專(zhuān)利名稱(chēng)：促紅細(xì)胞生成素基因的克隆及其表達(dá)細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種編碼中國(guó)人的EPO基因組DNA，以及將中國(guó)人的促紅細(xì)胞生成素基因轉(zhuǎn)移到BHK細(xì)胞中和能夠生產(chǎn)有生物活性的多肽促紅細(xì)胞生成素的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin.EPO)是由腎臟產(chǎn)生的一種酸性糖蛋白類(lèi)激素，作用于造血干細(xì)胞，促進(jìn)紅細(xì)胞的生成。1985年EPO基因已被克隆，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都進(jìn)行了EPO表達(dá)的研究。所用的材料涉及EPO的cDNA、基因組基因以及EPO基因的PCR產(chǎn)物。表達(dá)載體所用的啟動(dòng)子有SV40及Ad-MLP等。所選用的細(xì)胞系有淋巴母細(xì)胞、CHO dhfr缺陷型細(xì)胞和COS-7細(xì)胞等。表達(dá)量從數(shù)十個(gè)毫單位每毫升細(xì)胞增減液到幾千單位不等。腎臟疾病會(huì)引起促紅細(xì)胞生成素合成不足，從而引起貧血。用基因工程方法從培養(yǎng)的細(xì)胞系中生產(chǎn)的重組的促紅細(xì)胞生成素，可以用來(lái)治療多種貧血疾病。如慢性腎功能性貧血、癌癥病人放化療后引起的貧血、以及手術(shù)后貧血的恢復(fù)等。經(jīng)臨床證實(shí)其療效確實(shí)可靠，并基本上沒(méi)有副作用因此具有非常好的應(yīng)用前景。關(guān)于促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)國(guó)內(nèi)外已有多項(xiàng)專(zhuān)利申請(qǐng)，內(nèi)容涉及EPO的基因、對(duì)EPO的基因的改造、以及在dhfr缺陷型CHO細(xì)胞表達(dá)EPO的方法等。
本發(fā)明的目的在于提供了一種用于定向篩選目的基因的基因文庫(kù)的構(gòu)建方法，并從這一文庫(kù)中克隆了中國(guó)人EPO的基因組基因以及通過(guò)本發(fā)明構(gòu)建了EPO表達(dá)細(xì)胞系；該細(xì)胞系可以用于生產(chǎn)，提取到有生物活性的促紅細(xì)胞生成素，應(yīng)用于臨床，治療各種貧血疾病。建立了利用非dhfr缺陷型細(xì)胞表達(dá)EPO基因的方法，可解決生產(chǎn)上缺陷型細(xì)胞較難培養(yǎng)的困難。
本發(fā)明的內(nèi)容1 構(gòu)建了基因組不完全文庫(kù)，進(jìn)行定向篩選，使EPO基因在文庫(kù)中得以富集，順利的獲得了包括5′-調(diào)控成分及3′-側(cè)翼序列12.5Kb長(zhǎng)的中國(guó)人EPO基因組基因。見(jiàn)

圖1。在EPO基因的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)核苷酸的差異，在第90位的核苷酸處有一個(gè)G的缺失，在第一個(gè)內(nèi)含子666位的核苷酸處有一個(gè)C的插入。其序列詳見(jiàn)表1。這兩個(gè)核苷酸的差異改變了5′-調(diào)控區(qū)的ORF。表2列舉了這4個(gè)ORF。
2 構(gòu)建了在非dhfr缺陷型細(xì)胞中表達(dá)的EPO表達(dá)載體。
(1)將2.4Kb的EPO基因編碼區(qū)插入到質(zhì)粒pRSV/CAT中，構(gòu)建了G418抗性的表達(dá)載體pRSV/EPO。這一載體帶有RSV-LTR的啟動(dòng)子及SV40的一個(gè)內(nèi)含子，可進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
(2)為了能在BHK細(xì)胞中進(jìn)行加壓培養(yǎng)，構(gòu)建了帶有潮霉素-B抗性基因和二氫葉酸還原酶基因(dhfr)的表達(dá)載體pHY/dhfr。通過(guò)與pRSV/EPO共轉(zhuǎn)染，經(jīng)潮霉素-B和G418雙抗性篩選，可獲得既表達(dá)EPO又表達(dá)dhfr的細(xì)胞株，在MTX的壓力下可提高EPO的表達(dá)量。
3 EPO高效穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的克隆。
用表達(dá)載體pRSV/EPO經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選，獲得了表達(dá)量為180單位/106細(xì)胞的克隆B8細(xì)胞株。對(duì)該細(xì)胞株進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)染，將pHY/dhfr質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，經(jīng)潮霉素-B篩選后，在MXT壓力下，獲得了表達(dá)量為1600單位/106細(xì)胞的克隆B812細(xì)胞株，該細(xì)胞株已經(jīng)保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，登記注冊(cè)編號(hào)為CGMCC NO.0306。這一細(xì)胞株經(jīng)高密度培養(yǎng)，可獲得超過(guò)20000單位/毫升的產(chǎn)量。即可以從每升細(xì)胞培養(yǎng)液中得到超過(guò)200毫克的名義產(chǎn)量。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1 克隆了中國(guó)人EPO基因，用基因組基因做表達(dá)比cDNA的表達(dá)量高。
2 構(gòu)建的表達(dá)載體pRSV/EPO是在充分考慮了EPO基因的轉(zhuǎn)錄起始效率、內(nèi)含子的拼接、5′-非翻譯區(qū)和3′-非翻譯區(qū)對(duì)表達(dá)效率的影響等因素，為高效表達(dá)提供了基礎(chǔ)。
3 設(shè)計(jì)了pHY/dhfr表達(dá)載體，為在非dhfr陰性細(xì)胞中用MTX加壓培養(yǎng)提供了基礎(chǔ)。
4 獲得了高效表達(dá)細(xì)胞株，表達(dá)量為1600單位/106細(xì)胞，在高密度培養(yǎng)時(shí)可獲得超過(guò)200mg/升的產(chǎn)量。
用下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
1 不完全文庫(kù)的構(gòu)建從一個(gè)中國(guó)人提供的血液中分離白細(xì)胞，提取基因組DNA，片斷長(zhǎng)度控制在100Kb以上，用BamHI進(jìn)行完全酶切，回收10.5Kb的片斷，純化后，與入-EMBL3的BamHI臂相連接，用包裝提取物進(jìn)行體外包裝，構(gòu)建了中國(guó)人基因組不完全基因文庫(kù)。文庫(kù)效價(jià)為3×105從這人基因文庫(kù)中可以定向篩選EPO基因。由于用BamHI對(duì)基因組DNA進(jìn)行完全酶切，可以使EPO基因在文庫(kù)中得以富集。
2 表達(dá)載體的構(gòu)建質(zhì)粒pRSV/CAT(購(gòu)于Stratagene公司)，經(jīng)Not I酶切去掉CAT基因，將EPO基因的2.4Kb片斷與載體進(jìn)行平端連接。連接反應(yīng)條件載體與外源片斷的摩爾比為1∶10，16℃連接過(guò)夜，取5μl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α受體菌，用原位雜交的方法篩選陽(yáng)性菌落，獲重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定方向及系列酶切分析，獲得了重組的表達(dá)載體pRSV/CAT。選取帶有dhfr基因的質(zhì)粒pMT010/A+與帶有潮霉素-B抗性基因的質(zhì)粒p3′SS(購(gòu)于Srtatagene公司)組建了表達(dá)載體pHY/dhfr。p3′SS用Bg1II和EcoR V雙酶切，去掉1694的片斷，pMT010/A+經(jīng)Sal I酶切后用TDNA聚合酶于12℃20分鐘補(bǔ)平，再用BgII切下900bp的dhfr基因，將dhfr基因與p3′SS的大片斷以平-粘端的方式相連接，獲重組質(zhì)粒pHY/dhfr。
3 EPO高效穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的克隆對(duì)培養(yǎng)的BHK細(xì)胞用脂質(zhì)體(Lipofectin)方法轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pRSV/EPO，DNA的量為5μg，脂質(zhì)體為20μl，加無(wú)血清MEM2ml，37℃6小時(shí)，換正常培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度為30％，48小時(shí)后按1∶5的比例分細(xì)胞，用400mg/ml的G418篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆，獲得了表達(dá)量為180單位/106細(xì)胞的克隆B8細(xì)胞株。用pHY/dhfr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B8細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同前，經(jīng)200mg/ml潮霉素-B篩選后，在MXT壓力下，獲得了表達(dá)量為1600單位/106細(xì)胞的克隆--B812細(xì)胞株。在高密度培養(yǎng)條件下，可獲得超過(guò)200mg/升的產(chǎn)量。細(xì)胞系的培養(yǎng)條件37℃，5％的CO2濃度，細(xì)胞培養(yǎng)液為MEM培養(yǎng)液，10％的新生牛血清。高密度培養(yǎng)時(shí)使用無(wú)血清培養(yǎng)液。
圖表說(shuō)明表1中國(guó)人EPO基因全序列。
表2EPO基因的前4個(gè)ORF(小的開(kāi)放閱讀框)。
圖1含有全長(zhǎng)中國(guó)人EPO基因的克隆--λ-811的酶切圖譜。
(1)左臂(2)右臂(3)EPO基因及其5′和3′側(cè)翼(4)EPO基因圖2EPO表達(dá)載體pRSV/EPO的圖譜G418新霉素抗性基因RSV-LTRRSV的啟動(dòng)子intronSV40的內(nèi)含子EPOEPO基因Amp氨芐青霉素抗性基因pASV40的多聚A區(qū)圖3潮霉素-B抗性質(zhì)粒pHY/dhfr的圖譜dhfr二氫葉酸還原酶基因pSV40SV40的啟動(dòng)子pTKTK基因的啟動(dòng)子Hygromyc in潮霉素-B抗性基因TKpATK基因的多聚A區(qū)Amp氨芐青霉素抗性基因。
表1中國(guó)人EPO基因全序列。

示EPO基因的5個(gè)ORF
示EPO的編碼序列g(shù)g ccc 示本基因與Lin FK的序列差異表2EPO基因的前4個(gè)ORF(小的開(kāi)放閱讀框)ORP1 80 ATG CCC CCC AGG GAA GTG TCC GGG AGC CCA GCC TTT CCC AGATAG(14aa)ORF2 201 ATG ACC CAC ACG CAC GTC TGC ACC CCC GCT CAC GCC GCG AGCCTC AAC CCA GGC GTC CTG CCC CYG CYC TGA(25aa)ORF3 293 ATG CAG ATA……AAA CCT GAC CTG TGA(163aa)ORF4 557 ATG AGG GCC CCC GGT GTG GTC ACC CGG CGC GCC CCA GGT CGCTGA (14aa)
權(quán)利要求
1.編碼中國(guó)人的EPO基因組DNA，包括完整的編碼區(qū)及5′和3′側(cè)翼，在第90位的核苷酸處有一個(gè)G的缺失，在第一個(gè)內(nèi)含子666位的核苷酸處有一個(gè)C的插入，這兩個(gè)核苷酸的改變?cè)?′調(diào)控區(qū)形成了4個(gè)以ATG起始的小開(kāi)放閱讀框架，該DNA的全序列如表1。
2.一種表達(dá)載體，它是由EPO基因的2.4Kb的編碼區(qū)構(gòu)建的如附圖2所示的載體pRSV/EPO，它含有一個(gè)內(nèi)含子，可以進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征是如附圖3所示的載體pHY/dhfr，是利用了B生基因進(jìn)行篩選，與EPO表達(dá)載體pRSV/EPO共同使用，在非dhfr缺陷型細(xì)胞中表達(dá)EPO，并能通過(guò)MTX進(jìn)行加壓培養(yǎng)。
4.一種利用人的基因組DNA序列、構(gòu)建表達(dá)載體、轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞系而能生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的細(xì)胞株，其特征在于該細(xì)胞是B812，保藏號(hào)為CGMCCNO.0306。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能夠生產(chǎn)有生物活性的多肽促紅細(xì)胞生成素的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。利用基因工程技術(shù)從中國(guó)人白細(xì)胞中提取DNA，構(gòu)建了基因文庫(kù)，克隆了促紅細(xì)胞生成素基因，通過(guò)特異的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，獲得了穩(wěn)定高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的細(xì)胞克隆。本發(fā)明具有利用非dhfr缺陷型細(xì)胞生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/85GK1168414SQ9711206
公開(kāi)日1997年12月24日 申請(qǐng)日期1997年5月16日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月16日
發(fā)明者崔振中, 劉朋朋, 齊順章, 沈恒, 陸廷夷, 張希 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科大學(xué)