極會老化，且價格昂貴。(3)化學(xué)測定法目前K+的化學(xué)測定主要利用復(fù)環(huán)王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦稱為冠醚，均為離子載體進(jìn)行測定，由于大環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)有空穴，分子內(nèi)部氧原子有未共用電子對可與金屬離子結(jié)合，根據(jù)空穴大小，可選擇性結(jié)合不同直徑的金屬離子，從而可達(dá)到測出離子濃度的目的。(4)酶法酶法測定鉀的原理是利用對丙酮酸激酶的激活作用，后者催化磷酸烯醇式丙酮酸變?yōu)槿樗嵬瑫r伴有還原型輔酶I的消耗，在波長340nm處測NADH的吸光度下降。(5)原子分光光度法也可用于檢測血清中鉀、鈉離子，但操作復(fù)雜，誤差較大，不及火焰光度法簡便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種利用菁染料超分子與鳥嘌呤四鏈體(G-四鏈體)作用體系檢測鉀離子濃度的新方法，以及應(yīng)用該方法配制而成的鉀離子濃度檢測試劑盒。利用該試劑盒中的試劑，可通過溶液的顏色判斷樣品中的鉀離子濃度范圍，現(xiàn)可視化檢測。
本發(fā)明的總體技術(shù)路線為通過加入鉀離子來調(diào)控G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成或構(gòu)象轉(zhuǎn)變，隨之菁染料識別G-四鏈體結(jié)構(gòu)的變化，從而反映出鉀離子的濃度水平。具體為在沒有鈉離子及其他金屬陽離子存在的環(huán)境下，鉀離子促使單鏈的DNA序列轉(zhuǎn)變?yōu)镚-四鏈體結(jié)構(gòu)，隨著G-四鏈體結(jié)構(gòu)的生成，菁染料的聚集形態(tài)發(fā)生變化，從而在顏色上發(fā)生改變，達(dá)到肉眼觀測；或者在鈉離子存在的環(huán)境下，DNA序列形成反平行結(jié)構(gòu)G-四鏈體，加入鉀離子反平行G-四鏈體則發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，隨著G-四鏈體構(gòu)象轉(zhuǎn)變，菁染料的聚集形態(tài)發(fā)生變化，從而在顏色上發(fā)生明顯的變化，從而半定量地判斷樣品中鉀離子濃度范圍。本發(fā)明的第一方面提供一種檢測液體樣品中鉀離子濃度范圍的方法，所述方法包括以下步驟(I)用pH6. 2 8. 2的緩沖溶液以一定的鉀離子濃度梯度配制多個溶液樣本，其中每個所述溶液樣本中含有相同濃度的能夠形成G-四鏈體的DNA分子、相同濃度的鈉離子以及相同濃度的菁染料；將配制好的溶液樣本作為標(biāo)準(zhǔn)比色樣品備用；(2)在待測液體樣品中加入能夠形成G-四鏈體的DNA分子、菁染料以及緩沖液，以使待測液體樣品中的能夠形成G-四鏈體的DNA分子的濃度、菁染料的濃度以及pH值與步驟(I)中的溶液樣本一致，從而得到測試溶液，并記錄待測液體樣品被稀釋的比例；(3)將測試溶液與步驟(I)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)比色樣品的顏色進(jìn)行對比，顏色與測試溶液相同的標(biāo)準(zhǔn)比色樣品的鉀離子濃度與測試溶液的鉀離子濃度一致，并通過待測樣品的稀釋比例計算待測樣品的鉀離子濃度。本發(fā)明的方法可以方便地用于檢測各種溶液樣品中的鉀離子濃度，例如，可以檢測人或動物血液、尿液或其他體液中的鉀離子濃度。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、三乙醇胺緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、2-氨基-2-甲基-I-丙醇緩沖液、磷酸鈉-磷酸氫鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、硼砂-氫氧化鈉緩沖液或磷酸鈉緩沖液。在本發(fā)明的實施方案中，對緩沖液中緩沖劑的濃度并不做特別的限定，但是優(yōu)選的濃度范圍為10 SOmmoI /I,η根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述菁染料為下式I的化合物
權(quán)利要求
1.一種檢測液體樣品中鉀離子濃度的試劑盒，所述試劑盒包括標(biāo)準(zhǔn)比色卡、PH6. 2 8. 2的緩沖液、可溶性鈉鹽、能夠形成G四鏈體的DNA分子和菁染料，其中通過以下方式來確定所述標(biāo)準(zhǔn)比色卡上的顏色(i)用PH6. 2 8. 2的緩沖溶液配制鉀離子濃度不同的多個溶液樣本，使每個所述溶液樣本中含有相同濃度的能夠形成G-四鏈體的DNA分子、相同濃度的鈉離子以及相同濃度的菁染料；(ii)按照溶液樣本鉀離子濃度由低到高的順序排列，通過圖像采集手段采集溶液樣本的顏色并制作成標(biāo)準(zhǔn)比色卡，比色卡上不同的顏色對應(yīng)不同的鉀離子濃度。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其中所述菁染料為式I的化合物，
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述C1-CJ烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基。
4.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中R1選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基、異己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基；R2、R3> R4和R5獨立地選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基。
5.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述5元至7元環(huán)結(jié)構(gòu)為含有或不含有N或S原子的飽和或不飽和環(huán)結(jié)構(gòu)。
6.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中Y選自氟、氯、溴、碘陰離子或三乙胺陽離子。
7.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、三乙醇胺緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、2-氨基-2-甲基-I-丙醇緩沖液、磷酸鈉-磷酸氫鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、硼砂-氫氧化鈉緩沖液或磷酸鈉緩沖液。
8.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其中所述溶液樣本中鉀離子濃度在O至300mmol/L的范圍，優(yōu)選在0 100mmol/L的范圍,進(jìn)一步優(yōu)選在0 10mmol/L的范圍，最優(yōu)選在0 2mmol/L的范圍；鈉離子濃度在O至200mmol/L的范圍，優(yōu)選在4(Tl60mmol/L的范圍；所述菁染料在所述溶液樣本中的濃度在5至30 μ mol/L的范圍，優(yōu)選在5 20 μ mol/L的范圍，所述能夠形成G-四鏈體的DNA分子在溶液樣本中的濃度在5飛O μ mol/L的范圍，優(yōu)選在5至30 μ mol/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及鉀離子濃度檢測試劑盒。利用鉀離子調(diào)控可形成G-四鏈體DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的特性以及菁染料超分子聚集體識別G-四鏈體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的特性，將待測樣品加入可形成G-四鏈體的DNA與菁染料混合溶液，根據(jù)溶液的顏色半定量地判斷樣品中的鉀離子濃度范圍。使用該試劑盒可以實現(xiàn)鉀離子濃度的可視化檢測，可開發(fā)成檢測試紙。試劑成分簡單，反應(yīng)過程簡單、不需要特殊或額外儀器，檢測成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用。
文檔編號G01N33/52GK102866149SQ20121020586
公開日2013年1月9日 申請日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者唐亞林, 孫紅霞, 楊千帆, 尚倩, 姜薇, 蓋偉, 向俊鋒 申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所