本發(fā)明涉及魚鱗膠原蛋白水凝膠及其制備方法與應(yīng)用，屬于生物材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：膠原蛋白具有獨(dú)特的三螺旋結(jié)構(gòu)、低抗原性、無毒性、良好的生物相容性和生物可降解性等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品及飼料等領(lǐng)域。在膠原蛋白的應(yīng)用中，膠原蛋白水凝膠是一種重要的應(yīng)用形式，例如在化妝品領(lǐng)域中，可利用膠原蛋白水凝膠制成保濕護(hù)膚品；在生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域中，可將膠原蛋白水凝膠作為藥物緩釋材料或外用敷料(如眼科疾病敷料)等。因此，如何制備膠原蛋白水凝膠是需解決的技術(shù)問題之一。劉克海，董玲等公開了一種膠原蛋白凝膠的制備方法(膠原蛋白凝膠的制備及其中藥物體外擴(kuò)散性考察，中國藥房，2011第22卷第13期，1189-1190)，其是先以魚鱗為原材料，采用胃蛋白酶為試劑提取得到膠原蛋白沉淀，然后將適量的所得膠原蛋白沉淀加入至檸檬酸溶液、甘油(丙二醇)及乙醇(異丙醇)三元體系中形成膠原蛋白凝膠。該膠原蛋白水凝膠制備方法相對復(fù)雜，需要先采用特定工藝制得膠原蛋白沉淀，然后采用復(fù)雜的三元體系才能獲得膠原蛋白水凝膠，其制備成本高，操作步驟多。CN104031274A公開了一種水產(chǎn)魚皮膠原蛋白凝膠的制備方法，其是以水產(chǎn)魚皮膠原蛋白為原料，先將該原料在4℃下溶解在醋酸中，隨后調(diào)節(jié)pH，然后將調(diào)節(jié)pH的膠原上清液混合液置于模具中，在30～40℃水浴靜置1～2h，使其充分自聚凝固成型，最后將成型后的水凝膠置于超純水中浸泡得到水產(chǎn)魚皮膠原蛋白凝膠。該膠原蛋白水凝膠制備方法同樣是以制備好的水產(chǎn)魚皮膠原蛋白為原料，工藝復(fù)雜，制備成本高，操作步驟多。由上可知，上述方法均是先制得膠原蛋白，然后再將所得膠原蛋白制成其水凝膠，采用這些工藝制備膠原蛋白水凝膠工藝復(fù)雜，制備成本高，操作步驟多。魚鱗是繼豬皮、牛皮等后重要的提取膠原蛋白的原材料，現(xiàn)有技術(shù)有大量的從魚鱗中提取膠原蛋白的報道，例如CN103570827A及CN103172729A等，但對于如何從 魚鱗直接制備膠原蛋白水凝膠卻未有報道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供一種魚鱗膠原蛋白水凝膠的制備方法，所述方法可從魚鱗中直接制備得到魚鱗膠原蛋白水凝膠，工藝簡單，制備成本低。本發(fā)明的另一目的在于提供由所述方法得到的魚鱗膠原蛋白水凝膠。本發(fā)明的再一目的在于提供所述魚鱗膠原蛋白水凝膠的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種魚鱗膠原蛋白水凝膠的制備方法，所述方法包括如下步驟：(a)采用無機(jī)酸性水溶液對魚鱗進(jìn)行酸處理，分離得酸處理濾渣，優(yōu)選地，所述魚鱗為由風(fēng)干后的魚鱗磨粉得到的干魚鱗粉；(b)采用含鹽水溶液對步驟(a)所得酸處理濾渣進(jìn)行鹽處理，分離得鹽處理濾渣；(c)采用有機(jī)酸性水溶液對步驟(b)所得鹽處理濾渣進(jìn)行提取，分離得酸解粗提液；(d)在步驟(c)所得酸解粗提液中加入鹽進(jìn)行鹽析，分離得魚鱗膠原蛋白沉淀；(e)將步驟(d)所得魚鱗膠原蛋白沉淀進(jìn)行攪拌透析直接得魚鱗膠原蛋白水凝膠；其中，所述的攪拌透析是將魚鱗膠原蛋白沉淀進(jìn)行透析的同時進(jìn)行攪拌；優(yōu)選地，攪拌的速率為1000～2000rpm。本發(fā)明通過對魚鱗依次進(jìn)行酸處理、鹽處理、酸提取、鹽析及攪拌透析可從魚鱗原料直接制備得到魚鱗膠原蛋白水凝膠，相比于現(xiàn)有技術(shù)制備膠原蛋白水凝膠的方法，其制備方法簡單，操作步驟少，成本低。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在本發(fā)明所述步驟(a)中，所述酸處理是在魚鱗中加入0.1～0.5mol/L的鹽酸進(jìn)行攪拌處理，優(yōu)選在22～28℃下攪拌4～24h；優(yōu)選地，所述魚鱗與所述鹽酸的固液比為1g:10mL～1g:30mL。一般地，步驟(a)中所述的分離得酸處理濾渣可通過常見的分離方式實(shí)現(xiàn)，例如過濾、離心等。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在本發(fā)明所述步驟(b)中，所述鹽處理是在步驟 (a)所得酸處理濾渣中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％～5％的氯化鈉水溶液進(jìn)行攪拌處理，優(yōu)選在22～28℃下攪拌6～48h；優(yōu)選地，所述酸處理濾渣與所述氯化鈉水溶液的固液比為1g:20mL～1g:50mL。一般地，步驟(b)中所述的分離得鹽處理濾渣可通過常見的分離方式實(shí)現(xiàn)，例如過濾、離心等。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明所述步驟(c)是在步驟(b)所得鹽處理濾渣中加入0.1～1.0mol/L乙酸水溶液進(jìn)行攪拌處理，優(yōu)選在22～28℃下攪拌24～48h；優(yōu)選地，所述鹽處理濾渣與所述乙酸水溶液的固液比為1g:10mL～1g:30mL。一般地，步驟(c)中所述的分離得酸解粗提液可通過常見的分離方式實(shí)現(xiàn)，如過濾、離心等，例如可將酸提取后的混合液在約10000r/min下離心20～40分鐘，收集上清液，然后再將上清液抽濾得到更清澈的酸解粗提液。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在本發(fā)明所述步驟(d)中，所述鹽析是在步驟(c)中所得酸解粗提液中加入氯化鈉進(jìn)行鹽析，優(yōu)選鹽析12～36h；優(yōu)選地，使加入的氯化鈉在酸解粗提液中的濃度為0.5～1.2mol/L，更優(yōu)選0.9～1.1mol/L。通過將加入的氯化鈉限定在0.9～1.1mol/L的范圍內(nèi)，可在不增加鹽雜質(zhì)的前提下，顯著提高魚鱗膠原蛋白提取率，提取率可達(dá)約75％以上。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在本發(fā)明所述步驟(e)中，所述透析采用截留分子量為2000～8000的透析膜，優(yōu)選在22～28℃下攪拌透析2～4天。另一方面，本發(fā)明提供一種I型魚鱗膠原蛋白水凝膠，其是根據(jù)本發(fā)明所述的方法制備得到的；優(yōu)選地，所述I型魚鱗膠原蛋白水凝膠中所述膠原蛋白的純度為80％～90％。再一方面，本發(fā)明提供所述I型膠原蛋白水凝膠在制備護(hù)膚品中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述護(hù)膚品為保濕性護(hù)膚品。又一方面，本發(fā)明提供所述I型膠原蛋白水凝膠在制備藥物緩釋材料或外用輔料中的應(yīng)用。綜上可知，本發(fā)明提供的魚鱗膠原蛋白水凝膠的制備方法可從魚鱗中直接制備得到魚鱗膠原蛋白水凝膠，制備方法簡單，操作步驟少，成本低。附圖說明圖1為實(shí)施例1所得魚鱗膠原蛋白水凝膠的紫外圖譜；圖2為實(shí)施例1所得魚鱗膠原蛋白水凝膠的紅外圖譜。具體實(shí)施方式為了對本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)對本發(fā)明的技術(shù)方案及附圖進(jìn)行以下詳細(xì)說明，但不能理解為對本發(fā)明的可實(shí)施范圍的限定。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例1(a)在魚鱗中加入0.2mol/L的鹽酸，在24℃下攪拌6h，過濾得酸處理濾渣；所述魚鱗與所述鹽酸的固液比1g:10mL；(b)在所得酸處理濾渣中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的氯化鈉水溶液，24℃下攪拌8h，過濾得鹽處理濾渣，所述酸處理濾渣與所述氯化鈉水溶液的固液比1g:20mL；(c)在所得鹽處理濾渣中加入0.2mol/L乙酸水溶液，在24℃下攪拌24h，在約10000r/min下離心20～40分鐘，收集上清液，然后再將上清液抽濾得到更清澈的酸解粗提液；所述鹽處理濾渣與所述乙酸水溶液的固液比為1g:10mL；(d)在所得酸解粗提液中加入氯化鈉進(jìn)行鹽析12h，使加入的氯化鈉在酸解粗提液中的濃度為0.9mol/L；(e)在所得魚鱗膠原蛋白沉淀在攪拌(攪拌的速率為1000rpm)的同時進(jìn)行透析，所述透析采用截留分子量為2000的透析膜，所述攪拌優(yōu)選在24℃下透析2天，直接制得魚鱗膠原蛋白水凝膠。本實(shí)施例魚鱗膠原蛋白的提取率為74.32％，純度為82.13％。將實(shí)施例1所得魚鱗膠原蛋白水凝膠成品，配置成1mg/mL的水溶液，在紫外-可見分光光度計(Lambda750)上進(jìn)行掃描，掃描波長為200～400nm，所得結(jié)果如圖1所示，從圖1中可以看出實(shí)施例1所得水凝膠成品的最大吸收峰均出現(xiàn)在219nm處，為Ⅰ型膠原的特征吸收峰。取實(shí)施例1所得微量魚鱗膠原蛋白水凝膠成品，于105℃干燥烘箱內(nèi)烘至絕干，并制成透明薄片，采用傅里葉紅外光譜(BRUKERVERTEX70)進(jìn)行掃描，掃描范 圍為4000～500cm-1，結(jié)果如圖2所示，從圖2中可看出其三螺旋結(jié)構(gòu)的存在。從圖1～圖2可以證明本實(shí)施例所得魚鱗膠原蛋白水凝膠為I型膠原蛋白。實(shí)施例2(a)在魚鱗中加入0.3mol/L的鹽酸，在24℃下攪拌12h，過濾得酸處理濾渣；所述魚鱗與所述鹽酸的固液比1g:20mL；(b)在所得酸處理濾渣中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的氯化鈉水溶液，24℃下攪拌8h，過濾得鹽處理濾渣，所述酸處理濾渣與所述氯化鈉水溶液的固液比1g:20mL；(c)在所得鹽處理濾渣中加入0.2mol/L乙酸水溶液，在24℃下攪拌24h，在約10000r/min下離心20～40分鐘，收集上清液，然后再將上清液抽濾得到更清澈的酸解粗提液；所述鹽處理濾渣與所述乙酸水溶液的固液體積比為1g:10mL；(d)在所得酸解粗提液中加入氯化鈉進(jìn)行鹽析12h，使加入的氯化鈉在酸解粗提液中的濃度為0.9mol/L；(e)在所得魚鱗膠原蛋白沉淀在攪拌(攪拌的速率為1200rpm)的同時進(jìn)行透析，所述透析采用截留分子量為2000的透析膜，所述攪拌優(yōu)選在24℃下透析2天，直接制得魚鱗膠原蛋白水凝膠。本實(shí)施例魚鱗膠原蛋白的提取率為79.67％，純度為86.22％。經(jīng)與實(shí)施例1相同的測試，本實(shí)施例所得魚鱗膠原蛋白為I型膠原蛋白。實(shí)施例3(a)在魚鱗中加入0.2mol/L的鹽酸，在24℃下攪拌6h，過濾得酸處理濾渣；所述魚鱗與所述鹽酸的固液比1g:20mL；(b)在所得酸處理濾渣中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的氯化鈉水溶液，24℃下攪拌8h，過濾得鹽處理濾渣，所述酸處理濾渣與所述氯化鈉水溶液的固液比1g:30mL；(c)在所得鹽處理濾渣中加入0.3mol/L乙酸水溶液進(jìn)行攪拌處理，優(yōu)選在24℃下攪拌24h，在約10000r/min下離心20～40分鐘，收集上清液，然后再將上清液抽濾得到更清澈的酸解粗提液；所述鹽處理濾渣與所述乙酸水溶液的固液體積比為1g:20mL；(d)在所得酸解粗提液中加入氯化鈉進(jìn)行鹽析12h，使加入的氯化鈉在酸解粗提液中的濃度為1.0mol/L；(e)在所得魚鱗膠原蛋白沉淀在攪拌(攪拌的速率為1000rpm)的同時進(jìn)行透析，所述透析采用截留分子量為4000的透析膜，所述攪拌優(yōu)選在24℃下透析4天， 直接制得魚鱗膠原蛋白水凝膠。本實(shí)施例魚鱗膠原蛋白的提取率為82.11％，純度為87.58％。經(jīng)與實(shí)施例1相同的測試，本實(shí)施例所得魚鱗膠原蛋白為I型膠原蛋白。實(shí)施例4(a)在魚鱗中加入0.5mol/L的鹽酸，在26℃下攪拌20h，過濾得酸處理濾渣；所述魚鱗與所述鹽酸的固液比1g:20mL；(b)在所得酸處理濾渣中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的氯化鈉水溶液，26℃下攪拌36h，過濾得鹽處理濾渣，所述酸處理濾渣與所述氯化鈉水溶液的固液比1g:40mL；(c)在所得鹽處理濾渣中加入0.9mol/L乙酸水溶液，在26℃下攪拌48h，在約10000r/min下離心20～40分鐘，收集上清液，然后再將上清液抽濾得到更清澈的酸解粗提液；所述鹽處理濾渣與所述乙酸水溶液的固液比為1g:20mL；(d)在所得酸解粗提液中加入氯化鈉進(jìn)行鹽析36h，使加入的氯化鈉在酸解粗提液中的濃度為1.1mol/L；(e)在所得魚鱗膠原蛋白沉淀在攪拌(攪拌的速率為1000rpm)的同時進(jìn)行透析，所述透析采用截留分子量為4000的透析膜，所述攪拌優(yōu)選在24℃下透析2天，直接制得魚鱗膠原蛋白水凝膠。本實(shí)施例魚鱗膠原蛋白的提取率為89.19％。經(jīng)與實(shí)施例1相同的測試，本實(shí)施例所得魚鱗膠原蛋白為I型膠原蛋白。實(shí)施例5(a)在魚鱗中加入0.1mol/L的鹽酸，在24℃下攪拌4h，過濾得酸處理濾渣；所述魚鱗與所述鹽酸的固液比1g:10mL；(b)在所得酸處理濾渣中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的氯化鈉水溶液，24℃下攪拌6，過濾得鹽處理濾渣，所述酸處理濾渣與所述氯化鈉水溶液的固液比1g:10mL；(c)在所得鹽處理濾渣中加入0.1mol/L乙酸水溶液在24℃下攪拌24h，在約10000r/min下離心20～40分鐘，收集上清液，然后再將上清液抽濾得到更清澈的酸解粗提液；所述鹽處理濾渣與所述乙酸水溶液的固液體積比為1g:10mL；(d)在所得酸解粗提液中加入氯化鈉進(jìn)行鹽析12h，使加入的氯化鈉在酸解粗提液中的濃度為0.3mol/L；(e)所得魚鱗膠原蛋白沉淀在攪拌(攪拌的速率為1200rpm)的同時進(jìn)行透析，所述透析采用截留分子量為4000的透析膜，所述攪拌優(yōu)選在24℃下透析4天，直接制得魚鱗膠原蛋白水凝膠。本實(shí)施例魚鱗膠原蛋白的提取率為51.21％，純度為 80.11％。經(jīng)與實(shí)施例1相同的測試，本實(shí)施例所得魚鱗膠原蛋白為I型膠原蛋白。實(shí)施例6(a)在魚鱗中加入0.1mol/L的鹽酸，在24℃下攪拌8h，過濾得酸處理濾渣；所述魚鱗與所述鹽酸的固液比1g:20mL；(b)在所得酸處理濾渣中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的氯化鈉水溶液，24℃下攪拌8h，過濾得鹽處理濾渣，所述酸處理濾渣與所述氯化鈉水溶液的固液比1g:10mL；(c)在所得鹽處理濾渣中加入0.5mol/L乙酸水溶液，在24℃下攪拌24h，在約10000r/min下離心20～40分鐘，收集上清液，然后再將上清液抽濾得到更清澈的酸解粗提液；所述鹽處理濾渣與所述乙酸水溶液的固液比為1g:20mL；(d)在所得酸解粗提液中加入氯化鈉進(jìn)行鹽析12h，使加入的氯化鈉在酸解粗提液中的濃度為1.5mol/L；(e)所得魚鱗膠原蛋白沉淀在攪拌(攪拌的速率為1200rpm)的同時進(jìn)行透析，所述透析采用截留分子量為4000的透析膜，所述攪拌優(yōu)選在24℃下透析4天，直接制得魚鱗膠原蛋白水凝膠。本實(shí)施例魚鱗膠原蛋白的提取率為67.57％，純度為80.78％。經(jīng)與實(shí)施例1相同的測試，本實(shí)施例所得魚鱗膠原蛋白為I型膠原蛋白。實(shí)施例7(a)在魚鱗中加入0.1mol/L的鹽酸進(jìn)行攪拌處理，在24℃下攪拌8h；所述魚鱗與所述鹽酸的固液比1g:20mL；(b)在所得酸處理濾渣中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的氯化鈉水溶液，24℃下攪拌8h，所述酸處理濾渣與所述氯化鈉水溶液的固液比1g:30mL；(c)在所得鹽處理濾渣中加入0.3mol/L乙酸水溶液，在24℃下攪拌24h；所述鹽處理濾渣與所述乙酸水溶液的固液體積比為1g:20mL；(d)在所得酸解粗提液中加入氯化鈉進(jìn)行鹽析12h，使加入的氯化鈉在酸解粗提液中的濃度為1.0mol/L；(e)所得魚鱗膠原蛋白沉淀在攪拌(攪拌的速率為200rpm)的同時進(jìn)行透析，所述透析采用截留分子量為4000的透析膜，所述攪拌優(yōu)選在24℃下透析4天，直接制得魚鱗膠原蛋白水凝膠。本實(shí)施例魚鱗膠原蛋白的提取率為76.75％，純度為83.34％。經(jīng)與實(shí)施例1相同的測試，本實(shí)施例所得魚鱗膠原蛋白為I型膠原蛋白。將實(shí)施例1～4所得魚鱗膠原蛋白水凝膠成品分別編號為樣品1～樣品4，依據(jù)食品 中氨基酸的測定標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009,124-2003，采用氨基酸分析儀(日立L-8800型)對樣品1～4進(jìn)行檢測以分析所得魚鱗膠原蛋白水凝膠的氨基酸成分；檢測條件，柱溫：57℃恒溫；色譜柱：日立855-350型；反應(yīng)柱溫：134℃；檸檬酸pH緩沖液梯度洗脫；檢測波長：570nm+440nm；流速：洗脫泵0.4mL/min+衍生泵0.35mL/min分析時間：59min；檢測結(jié)果如下表1所示：表1魚鱗膠原蛋白水凝膠氨基酸含量從上表1可以看出魚鱗膠原蛋白特征氨基酸-羥脯氨酸的含量為10.17-14.26g/100g，高于目前市售的膠原蛋白。進(jìn)一步說明，本發(fā)明的方法穩(wěn)定且有效。依據(jù)GB15193.3-2014對實(shí)施例1～4所得魚鱗膠原蛋白水凝膠進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，其中檢測環(huán)境為屏蔽環(huán)境動物房，其使用許可證號：SYXK(浙)2011-0158，室溫為20.3～23.7℃，相對濕度為50.3％～68.4％；試驗(yàn)動物為清潔級ICR小鼠，20只，雌雄各半，每只體重為18～22g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2014-0001；染毒途徑為：經(jīng)口灌胃；試驗(yàn)方法為：采用限量法，灌胃劑量為10000mg/kg，染毒前動物禁食4h，染毒后，每天觀察中毒癥狀和行為變化，每周稱重一次，對中毒死亡動物和染毒后14天存活動物作大體解剖觀察；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)動物在染 毒14天內(nèi)未見任何中毒癥狀和中毒死亡，雌雄動物的平均體重未見異常。實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)束，對受試動物進(jìn)行大體解剖檢查未見異常，其LD50≥5000mg/kg，根據(jù)急性毒性分級，所測樣品為實(shí)際無毒。對實(shí)施例1～4所得魚鱗膠原蛋白水凝膠的變性溫度、吸濕性、乳化性及起泡性進(jìn)行測試，所得結(jié)果如下表2所示：表2分析項(xiàng)目所得結(jié)果分析方法變性溫度，℃35.23±4.7差式掃描量熱法(DSC)乳化性，3.36±0.86強(qiáng)濁度法吸濕性，g/g0.25±0.07差重法起泡性，％185±12氣流法從表2中可以看出，本方法所制備的魚鱗膠原蛋白水凝膠性能穩(wěn)定，不易變性。最后說明的是：以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的實(shí)施過程和特點(diǎn)，而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁1 2 3