本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及環(huán)境污染檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于新型灘涂模式魚類-彈涂魚多型卵黃蛋白原(vitellogenin，vtg)的水體環(huán)境雌激素檢測(cè)方法，可廣泛運(yùn)用于河口灘涂水域的環(huán)境雌激素污染程度的評(píng)估。
背景技術(shù)：
：工業(yè)高速發(fā)展的當(dāng)代，大量化學(xué)物質(zhì)在環(huán)境中不合理地釋放、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對(duì)農(nóng)藥地過分依賴都對(duì)環(huán)境造成了極大地污染。越來(lái)越多的證據(jù)表明，環(huán)境中存在多種能模擬和干擾動(dòng)物及人類內(nèi)分泌機(jī)能的物質(zhì)。這些外源性化合物進(jìn)入機(jī)體后，干擾機(jī)體內(nèi)分泌的合成、釋放、運(yùn)輸、代謝、結(jié)合等過程，并由此造成動(dòng)物的雌雄性別的改變以及畸形等病變。這一大類物質(zhì)稱為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EnvironmentalEndocrineDisrupters，EEDs)、環(huán)境雌激素(Enviromentalestrogens)、或內(nèi)分泌活性化合物(Endocrineactivecompounds)。環(huán)境雌激素問題與臭氧層破壞及溫室效應(yīng)相提并論，足見對(duì)其重視程度。目前大部分內(nèi)分泌干擾物的研究工作還是針對(duì)單一化合物的模擬暴露，實(shí)際環(huán)境體系卻包含一系列具有不同雌激素活性的物質(zhì)。所以，基于單種物質(zhì)的毒理學(xué)數(shù)據(jù)很難對(duì)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確的評(píng)估。研究混合物的雌激素活性比研究單種物質(zhì)更符合實(shí)際環(huán)境所存在的狀態(tài)。由不可見效應(yīng)濃度的幾種類雌激素物質(zhì)組成的混合物具有明顯的雌激素活性。建立經(jīng)濟(jì)、方便、靈敏的環(huán)境雌激素混合物活性檢測(cè)方法，特別是尋找高效、特異、靈敏的生物標(biāo)志物已成為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)研究的焦點(diǎn)。環(huán)境雌激素種類繁多，化學(xué)分析不能窮究環(huán)境樣品中的所有具有雌激素效應(yīng)的污染物，而且僅由環(huán)境雌激素的濃度并不能得知其毒性效應(yīng)的強(qiáng)弱。再次，化學(xué)分析方法對(duì)儀器的依賴度高，耗時(shí)耗力。而生物標(biāo)志物的運(yùn)用很好的解決了這一缺陷，通過測(cè)定樣品的整體內(nèi)分泌干擾效應(yīng)而無(wú)需知道樣品的詳細(xì)化合物組成，且操作簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)和高效的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為監(jiān)測(cè)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的主要手段。彈涂魚Periophthalmusmodestus，隸屬于鱸形目、蝦虎魚亞目、彈涂魚科、彈涂魚屬，棲息于河口咸淡水水域、近岸灘涂處或底質(zhì)爛泥的低潮區(qū)，為沿岸暖水廣溫廣鹽性魚類。魚類的卵黃蛋白原(vitellogenin，Vtg)是在雌二醇(estradiol-17β，E2)作用下經(jīng)肝臟合成后分泌到血液中的卵黃前驅(qū)蛋白。通常情況下，Vtg是雌魚在卵黃形成時(shí)期血液中出現(xiàn)的雌特異性血清蛋白，但雄魚和稚魚在外源性雌激素作用下同樣能誘導(dǎo)體內(nèi)Vtg的生成。根據(jù)這一特性，Vtg除了可作為判斷性別和雌魚成熟度的指示蛋白外，也可通過檢測(cè)雄魚或稚魚體內(nèi)Vtg的異常生成來(lái)評(píng)價(jià)水域環(huán)境中外源性雌激素物質(zhì)(環(huán)境雌激素)的污染狀況(Specker&Sullivan，1994)。目前國(guó)內(nèi)外已有部分針對(duì)卵黃蛋白原開發(fā)出類雌激素污染檢測(cè)方法，但所選擇的魚類模型主要為淡水鯉科魚類，未見灘涂水域魚類用于環(huán)境雌激素檢測(cè)方面的專利報(bào)道。而淡水鯉科魚類和彈涂魚生活的水體完全不同，彈涂魚由于其生境的特殊性，在環(huán)境雌激素檢測(cè)上的應(yīng)用具有鯉科魚類不可替代的實(shí)際意義。本研究選用灘涂定居性彈涂魚作為活體模型，建立了針對(duì)卵黃蛋白原的活體環(huán)境檢測(cè)技術(shù)，具有較高的創(chuàng)新性和實(shí)用性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種基于彈涂魚多型卵黃蛋白原的水體雌激素污染檢測(cè)方法，將其運(yùn)用于各水域的環(huán)境雌激素污染檢測(cè)。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：第一方面，本發(fā)明涉及一種彈涂魚卵黃蛋白原在作為檢測(cè)環(huán)境雌激素污染的指示蛋白中的用途，所述彈涂魚卵黃蛋白原的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。優(yōu)選的，編碼所述彈涂魚卵黃蛋白原的彈涂魚VtgAa基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1中第3位～第5000位所示。第二方面，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)水生環(huán)境污染的測(cè)試方法，所述方法包括檢測(cè)水生環(huán)境中的魚類中彈涂魚卵黃蛋白原的表達(dá)水平，所述彈涂魚卵黃蛋白原的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。優(yōu)選的，所述水生環(huán)境污染是雌激素效應(yīng)。優(yōu)選的，所述方法包括如下步驟：S1、從彈涂魚幼魚或雄魚的肝臟組織中提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增；S2、分別設(shè)計(jì)VtgAa和內(nèi)參ef1-α基因熒光定量PCR引物，建立絕對(duì)定量PCR法；S3、對(duì)樣品中的卵黃蛋白原VtgAa的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量，分析樣品的環(huán)境雌激素污染程度。第三方面，本發(fā)明涉及一種克隆彈涂魚VtgAa基因全長(zhǎng)序列的方法，所述方法包括如下步驟：A1、從性成熟期彈涂魚雌魚的肝臟組織中提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增；A2、設(shè)計(jì)VtgAa的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，獲得VtgAa基因片段；A3、以彈涂魚總RNA為模板根據(jù)RACE法分別制備VtgAa基因3’端和5’端cDNA序列；A4、設(shè)計(jì)特異性全長(zhǎng)引物，擴(kuò)增獲得VtgAa基因全長(zhǎng)序列。優(yōu)選的，步驟A2中，VtgAa基因?qū)?yīng)的簡(jiǎn)并引物為如SEQIDNO.3所示的vtgAa-degenerate-F1和如SEQIDNO.4所示的vtgAa-degenerate-R1。優(yōu)選的，步驟A3中，VtgAa基因?qū)?yīng)的RACE引物為如SEQIDNO.7所示的vtgAa-5′RACE-GSP1和如SEQIDNO.8所示的vtgAa-3′RACE-GSP2。優(yōu)選的，步驟A4中，VtgAa基因?qū)?yīng)的特異性全長(zhǎng)引物為如SEQIDNO.11所示的vtgAa-fullprimer-F1和如SEQIDNO.12所示的vtgAa-fullprimer-R1。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：1、本發(fā)明獲得了彈涂魚VtgAa基因全長(zhǎng)CDS序列，填補(bǔ)了彈涂魚Vtg基因家族的空白。2、彈涂魚是我國(guó)東南沿海廣泛分布的常見河口性魚類，Vtg是了解河口咸淡水水域、近岸灘涂處或底質(zhì)爛泥的低潮區(qū)環(huán)境雌激素污染的重要生物標(biāo)志物，獲得VtgAa基因全長(zhǎng)，對(duì)于更準(zhǔn)確指示相應(yīng)水域污染狀況，以及更深入探究水生生物在污染水域的蛋白表達(dá)等問題具有重要意義。3、本發(fā)明通過設(shè)計(jì)特異性引物，建立了彈涂魚VtgAa和ef1-α(內(nèi)參)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。運(yùn)用熒光定量PCR法檢測(cè)了VtgAa在雌激素誘導(dǎo)下的表達(dá)水平的變化情況，進(jìn)而指示出環(huán)境中的雌激素污染情況。附圖說(shuō)明圖1為彈涂魚卵黃蛋白原VtgAa和ef1-α基因的cDNA全長(zhǎng)電泳圖；其中，M：Marker，1：VtgAa，2：ef1-α；圖2為彈涂魚VtgAa基因和內(nèi)參基因ef1-α的熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖3為不同濃度雌激素不同時(shí)間誘導(dǎo)下，VtgAa表達(dá)水平的變化。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例本實(shí)施例涉及一種彈涂魚多型卵黃蛋白原(vitellogenin，vtg)基因、編碼蛋白及其應(yīng)用、克隆cDNA全長(zhǎng)序列的方法。VtgAa基因：本發(fā)明的彈涂魚多型VtgAa基因，其特征在于VtgAa序列全長(zhǎng)5223bp，包含起始密碼子ATG、終止密碼子TAG及polyA。該基因的開放閱讀框(ORF)位于3～5000bp，長(zhǎng)4998bp，共編碼1665個(gè)氨基酸，其中信號(hào)肽為15個(gè)氨基酸。根據(jù)推算，其編碼蛋白分子量為185kDa。該編碼氨基酸序列具有典型的完全型卵黃蛋白原結(jié)構(gòu)：1個(gè)vitellogenin結(jié)構(gòu)域(位于編碼氨基酸肽鏈的24～594號(hào)氨基酸)、1個(gè)VWFD結(jié)構(gòu)域(位于編碼氨基酸肽鏈的1423～1555號(hào)氨基酸)，1個(gè)多聚絲氨酸區(qū)域(位于編碼氨基酸肽鏈的1064～1195號(hào)氨基酸)，另外還含有1個(gè)蛋白水解酶切位點(diǎn)(RSRR)。將該推導(dǎo)氨基酸序列與其他魚類Vtg氨基酸序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列包含LvH、LvL、Pv和β組分4個(gè)部分。本發(fā)明所述彈涂魚VtgAa基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所獲得的全長(zhǎng)VtgAacDNA序列的編碼區(qū)為從第3個(gè)核苷酸到5000個(gè)核苷酸。本發(fā)明所述彈涂魚VtgAa基因的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本發(fā)明通過設(shè)計(jì)特異性引物，引物為如SEQIDNO.15～18所示，建立了彈涂魚VtgAa和ef1-α(內(nèi)參)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。運(yùn)用熒光定量PCR法檢測(cè)了VtgAa基因在不同濃度雌激素誘導(dǎo)下的表達(dá)變化，結(jié)果表明：隨著濃度的增加誘導(dǎo)效應(yīng)顯著增強(qiáng)；隨著暴露時(shí)間的增加，VtgAa表達(dá)量(同一濃度)存在明顯的時(shí)間依存效應(yīng)。克隆cDNA全長(zhǎng)序列的方法：從性成熟期彈涂魚雌魚的肝臟組織中提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，設(shè)計(jì)Vtg的簡(jiǎn)并引物，獲得相應(yīng)基因片段；在此基礎(chǔ)上，采用SMARTRACE技術(shù)獲得5’和3’端未知序列；最后設(shè)計(jì)全長(zhǎng)上下游引物，克隆獲得相應(yīng)的全長(zhǎng)cDNA序列。用Macvector軟件確認(rèn)完整開放閱讀框(ORF)并分析其各功能域。通過完整氨基酸序列比對(duì)建立系統(tǒng)分析圖，確定其Vtg類型。在實(shí)施過程中，克隆cDNA全長(zhǎng)序列的技術(shù)方案可采用如下具體步驟：1、動(dòng)物組織器官樣品采集：采集新鮮的懷卵彈涂魚雌魚的肝臟，剪碎后置于RNAlater中保存用于總RNA提取。2、彈涂魚總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增按照ISOGENII試劑盒操作說(shuō)明提取總RNA，具體方法如下：(1)將肝臟組織(約100mg)放入1.5ml離心管，加入1mlISOGENII，電動(dòng)勻漿棒勻漿后，加入0.4mlRNasefree水，15s劇烈振蕩后，室溫靜置10min；在4℃下，12K×g，離心10min。(2)取上清1ml，加入5μl對(duì)溴苯甲醚，15s劇烈振蕩后，室溫靜置3min；在4℃下，12K×g，離心10min。(3)取上清1ml，加入1ml(等體積)異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10min；在4℃下，12K×g，離心10min，管底及管壁的白色沉淀即為RNA沉淀。(4)棄上清，在RNA沉淀中加入0.5ml75％乙醇洗滌沉淀，在4℃下，7K×g，離心3min，棄上清；重復(fù)操作此步驟一次。(5)室溫遮光干燥沉淀2min。(6)加入50μl(或適量)RNasefree水溶解沉淀，此溶液即為總RNA溶液。(7)用0.8％瓊脂糖TAE凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性；用ThermoFisherNanoDrop2000分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度及純度。(8)將上述總RNA按照VILOTMcDNASynthesisKit(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板。注：以上所述離心管，勻漿棒等均為RNasefree處理。2、簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增Vtg基因和ef1-α內(nèi)參基因片段Vtg基因?qū)僭谛蛄猩暇哂斜Ｊ匦?，根?jù)庸鰈、真鯛、鯔魚、食蚊魚、矛尾刺蝦虎魚vtg基因CDS序列，用Blast進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)Vtg基因的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，根據(jù)ef1-α基因的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，序列如下：vtgAa-degenerate-F15’-AARATGAAGCGYRTCMTDMAGGCTCT-3’SEQIDNO.3vtgAa-degenerate-R15'-AACWGGMAGRRCTYSDAKCTTAAAST-3’SEQIDNO.4ef1-α-F15'GCCCTGCTGGCCTACACCCT--3’SEQIDNO.5ef1-α-R15’-GGTGGTTCAGGATGATGACCT-3’SEQIDNO.6PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10μl體系：F和R端引物(10μM)各1μl，cDNA模板0.5μl，ddH2O2.5μl，MasterMix5μl，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，35個(gè)循環(huán)(95℃，30s；54℃，30s；72℃，1min)，72℃延伸10min。4、PCR產(chǎn)物的回收和純化取5μlPCR反應(yīng)物進(jìn)行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，用于確認(rèn)中間序列擴(kuò)增產(chǎn)物。將目標(biāo)條帶產(chǎn)物用GENECLEANTurboKit(MPBiomedicalsEurope，F(xiàn)rance)割膠純化回收。5、PCR擴(kuò)增目的片段的連接轉(zhuǎn)化(1)連接：在0.2mlPCR管中加入PCR產(chǎn)物3μl，pGEM-TEasyVector(Promega，USA)1μl，T4ligase1μl，Buffer5μl，輕輕混勻后，4℃靜置過夜。(2)轉(zhuǎn)化：加連接產(chǎn)物5μl于大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴30min；42℃熱激45s，立刻置于冰上2min；涂平板，將培養(yǎng)皿倒置放入37℃培養(yǎng)箱過夜。6、陽(yáng)性克隆的鑒定、測(cè)序及序列分析在0.2mlPCR管中加入10ul如下混合液：AmpliTaqMasterMix5μl，T7和SP6引物(10μM)各0.5μl，無(wú)菌水4ul，用無(wú)菌牙簽取單一克隆后放入上述PCR管中，使之充分接觸后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min；35個(gè)循環(huán)(95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min)；72℃延伸10min。確認(rèn)包含目的片段的克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，用T7和SP6引物測(cè)序。結(jié)果分別獲得579bpVtgAa和640bpef1-α基因片段。7、5’RACE和3’RACE擴(kuò)增彈涂魚Vtg5’端和3’端基因序列利用Macvector設(shè)計(jì)RACE引物如下：vtgAa-5′RACE-GSP15’-CCTGGACCTTGGCTCTTGAGACTATGG-3’SEQIDNO.7vtgAa-3′RACE-GSP25’-GTCACTTGTTCCAAAATGGTGTCTCCGC-3’SEQIDNO.8efl-α-5′RACE-GSP15’-CGTTTCCACGACGGATTTCCTTG-3’SEQIDNO.9ef1-α-3′RACE-GSP25’-TGTCCTGGTTCAAGGGATGGAAG-3’SEQIDNO.10按照RACE5’/3’Kit(Clontech)說(shuō)明書進(jìn)行，以彈涂魚總RNA為模板制備其3’端和5’端cDNA，與特異性引物(GSP)配制成總體積為25μl的PCR反應(yīng)液：包括2.5μl10×Advantage2PCRbufier，0.5μldNTPsmix(10mM)，0.5μlGSP(10μM)，2.5μl10×UPM，1.25μl模板和0.5μl10×Advantage2polymerasemix(Clontech)。PCR反應(yīng)條件如下：5個(gè)循環(huán)(94℃，30s；72℃，3min)，5個(gè)循環(huán)(94℃，30s；70℃，30s；72℃，3min)，25個(gè)循環(huán)(94℃，30s；68℃，30s；72℃，3min)。5’RACE和3’RACE進(jìn)行PCR反應(yīng)后連接轉(zhuǎn)化步驟同5。8、擴(kuò)增VtgAa基因全長(zhǎng)序列根據(jù)RACE法獲得的3’端和5’端cDNA序列，分別設(shè)計(jì)特異性全長(zhǎng)引物如下：vtgAa-fullprimer-F15’-CAGCCATGAGAGTCGTTGTACTAGCCT-3’SEQIDNO.11vtgAa-fullprimer-R15’-CAAGCAGTGGTATCAGCGCAGAGTA-3’SEQIDNO.12efl-α-fullprimer-F15’-GCCTTGAAAAACCCAGAAACACCG-3’SEQIDNO.13ef1-α-fullprimer-R15’-GGTGATGTGAGGGGAAAGGGAG-3’SEQIDNO.14配置如下PCR反應(yīng)液：包括10×Advantage2PCRbuffer(5μl)，dNTPsmix(10mM，1μl)，上下游引物GSP(10μM，各1μl)，模板(1μl)和10×Advantage2polymerasemix(1μl)，加N.F.W.至總反應(yīng)體積為50μl。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性1min；5個(gè)循環(huán)(95℃，30s；68℃，3min)，25個(gè)循環(huán)(94℃，30s；68℃，30s；72℃，3min)，68℃延伸3min。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果如圖1所示，由圖1可知，以cDNA為模板，分別以SEQID19和SEQID20引物擴(kuò)增獲得了預(yù)期的全長(zhǎng)5000bp左右的VtgAa條帶；以SEQID23和SEQID24引物擴(kuò)增獲得了預(yù)期的全長(zhǎng)1500bp左右的ef1-α條帶。其中，M：Marker，1：VtgAa，2：ef1-α。9、雌激素誘導(dǎo)效果試驗(yàn)(1)試驗(yàn)魚采自上海崇明島東灘濕地天然無(wú)污染水域，幼魚，暫養(yǎng)于10個(gè)10L玻璃水槽中，水溫18，pH值7.5，每日換水一次。(2)試驗(yàn)誘導(dǎo)劑：內(nèi)源性雌激素雌二醇(E2)；助溶劑：無(wú)水乙醇。(3)誘導(dǎo)試驗(yàn)：采用水體中暴露溶解雌激素的方法實(shí)施對(duì)彈涂魚卵黃蛋白原的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為E2組、對(duì)照組，每個(gè)處理分成2個(gè)平行。E2組設(shè)有3個(gè)暴露濃度(10ng/L、100ng/L、1000ng/L)。對(duì)照組分為空白對(duì)照和原始對(duì)照，空白對(duì)照組水體中加入等劑量的助溶劑無(wú)水乙醇，而原始對(duì)照組中則不添加任何試劑。在暴露后的0、2和7天對(duì)每個(gè)處理組進(jìn)行隨機(jī)取樣，每組5尾，麻醉后活體取肝臟組織，剪碎后加入RNAlater保存液中保存以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。10、樣品處理采用ISOGENII試劑盒提取肝臟總RNA，分光光度計(jì)鑒定RNA質(zhì)量和檢測(cè)RNA濃度，取1μgRNA，采用Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒VILOTMcDNASynthesisKit反轉(zhuǎn)錄成cDNA，10μl反應(yīng)體系包含2μl5XVILOTMReactionMix，1μl10XEnzymeMix，1μgRNA及DEPC-treatedwater。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，10min；42℃，60min；85℃，5min。反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，用于下一步實(shí)驗(yàn)。11、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法建立分別從大腸桿菌中提取含有VtgAa和ef1-α(內(nèi)參)基因片段的重組質(zhì)粒，在分光光度計(jì)上測(cè)量其DNA濃度和純度。以制備的質(zhì)粒cDNA(目標(biāo)基因和內(nèi)參基因)為模板，稀釋成101至106拷貝數(shù)6個(gè)梯度，每個(gè)梯度2個(gè)重復(fù)，制作目的基因Vtg和ef1-α(內(nèi)參)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出目的基因的實(shí)際絕對(duì)定量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)采用PowerSYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems，USA)配置20μl反應(yīng)體系：2μlcDNA，F(xiàn)andRprimer(終濃度200nM)，SYBRGreenMix(10μl)，N.F.W。同時(shí)進(jìn)行無(wú)反轉(zhuǎn)錄樣本對(duì)照和組間對(duì)照。PCR反應(yīng)條件為：1個(gè)循環(huán)(50℃，2min；95℃，10min)，40個(gè)循環(huán)(95℃，15s；60℃，1min)。根據(jù)已得到的卵黃蛋白原VtgAa全長(zhǎng)cDNA序列，利用Primer3Plus(http：//www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/)設(shè)計(jì)如下引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。ef1-αqPCR-F15’-TGGTGACAGCAAGAACAACC-3’SEQIDNO.15ef1-αqPCR-R15’-ATGAACTTGCAGGCGATGTG-3’SEQIDNO.16vtgAa-qPCR-F15’-AAATTGCCAGAGAGCGCTTG-3’SEQIDNO.17vtgAa-qPCR-R15’-AACAGCTTGCCGTTCATCAG-3’SEQIDNO.1812、VtgAa基因的雌激素誘導(dǎo)結(jié)果由圖3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)VtgAa基因在E2暴露下的表達(dá)結(jié)果可知，以ef1-α基因作為對(duì)照基因，在暴露組均有表達(dá)，而在對(duì)照組無(wú)表達(dá)。在低濃度10ng/L下即有表達(dá)，隨著濃度的增加誘導(dǎo)效應(yīng)顯著增強(qiáng)；從暴露時(shí)間上來(lái)看，各濃度暴露組又存在明顯的時(shí)間依存效應(yīng)。SEQUENCELISTING<110>上海海洋大學(xué)<120>基于彈涂魚卵黃蛋白原的水體雌激素污染檢測(cè)方法<130>2017<160>18<170>PatentInversion3.5<210>1<211>5223<212>DNA<213>Periophthalmusmodestus（VtgAa）<400>1acatggggacaacccactcagccatgagagtcgttgtactagccttggctctagcccttg60tggctggccagcacgataacttggctcctagttttgctcccggactaacctatgtgtaca120agtacaatgcccagagcctgggaggtctgtctgaacagcacctagctaaagccggactca180acttcaccagcaatgtcaagatcagtgttgcccaagaaaacgtcctcatgcttcagcttg240agaatcctcggatctatgagttcagtggtgtttggccaaaggattcctacgtacaaactc300acctccgtgccgacctggaagctcatctcaaaaccgccatcaagttcaaatatgaccatg360ggattgtgagagagatcctggccccagagagtgtccccatactgctgctcaacatcttta420gaggcatcctcaacttcttccagctgaacatcaagaagtcacagaatgtttatgaactgc480aggaggagggagcccagggcgtgtgcaagacccagtatgccatcacagagaacgataagg540ctgagcgcatccttttgaccaagagcaggaacttgaatcactgccaggagaaggtcatga600gggatatcgggttggcatacactaagacatggcataagtgccgggagatttccaaaaacc660tgaggggaaccacaggatacttctacaagctgaaggcagccccaggcggcttgatcattg720agaaggcctccggaaaggaagtcattcagttcacaccttttaatgaccagaatggtgctg780cttctatgcagacaatccaaaccctggatttcattgctgccatcaaggctcctattgttc840ccatcagtgctccgtaccatccacgtggctccctgaaatatcagttttccactgagcttc900tgcagagccccctcaggatccttaagatgtcagacgtgaaggaacaggttgctgatgttc960tgaacaacctggttgtcaataacagagacaaagtacatgaggatgctcctctcaagtttt1020ttgagctgatcctgctgctgcgtgcttctgatttgactgaactgcgcaacctgctgacta1080cctacaaaagcagacctcttgagaggcggtggttgatggacgccatcagcaacactggaa1140caaaggctgctttggagattgtcatggctgagatccagaagagagagctatctgttcctg1200aagccgctcaagttttgattggaactctgcacatgttgaagcccactgacgagatcatcc1260agaaggtttggagctacattgagcagctctcacaggaacaaggacgctacgaacaagttg1320tgcgcaaagctctgttcctgggctatggtagcatcatccacagacagagtgttcagaggg1380ctgagtggaatgatcgtgacattcagcgcatccagtcagattttgagagggcctttgctg1440agaaaaacacacaggagcttgttctgttggctaaagttatggctaatgctgctcagcctt1500ggggctacaaacctattacaaagctcctaccaatccatggcacagctggtgagcaactgt1560cccaatcagttcacattgaagccatcctggccctgagaggcattgccaaacagaagccca1620aagaggttcagaacttggctctgcagctgtttatggacacaactctgcagcctgagcagc1680gtatgcttgccgtcatgacactctttgagaccaacccttcaatggccgtcatgactaatg1740ttatcaacgttgtcaagtctgacaacagccagccagtgatcagctttacttactctctca1800tcaagtctcagtccagaagcacagctaacccctcagtggcacctgaggctaatattgctc1860tcagactcttgggccaaaggagacagagcatgaagctgagcaaggctttcaaagcggact1920tctacagccatcctctgatgcttggtgctgctgcaagtatttattacatcaatgaggctg1980ctaccatcctccccaaagcggttatagctaagacgagtgcctatgtcgctggagctgctg2040ctgatgtttttgagattggagtcagaagtgagggattccaggagtacttcctgaaaaagg2100agagctctgatgtctctgatagaaccaccaagatgcagcgcatcattaaagctttcacca2160actggaagtctttgccaatcagcaaattgctgggctctgtgaatgtcaaggttctgggac2220aggaaatcgcttttgttgacattgacgagcagctcattgaggaggcaatgaggattcgct2280ctgaaattgacatcaaggagtatggcttaaacttactccgtcacttgttccaaaatggtg2340tctccgcacacttggtcaaagcagtgatgcccgctgagatcagacgtgtcatgcctactg2400ccgcaggcctgccaatggagcttgccttctacactgttgctgtcactgcagcaaatgtcc2460aggccagattccaggccaaccttccacagaacttccatgtttctgaccttctgaagcaga2520agaccaacattgaggctgacataaagccaagcatggccctcaacacatttgctgtgatgg2580gaatgaacactgacatcgttcaggctgccatagtctcaagagccaaggtccaggtcaacg2640tgcccgccaagatagctgcttctttggacttagctgagaacaactttaagatcagtgctc2700ttccggttcgcctctctgaaaatgttgcagttgctgttgacgttgatactctggccattg2760caagacaggccaaacgggtaacccctctgattcccgaagatgcttctccccaagcatctt2820ccgaaacatcttcatctgctagcgcctccaattctagggagatactgggtaacatgcagc2880aagttcaggacaggccccttcccacgacaagagttcccagatctgacaagaagttctgca2940ctgttactgctggagtgaagatctgcatcaacatcagctccagcaatgccaagttcatca3000cagattccgctctctccagactggctggaaagcacgctgttctcatgtctgtcgaacaat3060ctgaaagtgacaatgtcgagaagtgggaaatggagcttcagcttggagccaaggccgcaa3120acaagctgatcaaaaacatcaacttggacatggatgaggtcctagagggcacacctattc3180tgtccaaactcaagagaatcctgaatccaagcatgaaaaacaacacctcctctagctcct3240ccagcagctccaggtccagagttcgtagcagccatccttcctcctcatcctcctcctcct3300cctcatcgtccaagtctcacatggccggtaaagttatcagcaccatgggcaaaatcatcg3360gggttaaccaaaagaggagcagcagcagcagcagcagcagtaggagtcagcaaaaccgca3420agaggcaaaggtccactgtgtccagcctgagctctctgttcagtgctagctccagctcct3480cacagtttttccccaagtctcagcgccagagctctcgttccaaattccagccaaaccacc3540agaagacgacatccaagcggcactcaggatctgcctcctctgcaagaacctttgaggaca3600tcaggaaacagaacaaattccttggcaataccgttgagccagtttttgcactgatcctcc3660gtgctgtcagagctaacaacaacaatccactgggctaccagatcgctgcctataaggatg3720gagacagagttcagatgatcatggctgccctggcttctcatgacaactggaggctttgtg3780ctgatgccattaaacttagcaagaacaaagctgctgctaaaattgcatggggagagaagt3840gccagaaatatgagaccatgattacagctgagtctggccgtgttcagaacaagggacaat3900ctcaagatgcagctcgtgtgagagtggcctggaaaagactgcccactgctgttgtcaaag3960atgtcaaaatgatctacaactccatcattgccccttacttgtctagtggctatctgcaga4020agagatcagatgcgaccaggcagatttccttcactgtggttgttgagcctaagaaacagc4080ttggctttatttggaaatcaccagcatttgtctacaggagtaatgtgcctcttcccatca4140ctctgccaatcgatgagctgaaggaagtgctgccatttgatgaaatgcttgacaacgctc4200actatctgttggcaaagactactggaattcagtgcagatttaatgaaggacagcttacca4260cttccagcaaaagacaacacaagaactacatgccaaattcttgctaccagctgctggctc4320aggattgcaccgatgagcttaaattcattgttttgctgaagaaggatagcgcaggccgtt4380acatggtcaatgtgaagattggtacaagggatattgacatgttctttaatggagaaagac4440cagctgtcatgatcaatggaaaggaaattgccagagagcgcttgccatatgacagagatt4500cagtgacgattctgctgatgaacggcaagctgtttctccgtgctctggactttggcattg4560ctgaactccaattcagtgcatcagaagtgacgatcaatgttccagagtatttgaggaaca4620aagtctgcggtctctgcggccaaggcaatggagacaggagaaacgattaccgcatgccca4680atggacgtatcactgataaccccatcagcttcgcccattcctggactctgccctctcaga4740gttgcagcgatgagactgaatgtcgtttgactcatgagtccattgaactggagagagaaa4800ttaacgatcacggtgtgccgtctaagtgcttctctgtggactctgtgctgcgctgtcgcc4860ctggctgcactcccactaagaccaccatgtccagtgtgagcttccactgcagacccctca4920atgacaacagccaagtgtcagatatccgtaaccgcagcattgacatgactgagtccgttg4980aagcccatcttgactgcagttgcacttctcagtgtgcttagatcttgtcgtcttatattg5040tgtctatgtgtaattttaactaaataaatgaaggcatctcaaaagacaaaaaaaaaaaaa5100aaaaaaaaaaaaaaaaaaaatataaagaaaaaaaaaaaaaaaaaaaggtactctgcgctg5160ataccactgcttgccctatagtgagtcgtattagaatcgaattcccgcggccgcatggcg5220gcc5223<210>2<211>1665<212>PRT<213>Periophthalmusmodestus（VtgAa）<400>2MetArgValValValLeuAlaLeuAlaLeuAlaLeuValAlaGlyGln151015HisAspAsnLeuAlaProSerPheAlaProGlyLeuThrTyrValTyr202530LysTyrAsnAlaGlnSerLeuGlyGlyLeuSerGluGlnHisLeuAla354045LysAlaGlyLeuAsnPheThrSerAsnValLysIleSerValAlaGln505560GluAsnValLeuMetLeuGlnLeuGluAsnProArgIleTyrGluPhe65707580SerGlyValTrpProLysAspSerTyrValGlnThrHisLeuArgAla859095AspLeuGluAlaHisLeuLysThrAlaIleLysPheLysTyrAspHis100105110GlyIleValArgGluIleLeuAlaProGluSerValProIleLeuLeu115120125LeuAsnIlePheArgGlyIleLeuAsnPhePheGlnLeuAsnIleLys130135140LysSerGlnAsnValTyrGluLeuGlnGluGluGlyAlaGlnGlyVal145150155160CysLysThrGlnTyrAlaIleThrGluAsnAspLysAlaGluArgIle165170175LeuLeuThrLysSerArgAsnLeuAsnHisCysGlnGluLysValMet180185190ArgAspIleGlyLeuAlaTyrThrLysThrTrpHisLysCysArgGlu195200205IleSerLysAsnLeuArgGlyThrThrGlyTyrPheTyrLysLeuLys210215220AlaAlaProGlyGlyLeuIleIleGluLysAlaSerGlyLysGluVal225230235240IleGlnPheThrProPheAsnAspGlnAsnGlyAlaAlaSerMetGln245250255ThrIleGlnThrLeuAspPheIleAlaAlaIleLysAlaProIleVal260265270ProIleSerAlaProTyrHisProArgGlySerLeuLysTyrGlnPhe275280285SerThrGluLeuLeuGlnSerProLeuArgIleLeuLysMetSerAsp290295300ValLysGluGlnValAlaAspValLeuAsnAsnLeuValValAsnAsn305310315320ArgAspLysValHisGluAspAlaProLeuLysPhePheGluLeuIle325330335LeuLeuLeuArgAlaSerAspLeuThrGluLeuArgAsnLeuLeuThr340345350ThrTyrLysSerArgProLeuGluArgArgTrpLeuMetAspAlaIle355360365SerAsnThrGlyThrLysAlaAlaLeuGluIleValMetAlaGluIle370375380GlnLysArgGluLeuSerValProGluAlaAlaGlnValLeuIleGly385390395400ThrLeuHisMetLeuLysProThrAspGluIleIleGlnLysValTrp405410415SerTyrIleGluGlnLeuSerGlnGluGlnGlyArgTyrGluGlnVal420425430ValArgLysAlaLeuPheLeuGlyTyrGlySerIleIleHisArgGln435440445SerValGlnArgAlaGluTrpAsnAspArgAspIleGlnArgIleGln450455460SerAspPheGluArgAlaPheAlaGluLysAsnThrGlnGluLeuVal465470475480LeuLeuAlaLysValMetAlaAsnAlaAlaGlnProTrpGlyTyrLys485490495ProIleThrLysLeuLeuProIleHisGlyThrAlaGlyGluGlnLeu500505510SerGlnSerValHisIleGluAlaIleLeuAlaLeuArgGlyIleAla515520525LysGlnLysProLysGluValGlnAsnLeuAlaLeuGlnLeuPheMet530535540AspThrThrLeuGlnProGluGlnArgMetLeuAlaValMetThrLeu545550555560PheGluThrAsnProSerMetAlaValMetThrAsnValIleAsnVal565570575ValLysSerAspAsnSerGlnProValIleSerPheThrTyrSerLeu580585590IleLysSerGlnSerArgSerThrAlaAsnProSerValAlaProGlu595600605AlaAsnIleAlaLeuArgLeuLeuGlyGlnArgArgGlnSerMetLys610615620LeuSerLysAlaPheLysAlaAspPheTyrSerHisProLeuMetLeu625630635640GlyAlaAlaAlaSerIleTyrTyrIleAsnGluAlaAlaThrIleLeu645650655ProLysAlaValIleAlaLysThrSerAlaTyrValAlaGlyAlaAla660665670AlaAspValPheGluIleGlyValArgSerGluGlyPheGlnGluTyr675680685PheLeuLysLysGluSerSerAspValSerAspArgThrThrLysMet690695700GlnArgIleIleLysAlaPheThrAsnTrpLysSerLeuProIleSer705710715720LysLeuLeuGlySerValAsnValLysValLeuGlyGlnGluIleAla725730735PheValAspIleAspGluGlnLeuIleGluGluAlaMetArgIleArg740745750SerGluIleAspIleLysGluTyrGlyLeuAsnLeuLeuArgHisLeu755760765PheGlnAsnGlyValSerAlaHisLeuValLysAlaValMetProAla770775780GluIleArgArgValMetProThrAlaAlaGlyLeuProMetGluLeu785790795800AlaPheTyrThrValAlaValThrAlaAlaAsnValGlnAlaArgPhe805810815GlnAlaAsnLeuProGlnAsnPheHisValSerAspLeuLeuLysGln820825830LysThrAsnIleGluAlaAspIleLysProSerMetAlaLeuAsnThr835840845PheAlaValMetGlyMetAsnThrAspIleValGlnAlaAlaIleVal850855860SerArgAlaLysValGlnValAsnValProAlaLysIleAlaAlaSer865870875880LeuAspLeuAlaGluAsnAsnPheLysIleSerAlaLeuProValArg885890895LeuSerGluAsnValAlaValAlaValAspValAspThrLeuAlaIle900905910AlaArgGlnAlaLysArgValThrProLeuIleProGluAspAlaSer915920925ProGlnAlaSerSerGluThrSerSerSerAlaSerAlaSerAsnSer930935940ArgGluIleLeuGlyAsnMetGlnGlnValGlnAspArgProLeuPro945950955960ThrThrArgValProArgSerAspLysLysPheCysThrValThrAla965970975GlyValLysIleCysIleAsnIleSerSerSerAsnAlaLysPheIle980985990ThrAspSerAlaLeuSerArgLeuAlaGlyLysHisAlaValLeuMet99510001005SerValGluGlnSerGluSerAspAsnValGluLysTrpGluMet101010151020GluLeuGlnLeuGlyAlaLysAlaAlaAsnLysLeuIleLysAsn102510301035IleAsnLeuAspMetAspGluValLeuGluGlyThrProIleLeu104010451050SerLysLeuLysArgIleLeuAsnProSerMetLysAsnAsnThr105510601065SerSerSerSerSerSerSerSerArgSerArgValArgSerSer107010751080HisProSerSerSerSerSerSerSerSerSerSerSerLysSer108510901095HisMetAlaGlyLysValIleSerThrMetGlyLysIleIleGly110011051110ValAsnGlnLysArgSerSerSerSerSerSerSerSerArgSer111511201125GlnGlnAsnArgLysArgGlnArgSerThrValSerSerLeuSer113011351140SerLeuPheSerAlaSerSerSerSerSerGlnPhePheProLys114511501155SerGlnArgGlnSerSerArgSerLysPheGlnProAsnHisGln116011651170LysThrThrSerLysArgHisSerGlySerAlaSerSerAlaArg117511801185ThrPheGluAspIleArgLysGlnAsnLysPheLeuGlyAsnThr119011951200ValGluProValPheAlaLeuIleLeuArgAlaValArgAlaAsn120512101215AsnAsnAsnProLeuGlyTyrGlnIleAlaAlaTyrLysAspGly122012251230AspArgValGlnMetIleMetAlaAlaLeuAlaSerHisAspAsn123512401245TrpArgLeuCysAlaAspAlaIleLysLeuSerLysAsnLysAla125012551260AlaAlaLysIleAlaTrpGlyGluLysCysGlnLysTyrGluThr126512701275MetIleThrAlaGluSerGlyArgValGlnAsnLysGlyGlnSer128012851290GlnAspAlaAlaArgValArgValAlaTrpLysArgLeuProThr129513001305AlaValValLysAspValLysMetIleTyrAsnSerIleIleAla131013151320ProTyrLeuSerSerGlyTyrLeuGlnLysArgSerAspAlaThr132513301335ArgGlnIleSerPheThrValValValGluProLysLysGlnLeu134013451350GlyPheIleTrpLysSerProAlaPheValTyrArgSerAsnVal135513601365ProLeuProIleThrLeuProIleAspGluLeuLysGluValLeu137013751380ProPheAspGluMetLeuAspAsnAlaHisTyrLeuLeuAlaLys138513901395ThrThrGlyIleGlnCysArgPheAsnGluGlyGlnLeuThrThr140014051410SerSerLysArgGlnHisLysAsnTyrMetProAsnSerCysTyr141514201425GlnLeuLeuAlaGlnAspCysThrAspGluLeuLysPheIleVal143014351440LeuLeuLysLysAspSerAlaGlyArgTyrMetValAsnValLys144514501455IleGlyThrArgAspIleAspMetPhePheAsnGlyGluArgPro146014651470AlaValMetIleAsnGlyLysGluIleAlaArgGluArgLeuPro147514801485TyrAspArgAspSerValThrIleLeuLeuMetAsnGlyLysLeu149014951500PheLeuArgAlaLeuAspPheGlyIleAlaGluLeuGlnPheSer150515101515AlaSerGluValThrIleAsnValProGluTyrLeuArgAsnLys152015251530ValCysGlyLeuCysGlyGlnGlyAsnGlyAspArgArgAsnAsp153515401545TyrArgMetProAsnGlyArgIleThrAspAsnProIleSerPhe155015551560AlaHisSerTrpThrLeuProSerGlnSerCysSerAspGluThr156515701575GluCysArgLeuThrHisGluSerIleGluLeuGluArgGluIle158015851590AsnAspHisGlyValProSerLysCysPheSerValAspSerVal159516001605LeuArgCysArgProGlyCysThrProThrLysThrThrMetSer161016151620SerValSerPheHisCysArgProLeuAsnAspAsnSerGlnVal162516301635SerAspIleArgAsnArgSerIleAspMetThrGluSerValGlu164016451650AlaHisLeuAspCysSerCysThrSerGlnCysAla165516601665<210>3<211>26<212>PRT<213>ArtificialSequence<220><223>vtgAa-degenerate-F1<400>3AlaAlaArgAlaThrGlyAlaAlaGlyCysGlyTyrArgThrCysMet151015ThrAspMetAlaGlyGlyCysThrCysThr2025<210>4<211>26<212>PRT<213>ArtificialSequence<220><223>vtgAa-degenerate-R1<400>4AlaAlaCysTrpGlyGlyMetAlaGlyArgArgCysThrTyrSerAsp151015AlaLysCysThrThrAlaAlaAlaSerThr2025<210>5<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>ef1-α-F1<400>5gccctgctggcctacaccct20<210>6<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>ef1-α-R1<400>6ggtggttcaggatgatgacct21<210>7<211>27<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>vtgAa-5'RACE-GSP1<400>7cctggaccttggctcttgagactatgg27<210>8<211>28<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>vtgAa-3'RACE-GSP2<400>8gtcacttgttccaaaatggtgtctccgc28<210>9<211>23<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>ef1-α-5'RACE–GSP1<400>9cgtttccacgacggatttccttg23<210>10<211>23<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>ef1-α-3'RACE-GSP2<400>10tgtcctggttcaagggatggaag23<210>11<211>27<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>vtgAa-fullprimer-F1<400>11cagccatgagagtcgttgtactagcct27<210>12<211>25<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>vtgAa-fullprimer-R1<400>12caagcagtggtatcagcgcagagta25<210>13<211>23<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>ef1-α-fullprimer-F1<400>13gccttgaaaaacccagaaacaccg23<210>14<211>25<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>ef1-α-fullprimer-R1<400>14ggtgatgtgaggggaaagggag22<210>15<211><212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>ef1-αqPCR-F1<400>15tggtgacagcaagaacaacc20<210>16<211><212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>ef1-αqPCR-R1<400>16atgaacttgcaggcgatgtg20<210>17<211><212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>vtgAa-qPCR-F1<400>17aaattgccagagagcgcttg20<210>18<211><212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>vtgAa-qPCR-R1<400>18aacagcttgccgttcatcag20當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3