專利名稱：一種華根霉生產(chǎn)新型纖溶酶及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種華根霉生產(chǎn)新型纖溶酶及其方法。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病，如急性心肌梗塞和腦血栓等，是引起人類死亡的三大疾病之一，其發(fā)病率有增無減。血栓的主要成分是血纖維蛋白，溶栓療法是通過藥物溶解血栓中的主要基質(zhì)血纖維蛋白，或激活血液中無活性的血漿纖溶酶原，形成有活性的纖溶酶來催化血纖維蛋白的水解，使血栓溶解，血管再通。溶栓療法被譽(yù)為20世紀(jì)心腦血管學(xué)方面的十大發(fā)現(xiàn)之一，受到各國的高度重視。開發(fā)高效的溶栓藥物在臨床上具有重要意義。
目前正式批準(zhǔn)且在臨床上最常使用的溶栓劑為尿激酶(UK)、鏈激酶(SK)、組織型血纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)、重組組織型血纖維蛋白溶酶原激活劑(rt-PA)、對-甲氧苯甲酰纖溶酶原鏈激酶激活劑復(fù)合物(APSAC)和單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑(scu-PA)。其中UK和SK是纖維蛋白非特異溶栓藥，它們雖然具有一定的溶栓效果，但無纖維蛋白的特異性，使用中可能會造成血纖溶酶過量激活，導(dǎo)致纖維蛋白原過量降解，引發(fā)全身出血，同時SK還具有很強(qiáng)的免疫原性，重復(fù)使用易引起變態(tài)反應(yīng)。其余四種是纖維蛋白特異性溶栓藥，rt-PA延長了t-PA在血液中的半衰期，不伴有全身性的出血傾向，是目前公認(rèn)的最有效的纖維蛋白特異性溶栓劑。但它也只能使55％病人冠脈堵塞再通、溶栓時間較長、用量大、價格昂貴APSAC引起的出血不良反應(yīng)少，但因含有SK，故具有抗原性，可致過敏反應(yīng)；scu-PA有較強(qiáng)的溶栓作用，不具抗原性，也無過敏反應(yīng)，但可致出血并發(fā)癥。
由此可見，急需更加高效、安全、副作用小和相對便宜的溶栓藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于采用先進(jìn)的微生物培養(yǎng)技術(shù)將華根霉在特定條件下培養(yǎng)，產(chǎn)生一種新的性能優(yōu)良的纖溶酶，并利用現(xiàn)代分離技術(shù)將該纖溶酶分離提純，并驗證其酶學(xué)性質(zhì)。
方法為以微生物TK317(經(jīng)南開大學(xué)生命科學(xué)院鑒定為華根霉)為菌種，經(jīng)液體發(fā)酵方法培養(yǎng)后產(chǎn)生纖溶酶；將液體發(fā)酵液進(jìn)行膜過濾除去菌體和固形物，收集濾過液，再采用物理和生物化學(xué)方法對含纖溶酶的上清液進(jìn)行脫色、鹽析，并用現(xiàn)代層析方法合理組合，對產(chǎn)生的纖溶酶進(jìn)行提純，使酶純度達(dá)到色譜純。
具體包括下列步驟1.以華根霉為菌種，經(jīng)斜面、種子、發(fā)酵生產(chǎn)新型纖溶酶。
2.培養(yǎng)基斜面保存使用葡萄糖豆汁培養(yǎng)基，斜面菌種在28～30℃培養(yǎng)5d；發(fā)酵培養(yǎng)基采用含豆粕(膨化大豆、大豆、豆渣)、麩皮、胰蛋白胨和無機(jī)鹽的培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間為60～72h。
3.培養(yǎng)方法斜面菌種→一級液體種子→液體發(fā)酵培養(yǎng)；需要說明的是華根霉的培養(yǎng)可以采用多種條件，具體選擇下述一種條件(1)液體培養(yǎng)含4％～6％麩皮水、5％～8％豆粕、0.1～0.25％氯化銨、0.2～0.3％硝酸鈉和1％～2、5％胰蛋白胨，pH4.3～6.0接種量10％～20％，28～30℃，振蕩培養(yǎng)60～72h。
(2)液體培養(yǎng)含5％～6％麩皮水和3％～4％豆粕水解液，磷酸氫二銨0.2％～0.4％，硝酸鈉0.4％～0.5％，pH5.0～6.5。接種量10％～20％，28～30℃振蕩培養(yǎng)60～72h。
4.酶液的澄清；使用適宜孔徑的膜微濾去除菌體和固形物。
5.纖溶酶的粗提純；經(jīng)30-70％硫酸銨分級鹽析，再超濾除去鹽及小分子，大分子，得到較純的酶液6.含纖溶酶液體可以采用多種陰離子交換樹脂進(jìn)行脫色，具體選擇下述一種條件(1)D296強(qiáng)陰離子交換樹脂用強(qiáng)堿再生，收集未吸附部分。
(2)D301弱陰離子交換樹脂用強(qiáng)堿再生，收集未吸附部分。
脫色過程中始終要控制pH值在7.0-8.0。
7.纖溶酶的精提純脫色后的含纖溶酶的液體，采用超濾的方法脫鹽，除去多余的小分子和大分子。離子交換色譜或凝膠過濾色譜方法對酶進(jìn)行精提純。
纖溶酶的精提純采用下述方法，得到色譜純的纖溶酶。
(1)選擇截留分子量分別為20kDa和40kDa的超濾膜，柱壓0.1Mpa。
(2)SP-sepharose HP離子交換層析技術(shù)上樣后用0～1M中性鹽溶液梯度洗脫。
(3)Sephacryl S-100凝膠過濾色譜，收集有活性成分的部分。
新型纖溶酶組成通過測定，新型纖溶酶的N-末端12個氨基酸殘基的序列為NH2-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly分子量為30500Da，等電點(diǎn)8.5±0.2。
所用的微生物菌種——華根霉TK317是從我國南方小酒藥中分離的，菌種遺傳性能穩(wěn)定，而且其代謝產(chǎn)生的纖溶酶安全性好，無毒性。
華根霉生產(chǎn)新型纖溶酶的性質(zhì)該纖溶酶具有優(yōu)良的性能，其適宜作用pH范圍為7.0～9.0，與人體生理pH吻合好；分子量小，用藥劑量?。挥兄苯尤芙庋ê图せ钊死w溶酶原的雙重作用，溶栓效果好；同時降解血栓中的主要成分纖維蛋白的α、β和γ鏈，這一特點(diǎn)與人纖溶酶非常相似；最適作用溫度45℃，人體體溫37℃為適宜作用溫度，52℃下0.5h酶活力保持60％，熱穩(wěn)定性好，易于貯存；底物專一性好，只分解生色底物N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNAa(納豆激酶的最適生色底物)，分解的米氏常數(shù)Km為0.23mM；不作用于凝血酶、尿激酶和胰蛋白酶的特異性生色底物；低濃度的Cu’2+、Co2+、K+、Fe3+、Fe2+、Ca2+、、Mg2+、、Mn2+、Na+、Zn2+不影響血栓溶酶的活性。
具體實施例方式
實施例11、菌種華根霉TK3172、培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法斜面保存使用葡萄糖豆汁培養(yǎng)基，斜面菌種在28～30℃培養(yǎng)5d；液體發(fā)酵采用的培養(yǎng)基含5％麩皮水、6％豆粕、0.1％氯化銨、0.2％硝酸鈉和1％～2.5％胰蛋白胨，pH4.5，接種量10％～20％，28～30℃震蕩培養(yǎng)60～72h。
3、酶的粗提純得到的纖溶酶發(fā)酵液，微濾除去菌體和固形物；用D301陰離子交換樹脂對含纖溶酶的液體進(jìn)行脫色；用30％～70％飽和度的硫酸銨進(jìn)行分步鹽析，收集沉淀。
4、酶的精提純順次超濾去鹽和部分雜質(zhì)蛋白；用配基為磺酸丙基的填料進(jìn)行離子交換層析，樣品用0～1M鹽梯度洗脫；最后冷凍干燥得到纖溶酶產(chǎn)品。
實施例2培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法斜面保存使用葡萄糖豆汁培養(yǎng)基，斜面菌種在28～30℃培養(yǎng)5d；液體發(fā)酵培養(yǎng)基含5.6％麩皮水和5.3％豆粕水解液(預(yù)先用0.1N的HCl水解)，1％～2.5％胰蛋白胨，接種量10％～20％，28～30℃震蕩培養(yǎng)60～72h。含纖溶酶液的脫色用D296陰離子交換樹脂，用65％的乙醇沉淀纖溶酶。其它步驟同實施例1。
實施例3培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法步驟同實施例1。純化后的純酶測定蛋白質(zhì)N-末端氨基酸殘基序列，得到如下結(jié)果NH2-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly測定其分子量為30.5kDa；等電點(diǎn)為8.5。低濃度的Cu’2+、Co2+、K+、Fe3+、Fe2+、Ca2+、、Mg2+、、Mn2+、Na+、Zn2+不影響血栓溶酶的活性。
實施例4培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法步驟同實施例1。取微濾后得到的菌體，用無菌水洗滌2-4次。迅速于液氮中冷凍。使用Trizol法提取菌體總RNA，使用寶生物(大連)公司的TaKaRa RNA PCRKit(AMV)試劑盒進(jìn)行RT-PCR，得到單一目的基因條帶，與質(zhì)粒PUC19連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，得到有纖溶活性的轉(zhuǎn)化子，送檢測序。
權(quán)利要求
1.一種華根霉生產(chǎn)新型纖溶酶，其特征為纖溶酶的N-末端12個氨基酸殘基的序列為NH2-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly，分子量為30500Da，等電點(diǎn)8.5±0.2；pH范圍為7.0～9.0。
2.一種如權(quán)利要求1所述的華根霉生產(chǎn)新型纖溶酶的生產(chǎn)方法，包括下列步驟a對產(chǎn)生菌華根霉TK317進(jìn)行斜面、種子、發(fā)酵三級培養(yǎng)；b從發(fā)酵液中分離純化得到纖溶酶。
3.如權(quán)利要求2所述的華根霉生產(chǎn)新型纖溶酶的生產(chǎn)方法，其特征是所述的步驟a)是將華根霉TK317在葡萄糖豆汁斜面培養(yǎng)基上28～30℃培養(yǎng)5天，一級種子培養(yǎng)使用麩皮水和蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)11小時；液體發(fā)酵培養(yǎng)基采用麩皮水、豆粕水解物、無機(jī)鹽類；或采用麩皮、豆粕、胰蛋白胨和無機(jī)鹽，培養(yǎng)時間60-72小時，得到發(fā)酵液。
4.如權(quán)利要求3所述的華根霉生產(chǎn)新型纖溶酶的生產(chǎn)方法，其特征是所述的采用華根霉為菌種，液體培養(yǎng)的具體選擇條件采用下述的(1)或(2)的一種方法(1)液體培養(yǎng)含4％～6％麩皮水、5％～8％豆粕、0.1～0.25％氯化銨、0.2～0.3％硝酸鈉和1％～2.5％胰蛋白胨，pH4.3～6.0接種量10％～20％，28～30℃，振蕩培養(yǎng)60～72h。(2)液體培養(yǎng)含5％～6％麩皮水和3％～4％豆粕水解液，磷酸氫二銨0.2％～0.4％，硝酸鈉0.4％～0.5％，pH5.0～6.5。接種量10％～20％，28～30℃振蕩培養(yǎng)60～72h。
5.如權(quán)利要求2所述的華根霉生產(chǎn)新型纖溶酶的生產(chǎn)方法，其特征是所述的步驟b)是將制備的粗酶液采用微濾除去菌體等雜質(zhì)，經(jīng)40-70％硫酸銨分級鹽析，再超濾除去鹽及小分子，大分子，得到較純的酶液；采用離子交換色譜或凝膠過濾色譜獲得電泳純的酶；再將含纖溶酶液體采用多種陰離子交換樹脂進(jìn)行脫色。
6.如權(quán)利要求5所述的華根霉生產(chǎn)新型纖溶酶的生產(chǎn)方法，其特征是所述的采用陰離子交換樹脂方法具體選擇下述的(1)或(2)的一種方法(1)D296強(qiáng)陰離子交換樹脂用強(qiáng)堿再生，收集未吸附部分；(2)D301弱陰離子交換樹脂用強(qiáng)堿再生，收集未吸附部分；任何一種方法的脫色過程中始終要控制pH值在7.0-8.0。
7.如權(quán)利要求5或6所述的華根霉生產(chǎn)新型纖溶酶的生產(chǎn)方法，其特征是所述的獲得電泳純的酶再進(jìn)行精提純，方法如下(1)選擇截留分子量分別為20kDa和40kDa的超濾膜，柱壓0.1Mpa；(2)SP-sepharose HP離子交換層析技術(shù)上樣后用0～1M中性鹽溶液梯度洗脫；(3)Sephacryl S-100凝膠過濾色譜，收集有活性成分的部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及從一株華根霉發(fā)酵物中提取新型溶血栓藥物纖溶酶。該纖溶酶的分子量30.5kDa，等電點(diǎn)8.5，有直接溶解血栓和激活人纖溶酶原的雙重作用。生產(chǎn)方法為a對產(chǎn)生菌華根霉TK317進(jìn)行斜面、種子、發(fā)酵三級培養(yǎng)；b從發(fā)酵液中分離純化得到纖溶酶。產(chǎn)品安全無毒、價格低廉。以廉價的農(nóng)副產(chǎn)品豆粕、膨化大豆和麩皮為主要原料，采用液體發(fā)酵方法生產(chǎn)；純化方法中包括微濾除菌體、離子交換樹脂脫色、鹽析、超濾除鹽和雜質(zhì)蛋白，離子交換層析純化。工藝流程短，成本低，工業(yè)化生產(chǎn)效率高，具有開發(fā)價值。
文檔編號C12P21/02GK1587399SQ20041007180
公開日2005年3月2日 申請日期2004年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月3日
發(fā)明者路福平, 杜連祥, 蔡興旺, 張清忠, 劉曉蘭, 遲文鶴 申請人:天津科技大學(xué), 天津振和生物工程有限公司