專利名稱：一種小分子量方格星蟲纖溶酶及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種小分子量方格星蟲纖溶酶及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血栓性疾病(thrombotic disease, TD)危害心、腦、肺的血管系統(tǒng),造成急性心肌梗塞、腦梗塞、腦血栓形成、肺動(dòng)脈栓塞、肢體靜脈血栓等疾病。目前臨床上用于血栓預(yù)防和治療的藥物主要分為3類:抗血小板藥物、抗凝藥物和溶栓藥物。現(xiàn)有溶栓藥物還存在缺乏特異性、出血副作用強(qiáng)、藥劑量難以控制、半衰期短、易出現(xiàn)再栓塞等問題。方格星蟲(Sipunculus nudus)是一種海洋底棲無(wú)脊椎動(dòng)物,隸屬于星蟲動(dòng)物門(Sipuncula),方格星蟲綱(Sipunculida),星蟲科,方格星蟲屬動(dòng)物。生活在沿海灘涂一帶沙泥底質(zhì)的海域，漲潮時(shí)鉆出，退潮時(shí)潛伏在沙泥洞中，俗稱沙蟲、光裸星蟲、沙腸子。已報(bào)導(dǎo)的大約有300種隸屬為全球分布種類，在我國(guó)沿海均有分布。星蟲有較高藥用功效和食療價(jià)值。它性寒，味甘、咸，有滋陰降火、清肺補(bǔ)虛之功效。星蟲體內(nèi)富含多種活性物質(zhì)，具有抗擊疲勞、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、滋陰降火以及清肺化痰等功效。國(guó)內(nèi)外對(duì)方格星蟲的研究主要集中在形態(tài)解剖學(xué)特征、繁殖生物學(xué)及生理生化等方面。關(guān)于星蟲纖溶酶相關(guān)專利有李肖肖、雷丹青等從方格星蟲中提取的纖溶酶(專利號(hào):CN101892210A)其分子量在27_35kDa之間。牛榮麗、唐景財(cái)廖共山等從革囊星蟲內(nèi)臟中提取出具有激酶和直接溶解纖維蛋白活性的纖溶酶(專利號(hào):CN102002488A)其分子量在28-32kDa 之間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè) 目的是提供一種方格星蟲纖溶酶。本發(fā)明提供的方格星蟲纖溶酶，為具有如下I)或2)特征的纖溶酶:1)其分子量為 20KDa-25KDa ;2)等電點(diǎn)為 3.0-3.5。上述方格星蟲纖溶酶，為具有如下I)或2)特征的纖溶酶:I)其分子量為24917Da ；
2)等電點(diǎn)為3.211。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備上述方格星蟲纖溶酶的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:I)將離體的方格星蟲內(nèi)臟依次進(jìn)行勻漿、鹽析，收集鹽析產(chǎn)物；2)將所述鹽析產(chǎn)物依次經(jīng)離子交換柱層析和凝膠柱層析，得到方格星蟲纖溶酶。上述方法中，所述離子交換柱層析為陰離子交換柱層析；所述陰離子交換柱層析為將所述鹽析產(chǎn)物流經(jīng)陰離子交換柱，用含0.1-1M NaCl的濃度為0.02M、pH值為7.8的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，檢測(cè)陰離子交換柱洗脫產(chǎn)物活性，收集具有活性的陰離子交換柱層析洗脫產(chǎn)物；所述線性洗脫的時(shí)間為20h，所述線性洗脫的流速為0.5mL/min ;所述陰離子交換柱具體為DEAE-S^harose FF,030X400mm；所述凝膠柱層析為將所述陰離子交換柱洗脫產(chǎn)物流經(jīng)葡聚糖凝膠柱，用濃度為
0.02M、pH值為7.5的PBS緩沖液洗脫，檢測(cè)葡聚糖凝膠柱洗脫產(chǎn)物活性，收集具有活性的凝膠柱層析洗脫產(chǎn)物；所述洗脫的時(shí)間為6h，所述洗脫的流速為lmL/min ;所述葡聚糖凝膠柱具體為 Sephadex G-50, 016X600mm。所述檢測(cè)洗脫產(chǎn)物活性采用的方法具體為纖維素蛋白平板檢測(cè)，若形成透明圈，則有活性。上述收集具有活性的陰離子交換柱層析洗脫產(chǎn)物為每IOmin收集一管洗脫產(chǎn)物，收集第45-50管洗脫產(chǎn)物；上述收集具有活性的凝膠柱層析洗脫產(chǎn)物為每IOmin收集一管洗脫產(chǎn)物，收集第18-22管洗脫產(chǎn)物。上述方法中，步驟2)中，在所述離子交換柱層析步驟前，還包括將所述鹽析產(chǎn)物溶解后透析除鹽的步驟；所述溶解采用的PH值為7.5、濃度為0.02mol/L的PBS緩沖液。在所述陰離子交換柱層析中，在所述檢測(cè)陰離子交換柱洗脫產(chǎn)物活性的步驟前還包括:將線性梯度洗脫的產(chǎn)物透析除鹽的步驟；在所述凝膠柱層析中，在收集具有活性的凝膠柱層析洗脫產(chǎn)物的步驟后還包括:將所述具有活性的凝膠柱層析洗脫產(chǎn)物透析除鹽、干燥，得到方格星蟲纖溶酶的步驟。上述方法中，所述透析采用截留分子量為IOkDa的透析袋。上述干燥為冷凍干燥。上述方法中，步驟 1)，所述勻漿為將所述方格星蟲的內(nèi)臟與pH為7.5、濃度為
0.02mol/L的磷酸緩沖液混勻后勻漿，離心收集上清液A ;所述鹽析包括如下步驟:A、向所述上清液A加入硫酸銨至質(zhì)量百分含量為30%,混勻、靜置、離心收集上清液B ；B、向所述上清液B中加入硫酸銨至質(zhì)量百分含量為70%,混勻、靜置、離心,收集沉淀，得到鹽析產(chǎn)物。上述方法中，所述方格星蟲的內(nèi)臟與所述磷酸緩沖液的配比為250g:1L ；所述勻漿在0_4°C條件下進(jìn)行；所述勻漿具體在0°C條件下進(jìn)行；所述靜置均為4_10°C靜置2_8h,所述靜置均具體為4°C靜置2h ；所述離心均為在4_10°C、離心力為4000-8000g下離心10_30min ;所述離心均具體為在4°C、離心力為5000g下離心lOmin。由上述的方法制備得到的方格星蟲纖溶酶也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，所述方格星蟲纖溶酶分子量具體為24917Da、等電點(diǎn)具體為3.211。上述的方格星蟲纖溶酶在降解纖維蛋白原中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的方法，可以從方格星蟲中提取纖溶酶，且該纖溶酶的分子量為24917Da、等電點(diǎn)為3.211 ;與目前現(xiàn)有的纖溶酶相比，分子量小，具有直接降解或通過激活纖溶酶原降解纖維蛋白原(血栓)的激酶活性，由于其具有更小的分子量，更容易進(jìn)行蛋白表達(dá)，也更易于制備預(yù)防和治療由血栓引起的相關(guān)疾病的藥物。


圖1為SDS-PAGE測(cè)方格星蟲纖溶酶SNF分子量圖2為MALD1-T0F/MS測(cè)方格星蟲纖溶酶SNF分子量圖3為等點(diǎn)聚焦測(cè)定方格星蟲纖溶酶SNF的等電點(diǎn)圖4為標(biāo)準(zhǔn)和加熱瓊脂糖纖維蛋白平板
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、方格星蟲纖溶酶的制備1、勻漿取2kg活方格星蟲(購(gòu)買自廈門水產(chǎn)市場(chǎng))，洗凈解剖，取250g內(nèi)臟，加入ILρΗ7.5 的 0.02mol/L 磷酸緩沖液(PBS) (PBS 配方:NaCll.169g、KC10.2g、Na2HP043.63g、KH2PO40.24g和水混合，調(diào)節(jié)pH值為ρΗ7.5)，冰浴勻漿((TC )，然后5000g，4°C離心lOmin，收集上清液A。2、鹽析在上述上清液A中加入硫酸銨至其質(zhì)量百分含量為30%，混勻后4°C靜置2h，5000g，4°C離心IOmin收集上清液B ;再向上清液B中加入硫酸銨至終濃度為70% (質(zhì)量百分含量)，混勻后4°C靜置2h，5000g，4°C離心IOmin收集沉淀為鹽析產(chǎn)物。

3、純化I)陰離子交換柱層析向上述沉淀加入pH7.5,0.02mol/L的PBS緩沖液溶解，用截留分子量為IOkDa的
透析袋透析除鹽，得到透析后產(chǎn)物。將上述透析后產(chǎn)物經(jīng)陰離子交換柱DEAE-S印harose FF (上海寶曼生物科技有限公司，玻璃層析柱030x400mm)進(jìn)行線性梯度洗脫，洗脫緩沖液為含0.1-1M NaCl的0.02M,PH7.8的Tris-HCl緩沖液；洗脫時(shí)NaCl的初始濃度為0.1M，在20h (洗脫總時(shí)間)達(dá)到1M，流速為0.5mL/min,每IOmin收集一管,分光光度儀在280nm檢測(cè)多肽特征吸收峰,合并第45-50管單個(gè)峰樣品，再經(jīng)截留分子量為IOkDa的透析袋透析除鹽，采用纖維素蛋白平板檢測(cè)峰活性(方法可見實(shí)施例2所示)，形成透明圈為活性峰，收集活性峰對(duì)應(yīng)的樣品。2)凝膠柱層析將上述活性峰對(duì)應(yīng)的樣品經(jīng)葡聚糖凝膠柱Sephadex G-50 (GE HealthcareBioscience，貨號(hào):17-0043-01，玻璃層析柱016 X 6(J0mm)進(jìn)行分離，以 0.02M，pH7.5 的 PBS緩沖液洗脫，流速為lmL/min,每IOmin收集一管,洗脫總時(shí)間為6h ;分光光度儀在280nm檢測(cè)多肽特征吸收峰，合并第18-22管單個(gè)峰樣品單個(gè)峰樣品，采用纖維素蛋白的平板(方法可見實(shí)施例2所示)檢測(cè)峰活性(若形成透明圈，則為活性峰。)，收集活性峰對(duì)應(yīng)的樣品，(凝膠柱層析溶液鹽濃度低可直接測(cè)活性)再將活性峰對(duì)應(yīng)的樣品經(jīng)截留分子量為IOkDa透析除鹽后冷凍干燥，-20°C保存?zhèn)溆?，得到纖溶酶SNF。實(shí)施例2、方格星蟲纖溶酶的鑒定1、纖溶酶的分子量、等電點(diǎn)鑒定I) Native-Page 電泳檢測(cè)
將實(shí)施例1得到的纖溶酶樣品和2X樣品溶解液(1.0%溴酚藍(lán)0.5ml, Tris-HCl(0.5mol/L，pH6.8) 2.5mL，50% 甘油 2.5mL)混合，用 10% (m/V)分離膠，5% (m/V)濃縮膠的Native-Page檢測(cè),結(jié)果實(shí)施例1得到的纖溶酶為單一電泳條帶的纖溶酶。2)纖溶酶的酶純度將實(shí)施例1得到的纖溶酶樣品和2 X樣品溶解液(10%SDS4.0mL, 1.0%溴酚藍(lán)0.5ml, Tris-HCl (0.5mol/L, ρΗ6.8) 2.5mL, 50% 甘油 2.5mL, β -巰基乙醇 1.0mL)混合，于100°C加熱3min，使蛋白質(zhì)變性，用12% (m/V)分離膠，5% (m/V)濃縮膠的SDS-PAGE進(jìn)行酶純度檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，為分子量約為25kDa的單一電泳條帶(箭頭所示)。3)纖溶酶的分子量酶解:將實(shí)施例1得到的纖溶酶放入Eppendorf管中，每管加入200-400 μ LIOOmmoI/L NH4HC03/30%ACN 脫色，凍干后加入 5 μ L2.5-lOng/ μ L 測(cè)序級(jí)Trypsin(Promega)溶液(酶與被分析蛋白質(zhì)質(zhì)量比一般為1: 20-1: 100),37°C反應(yīng)過夜，20小時(shí)左右；吸出酶解液，轉(zhuǎn)移至新EP管中，原管加入100 μ L60%ACN/0.1%TFA,超聲15分鐘，合并前次溶液，凍干；用Ziptip (millipore)進(jìn)行脫鹽,得到脫鹽產(chǎn)物。再將上述脫鹽產(chǎn)物與5mg/mLHCCA基質(zhì)1:1混合后，用4800串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(4800Plus MALDI T0F/T0FTM Analyzer) (Applied Biosystems, USA)進(jìn)行質(zhì)譜分析，測(cè)定纖溶酶的分子量。激光源為355nm波長(zhǎng)的Nd = YAG激光器，加速電壓為2kV。結(jié)果如圖2所示，實(shí)施例1得到的纖溶酶的大小為24917Da。4)纖溶酶的等電點(diǎn)采用等點(diǎn)聚焦測(cè) 定(B10-RAD公司PROTEAN IEF Cell)實(shí)施例1得到的纖溶酶的等電點(diǎn)，結(jié)果如圖3所示，可以看出，實(shí)施例1得到的纖溶酶等電點(diǎn)為3.211。2、方格星蟲纖溶酶的活性鑒定采用纖維蛋白平板法測(cè)定纖溶酶的酶活，具體方法如下:在直徑9cm的平皿中加入生理鹽水配制的ImL的凝血酶(美國(guó)Sigma, T-4648,1000U, 10U/mL)，然后加入6mL0.5% (質(zhì)量百分含量)的纖維蛋白原溶液(由溶質(zhì)和溶劑組成；溶質(zhì)為牛纖維蛋白原購(gòu)自美國(guó)Sigma產(chǎn)品編號(hào)F8630，溶劑為0.02M，pH7.5的PBS緩沖液)，再加入2% (質(zhì)量百分含量)瓊脂糖水溶液6mL，快速晃勻，室溫(25°C)靜置60min，得到纖維蛋白平板。制成的平板分兩組，一組不加熱，一組加熱。加熱的平板為在85°C加熱30min(滅活纖維蛋白原中的纖溶酶原)。用打孔器分別在兩組平板上打直徑3mm孔，分別加入IOuL方格星蟲纖溶酶SNF溶液(由實(shí)施例1得到的纖溶酶SNF溶解在0.02M，pH7.5的PBS緩沖液中，且纖溶酶SNF的蛋白濃度經(jīng)BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒檢測(cè)為301.8ug/mL)入孔，37°C保溫18h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量纖溶圈橫縱直徑，以尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照。以尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma產(chǎn)品編號(hào)U0633)濃度為橫坐標(biāo)，不同濃度尿激酶溶圈橫縱直徑積為縱坐標(biāo)作圖(標(biāo)曲函數(shù)式:Y=2.5892Χ-3.9728，R2=0.9959)。纖溶酶的酶活力單位為將纖溶酶的橫縱纖溶圈直徑乘積按尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線查出酶活力單位。結(jié)果如圖4所示。采用BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒進(jìn)行纖溶酶的蛋白含量為301.8ug/mL (每ml方格星蟲纖溶酶SNF溶液中蛋白含量)；纖溶酶比活力為上述測(cè)定的酶活力單位與蛋白含量的比，纖溶酶(SNF)的比活力為 13674U/mg 蛋白。上述結(jié)果進(jìn)一步證明，實(shí)施例1得到的為纖溶酶。`
權(quán)利要求
1.一種方格星蟲纖溶酶，為具有如下I)或2)特征的纖溶酶:1)其分子量為20KDa-25KDa ;2)等電點(diǎn)為 3.0-3.5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方格星蟲纖溶酶，其特征在于:所述方格星蟲纖溶酶，為具有如下I)或2)特征的纖溶酶:1)其分子量為24917Da ；2)等電點(diǎn)為3.211。
3.一種制備權(quán)利要求1或2所述方格星蟲纖溶酶的方法，包括如下步驟: 1)將離體的方格星蟲內(nèi)臟依次進(jìn)行勻漿、鹽析，收集鹽析產(chǎn)物； 2)將所述鹽析產(chǎn)物依次經(jīng)離子交換柱層析和凝膠柱層析，得到方格星蟲纖溶酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述離子交換柱層析為陰離子交換柱層析； 所述陰離子交換柱層析為將所述鹽析產(chǎn)物流經(jīng)陰離子交換柱，用含0.1-1M NaCl的濃度為0.02M、pH值為7.8的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，檢測(cè)陰離子交換柱洗脫產(chǎn)物活性，收集具有活性的陰離子交換柱層析洗脫產(chǎn)物；所述線性洗脫的時(shí)間為20h，所述線性洗脫的流速為0.5mL/min ； 所述凝膠柱層析為將所述陰離子交換柱洗脫產(chǎn)物流經(jīng)葡聚糖凝膠柱，用濃度為0.02M、PH值為7.5的PBS緩沖液洗脫，檢測(cè)葡聚糖凝膠柱洗脫產(chǎn)物活性，收集具有活性的凝膠柱層析洗脫產(chǎn)物；所述洗脫的時(shí)間為6h，所述洗脫的流速為lmL/min ； 所述檢測(cè)洗脫產(chǎn)物活性采用的方法具體為纖維素蛋白平板檢測(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，包括如下步驟: 所述陰離子交換柱為DEAE-Sepharose FF ； 所述葡聚糖凝膠柱為Sephadex G_50。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于: 步驟2)中，在所述離子交換柱層析步驟前，還包括將所述鹽析產(chǎn)物透析除鹽的步驟；在所述陰離子交換柱層析中，在所述檢測(cè)陰離子交換柱洗脫產(chǎn)物活性的步驟前還包括:將線性梯度洗脫的產(chǎn)物透析除鹽的步驟； 在所述凝膠柱層析中，在收集具有活性的凝膠柱層析洗脫產(chǎn)物的步驟后還包括:將所述具有活性的凝膠柱層析洗脫產(chǎn)物透析除鹽、干燥，得到方格星蟲纖溶酶的步驟； 所述透析具體采用截留分子量為IOkDa的透析袋。
7.根據(jù)權(quán)利要求3— 6中任一所述的方法,其特征在于: 步驟I )，所述勻漿為將所述方格星蟲的內(nèi)臟與PH為7.5、濃度為0.02mol/L的磷酸緩沖液混勻后勻漿，離心收集上清液A ； 所述鹽析包括如下步驟: A、向所述上清液A加入硫酸銨至質(zhì)量百分含量為30%，混勻、靜置、離心收集上清液B; B、向所述上清液B中加入硫酸銨至質(zhì)量百分含量為70%，混勻、靜置、離心，收集沉淀，得到鹽析產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于: 所述方格星蟲的內(nèi)臟與所述磷酸緩沖液的配比為250g:1L ； 所述勻漿在0-4°C條件下進(jìn)行；所述勻漿具體在0°C條件下進(jìn)行； 所述靜置均為4-10°C靜置2-8h,所述靜置均具體為4°C靜置2h ； 所述離心均為在4-10°C、離心力為4000-8000g下離心10_30min ;所述離心均具體為在4°C、離心力為5000g下離心l0min。
9.由權(quán)利要求3-8任一所述的方法制備得到的方格星蟲纖溶酶:所述方格星蟲纖溶酶分子量具體為24917Da、等電點(diǎn)具體為3.211。
10.權(quán)利要求1或2或9所述的方格星蟲纖溶酶在降解纖維蛋白原中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小分子量方格星蟲纖溶酶及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種方格星蟲纖溶酶的制備方法，包括如下步驟1)將方格星蟲的內(nèi)臟與磷酸緩沖液混勻后勻漿，離心收集上清液A；2)向所述上清液A加入硫酸銨進(jìn)行鹽析，收集沉淀，即得到小分子方格星蟲纖溶酶。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的方法為從方格星蟲中提取纖溶酶，且該纖溶酶的分子量為24917Da、等電點(diǎn)為3.211；與目前現(xiàn)有的纖溶酶相比，分子量小，更易于合成相關(guān)藥物。
文檔編號(hào)A61K38/48GK103205411SQ201310142498
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月23日
發(fā)明者林祥志, 馬伏寧, 林汝榕, 陳水波, 楊善軍, 王昭凱, 馬勇, 柯秀蓉, 李惠麗 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所