專利名稱：一種鏈霉菌產(chǎn)生的新型纖溶酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從土壤鏈霉菌(Streptomyces sp.)Y405的發(fā)酵液中分離純化到具有纖溶活性的新型蛋白酶SW-1。
溶栓療法是近年來廣泛用于臨床的一種治療心腦血管血栓栓塞性疾病的有效方法。目前溶栓藥物有兩大類，一類是纖溶酶原的激活劑，可激活纖溶系統(tǒng)中無活性的纖溶酶原，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榭山到庋獕K中纖維蛋白的纖溶酶，從而發(fā)揮其溶栓作用，已應(yīng)用到臨床的有鏈激酶、尿激酶、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)等；另一類是可直接降解纖維蛋白的蛋白酶類藥物，如蚯蚓纖溶酶、蛇毒抗栓酶和去栓酶等。當前溶栓藥物的問題是來源困難，如尿激酶、組織型纖溶酶原激活劑，因此價格昂貴；纖溶特異性不強或難以工業(yè)化生產(chǎn)，如蚯蚓纖溶酶、蛇毒抗栓酶和去栓酶；以及療效不理想或有出血性副作用等。鏈霉菌來源的纖溶酶，以前未見報道。
本發(fā)明的目的在于從鏈霉菌中尋找一種新型纖溶酶以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。
本發(fā)明的內(nèi)容與要點一.SW-1的發(fā)酵鏈霉菌Y405來源于云南地區(qū)土壤(保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC NO.0305)，在合成V號斜面培養(yǎng)基(KNO30.1-0.3％，NaCl 0.01-0.05％，K2HPO40.01-0.05％，F(xiàn)eSO40.0005-0.002％，MgSO40.01-0.05％，可溶性淀粉1.0-3.0％，洋菜1.2-2.0％，pH 6.5-7.5)上25-28℃培養(yǎng)7-14天，將該菌接種于培養(yǎng)基(葡萄糖1.0-2.5％，可溶性淀粉0.5-2.0％，黃豆餅粉1.0-3.0％，NaCl 0.4％，CaCO30.3-1.0％)28℃，培養(yǎng)2天，轉(zhuǎn)種于同一培養(yǎng)基，28℃，培養(yǎng)96-120小時，得到發(fā)酵液。二.SW-1的分離與純化鏈霉菌Y405的發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨分級鹽析(40-80％飽和度)、290(Cl-)樹脂脫色、Sephadex G75凝膠過濾、DEAE Sephadex A25陰離子交換層析(0-1.0mol/LNaCl線性梯度洗脫)和Lysine Sepharose4B親和層析(0-0.5mol/L NaCl線性梯度洗脫)，獲得鏈霉菌纖溶酶SW-1。純化流程如下頁所示，純度達HPLC 83.5％。三.SW-1纖溶酶的組成及性質(zhì)從SW-1鹽酸水解產(chǎn)物中檢測到15種氨基酸，其中天冬酰胺和谷氨酰胺脫氨轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼岷凸劝彼?。由各組分的摩爾數(shù)(nmol)計算各種氨基酸的相對百分含量，進而推算出SW-1分子中所測得15種氨基酸的殘基數(shù)，總計262個氨基酸殘基(表1)。
SW-1 N-末端17個氨基酸殘基的序列為Arg/Asn/Phe-Pro/Asp-Gly-Met-Thr-Met-Thr-Ala-Ile-Ala-Asn-Gln-Asn-Thr-Gln-Ile-Asn其中N-末端第一殘基測得有精氨酸、天冬酰胺和苯丙氨酸三種氨基酸，第二殘基有脯氨酸和天冬氨酸兩種氨基酸，因此推斷存在N-端序列的不均一性。
SW-1的分子量為30kDa，等電點為8.5，纖溶活性在4-37℃和pH4.0-9.0穩(wěn)定，最適pH為8.0。SW-1的纖溶活性可被10mmol/LPMSF、1mmol/L EDTA和1mol/L賴氨酸完全抑制，表明SW-1是一種絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶，其賴氨酸結(jié)合位點與活性有關(guān)。四.SW-1的溶栓作用SW-1在纖維蛋白平板(含0.5-1.0％瓊脂糖，0.2-0.5mg/ml纖維蛋白原和0.1-0.5u/ml凝血酶)，經(jīng)37℃保溫16小時，顯示纖溶活性。在大鼠腹腔靜脈血栓模型中SW-1對血栓具有極顯著的溶解效果(p＜0.001)，其溶栓活性與尿激酶相當(表2)。
對大鼠血漿中多種纖溶系統(tǒng)因子的檢測顯示，SW-1能促進大鼠血漿中t-PA的活性(圖1)，表明SW-1可促進內(nèi)源性t-PA的產(chǎn)生，進而激活系統(tǒng)內(nèi)纖溶酶原，產(chǎn)生內(nèi)源性纖溶酶。SW-1和內(nèi)源性纖溶酶的共同作用使大鼠血漿中纖溶酶(plasmin)及α2-纖溶酶抑制劑(α2-PI)活性明顯提高(圖2，3)。血栓中纖維蛋白的降解使血漿中D-二聚體(D-dimer)含量升高(圖4)。這些生化指標初步反映SW-1的溶栓機理。鏈霉菌Y405發(fā)酵液↓3,000r/min離心上清液↓(NH4)2SO4分級鹽析40-80％飽和度沉淀↓290陰離子交換樹脂脫色(1.8×30cm)，洗脫液無離子水脫色液↓透析脫鹽，冷凍干燥粗品↓Sephadex G75凝膠過濾(2.6×52cm)，洗脫液20mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，0.1mol/L NaCl活性洗脫液↓透析脫鹽，冷凍干燥濃縮液↓DEAE Sephadex A25陰離子交換層析(1.4×21cm)，洗脫液20mmol/L Tris-HCl(pH9.0)0-1.0mol/L NaCl線性梯度活性洗脫液↓透析脫鹽，冷凍干燥濃縮液↓Lysine Sepharose 4B親和層析(0.8×25cm)洗脫液20mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，0-0.5mol/L NaCl線性梯度活性洗脫液↓透析脫鹽，冷凍干燥SW-1純品表1 SW-1氨基酸組成分析氨基酸納摩爾納克 相對含量氨基酸殘基數(shù)(％) 實驗值 理論值A(chǔ)sp 1.580 210.49.2 23.924Thr 1.468 174.98.5 22.222Ser 2.192 230.412.7 33.233Glu 1.428 210.18.3 21.622Gly 3.078 231.117.9 46.647Ala 1.168 104.16.8 17.718Val 0.787 92.2 4.6 11.912Ile 0.844 110.74.9 12.813Leu 0.894 117.25.2 13.514Tyr 0.286 51.9 1.7 4.3 4Phe 0.450 74.3 2.6 6.8 7Lys 1.721 251.610.0 26.126His 0.338 52.4 2.0 5.1 5Arg 0.309 53.9 1.8 4.7 5Pro 0.651 74.9 3.8 9.9 10Total 17.1942308.1 100 - 262
表2 SW-1對大鼠靜脈血栓的溶解作用樣品 大鼠數(shù) 劑量 栓重(u/kg)mg生理鹽水 7 0.4ml 7.45±1.16尿激酶7 4000 3.94±0.83SW-1 6 4000 3.06±0.74五.SW-1的基因克隆根據(jù)SW-1N-端第3-17氨基酸殘基序列，設(shè)計如下45聚寡核苷酸序列5’-GGC/G*ATG ACC/G ATG ACC/G GCC/G ATCGCC/G AAC CAG AAC ACC/G CAG ATC AAC-3’*根據(jù)氨基酸密碼子簡并性，設(shè)計兩種可能性，由DNA合成儀自動合成兩種堿基。用γ-32P-ATP標記寡核苷酸作為探針。用限制性內(nèi)切酶Sau3AI將SW-1產(chǎn)生菌Y405總DNA進行部分酶切后與質(zhì)粒載體pWHM3(來源于美國Wisconsin大學，C.R.Hutchinson教授，發(fā)表在J.Bact.1989，1715872-5881)的BamHI酶切片段相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(本實驗室保存，發(fā)表在J.Mol.Biol.1983，166557-580)，以此建立了SW-1產(chǎn)生菌部分基因文庫。用標記的寡核苷酸探針與部分基因文庫進行菌落雜交，得到pJW3陽性克隆。將pJW3 DNA轉(zhuǎn)化變鉛青鏈霉菌TK24(來源于英國D.A.Hopwood教授，發(fā)表在Genetic Manipulation ofStreptomyces，A Laboratory Manual，1985，p.266)原生質(zhì)體。原生質(zhì)體的制備按下述方法進行首先將變鉛青鏈霉菌菌種挖塊接種至3ml下述培養(yǎng)基(蔗糖10.3％，K2SO40.025％，MgCl2·6H2O 1.012％，葡萄糖1.0％，胰胨0.1-0.3％，酪蛋白氨基酸0.05-0.3％，蛋白胨0.2-0.4％，酵母浸出物0.2-0.5％，0.1-0.7％K2HPO410ml/L，3.0-5.0％CaCl2·2H2O 80ml/L，三羥甲基氨基甲烷0.1-0.3mol/L(pH6-8)100ml/L，微量元素溶液(ZnCl20.004％，F(xiàn)eCl2·6H2O 0.02％，CuCl2·2H2O 0.001％，MnCl2·4H2O 0.001％，NaB4O7·10H2O0.001％，(NH4)6Mo7O2·4H2O 0.001％)2ml/L，0.5-2mol/L NaOH2-10ml/L)中，27-32℃培養(yǎng)2-4天，轉(zhuǎn)種至裝量為30-50ml/250ml三角瓶上述同樣培養(yǎng)基中，并加入0.1-1％的甘氨酸，在同樣條件下培養(yǎng)16-36小時，收集菌體，再用10.3％蔗糖溶液洗滌菌體2-3次，在含溶菌酶0.5-3mg/ml的P溶液(三羥甲基氨基甲烷0.25-0.4％，CaCl2·2H2O 0.25-0.4％，MgCl2·6H2O 0.1-0.3％，蔗糖10.3％，葡萄糖0.1％，pH7.0-8.0)中，28-38℃條件下溶菌15-60分鐘，獲得原生質(zhì)體。pJW3 DNA在濃度為15-50％的PEG媒介下轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，獲得轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子在含10-50μg/ml硫鏈絲菌素的上述固體培養(yǎng)基上，27-32℃培養(yǎng)3-6天，挖塊置于纖維蛋白平板，37℃保溫16小時，可檢測到纖溶活性，表明pJW3 DNA編碼的纖溶酶活性在變鉛青鏈霉菌TK24中初步得到表達。


圖1 SW-1對大鼠血漿中t-PA活性的影響圖2 SW-1對大鼠血漿中plasmin活性的影響圖3 SW-1對大鼠血漿中α2-PI活性的影響圖4 SW-1對大鼠血漿中D-dimer含量的影響
權(quán)利要求
1.一種鏈霉菌產(chǎn)生的新型纖溶酶SW-1，其特征包括以下步驟A.對產(chǎn)生菌鏈霉菌Y405進行斜面、種子、發(fā)酵三級培養(yǎng)，B.從鏈霉菌Y405的發(fā)酵液中進行分離與純化，C.測定氨基酸組成、N-末端17個氨基酸殘基序列、分子量、等電點、溫度和pH穩(wěn)定性及活性抑制劑等特點，D.利用纖維蛋白平板及大鼠腹腔靜脈血栓模型，測定在體內(nèi)外的纖溶活性，E.克隆編碼SW-1的基因，使之在變鉛青鏈霉菌中得到表達。
2.如權(quán)利要求1所述的一種鏈霉菌產(chǎn)生的新型纖溶酶SW-1，其特征是將鏈霉菌Y405在合成V號斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)葡萄糖-黃豆餅粉培養(yǎng)基培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。
3.如權(quán)利要求1所述的一種鏈霉菌產(chǎn)生的新型纖溶酶SW-1，其特征是將鏈霉菌Y405的發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨分級鹽析、290樹脂脫色、Sephadex G75凝膠過濾、DEAE Sephadex A25陰離子交換層析和Lysine Sepharose 4B親和層析，獲得HPLC純度為83.5％的纖溶酶SW-1，其鹽酸水解產(chǎn)物氨基酸組成為以下15種天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和脯氨酸，其N-末端17個氨基酸殘基的序列為Arg/Asn/Phe-Pro/Asp-Gly-Met-Thr-Met-Thr-Ala-Ile-Ala-Asn-Gln-Asn-Thr-Gln-Ile-Asn，其分子量為30kDa，等電點為8.5。纖溶活性在4-37℃和pH4.0-9.0穩(wěn)定，最適pH為8.0，其纖溶活性可被10mmol/LPMSF、1mmol/LEDTA和1mol/L賴氨酸完全抑制。
4.如權(quán)利要求1所述的一種鏈霉菌產(chǎn)生的新型纖溶酶SW-1，其特征是SW-1在纖維蛋白平板上顯示纖溶活性，對大鼠腹腔靜脈血栓具有極顯著溶解作用，還可促進大鼠血漿中t-PA的活性，進而激活系統(tǒng)內(nèi)纖溶酶原，產(chǎn)生內(nèi)源性纖溶酶，使大鼠血漿中纖溶酶(plasmin)及α2-纖溶酶抑制劑(α2-PI)活性明顯提高。
5.如權(quán)利要求1所述的一種鏈霉菌產(chǎn)生的新型纖溶酶SW-1，其特征是利用SW-1純化蛋白所測定的N-端第3-17氨基酸序列，合成寡核苷酸作為探針，克隆可編碼SW-1的基因，并在變鉛青鏈霉菌中初步得到表達。
全文摘要
本發(fā)明涉及從一株土壤鏈霉菌Y405的發(fā)酵液中分離純化得到的具有纖溶活性的新型蛋白酶sw－1,其分子量為30kDa,等電點為8.5,是一種絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶,利用SW－1純化蛋白所測定的N－端氨基酸序列,合成寡核苷酸作為探針,克隆了可能編碼SW－1的基因,在變鉛青鏈霉菌中初步得到表達,SW－1對大鼠腹腔靜脈血栓有明顯溶解作用,并可促進大鼠血漿中t－PA的活性,進而激活了系統(tǒng)內(nèi)纖溶酶原,產(chǎn)生內(nèi)源性纖溶酶,鏈霉菌Y405的培養(yǎng)成熟,從中獲得纖溶酶SW－1簡便易行,成本較低,便于工業(yè)化生產(chǎn),基因克隆技術(shù)的成功為今后SW－1的分子改造奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N9/68GK1174889SQ97112149
公開日1998年3月4日 申請日期1997年6月16日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月16日
發(fā)明者王駿 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所