大瀧六線魚卵黃原蛋白間接elisa試劑盒及其制備方法、檢測(cè)方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒及其制備方法、檢測(cè)方法和應(yīng)用。制備時(shí)，首先利用硫酸銨沉淀與SephadexG-200層析從17 β -雌二醇誘導(dǎo)的大瀧六線魚血漿中純化出卵黃原蛋白；然后，免疫大白兔制備其多克隆抗血清，利用HitrapProteinG純化獲得多克隆抗體。將大瀧六線魚卵黃原蛋白純品、兔抗卵黃原蛋白多克隆抗體、空白96孔酶標(biāo)板1塊、以及包被液、洗滌液、封閉液、樣品稀釋液、顯色液、終止液和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗各1支共同裝入盒體，得到檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒。本發(fā)明的試劑盒能夠靈敏、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)大瀧六線魚血漿、體表粘液、肝臟組織及肝細(xì)胞培養(yǎng)液中的卵黃原蛋白，檢測(cè)范圍為15.625～1000ngmL-1，為我國(guó)近岸海域內(nèi)分泌干擾物的檢測(cè)提供了重要工具。
【專利說明】大瀧六線魚卵黃原蛋白間接ELISA試劑盒及其制備方法、 檢測(cè)方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生態(tài)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的間接 ELISA試劑盒及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 持久性有機(jī)污染物（(Persistent Organic Pollutants, POPs)，是指在環(huán)境中難 以分解，能夠在環(huán)境中長(zhǎng)期存在，可以通過各種傳輸途徑而進(jìn)行全球尺度的遷移擴(kuò)散，通過 食物鏈在生物體內(nèi)累積放大，對(duì)人體和環(huán)境產(chǎn)生毒性影響的一類有機(jī)污染物。這些污染物 并不是自然界本身就存在的，而是人類工業(yè)革命帶來的產(chǎn)物.持久性有機(jī)污染物給人類和 環(huán)境帶來的危害已經(jīng)成為全球性問題。為了解決這一問題，聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署（UNEP)和瑞 典政府于2001年5月23日在瑞典的斯德哥爾摩聯(lián)合主持召開全權(quán)代表會(huì)議，簽署了旨在 禁止和/或限制使用12類持久性有機(jī)污染物的《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公 約》。POPs具有下列四個(gè)重要的特性：（1)能夠在環(huán)境中持久地存在；（2)能夠經(jīng)過長(zhǎng)距 離遷移到達(dá)偏遠(yuǎn)的極低地區(qū)。（3)在一定的濃度下會(huì)對(duì)接觸該物質(zhì)的生物造成有害或有毒 影響，POPs大都具有"三致(致癌、致畸、致突變)"效應(yīng)；(4)能蓄積在食物鏈中，對(duì)有較高 營(yíng)養(yǎng)等級(jí)的生物造成影響。由于POPs具有低水溶性、高脂溶性的特點(diǎn)，導(dǎo)致POPs從周圍媒 介中富集到生物體內(nèi)，并通過食物鏈的生物放大作用達(dá)到中毒濃度。
[0003] POPs在海洋環(huán)境中難降解、分布廣、易在生物體內(nèi)富集，對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害性很 大，POPs不僅影響到海洋生物的棲息與繁殖，通過食物鏈的傳遞，也給人類自身生存和生活 造成威脅。各項(xiàng)研究顯示POPs濃度水平并不很高，但是由于其生物富集性可通過食物鏈傳 遞富集，使得處于食物鏈越高的生物受到的威脅越大。在海洋環(huán)境和其他水生生態(tài)系統(tǒng)中， POPs的傳播鏈?zhǔn)牵嚎諝庵械腜OPs最初是被微生物吸收一較大生物吃微小生物一小魚食用 較大生物一大魚吃小魚一有時(shí)是鳥類或人類食用大魚。食肉類物種體內(nèi)的POPs含量將會(huì) 達(dá)到其捕食對(duì)象體內(nèi)POPs平均含量的10倍之多。這導(dǎo)致了在最高端食肉物種體內(nèi)極高的 POPs含量。根據(jù)環(huán)境加拿大（Environment Canada)組織的報(bào)告，食用魚類的鳥蛋中POPs 污染物達(dá)到魚類本身生活的水中POPs含量的2500萬倍。而位于生物鏈頂端的人類，則又 把這些毒性放大了 7萬倍。
[0004] 當(dāng)前急需全面提升海洋POPS實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、預(yù)警能力，對(duì)海水養(yǎng)殖的污染源進(jìn)行研 究，探討魚類飼料、人類活動(dòng)及環(huán)境因素等對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量的影響，為海水養(yǎng)殖產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān) 控和海域環(huán)境的管理提供科學(xué)依據(jù)。因此建立起快速、高效、大通量針對(duì)POPs特別是新增 加種類污染物的有效檢測(cè)方法是加強(qiáng)和完善對(duì)環(huán)境中POPs的檢測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)控制管理的前提 和基礎(chǔ)。研究表明，大多數(shù)POPs具有環(huán)境雌激素效應(yīng)，是環(huán)境雌激素類似物，因此可以將環(huán) 境雌激素生物檢測(cè)方法用于POPs的生物檢測(cè)。
[0005] 美國(guó)、歐盟和日本相繼建立起以魚類為模式生物的環(huán)境雌激素篩選評(píng)價(jià)體系，其 中卵黃原蛋白（Vitellogenin, Vtg)作為重要的生物篩選指標(biāo)，已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。魚類卵 黃原蛋白是卵黃蛋白的前體，是一種大分子量的脂磷聚糖蛋白。卵黃形成期，在雌激素的刺 激下卵黃原蛋白由肝臟合成，并通過血液運(yùn)輸?shù)桨l(fā)育的卵巢中，被卵巢吸收；通常，卵黃原 蛋白只能在卵黃形成期的雌魚體內(nèi)檢測(cè)到，但是，雄魚和幼魚體內(nèi)也含有卵黃原蛋白基因， 在環(huán)境雌激素的誘導(dǎo)下，也能合成和分泌卵黃原蛋白。因此，卵黃原蛋白是環(huán)境雌激素篩選 的特異性生物標(biāo)志物，通過檢測(cè)雄魚體內(nèi)卵黃原蛋白水平可以評(píng)價(jià)環(huán)境化學(xué)物的雌激素活 性。然而，至今我國(guó)還未見海洋環(huán)境POPS生物監(jiān)測(cè)技術(shù)的研發(fā)。
[0006] 卞J仇六致魚{Hexagrammos otakii Jordan et Starks )又名敗式六致魚， 俗稱黃魚，隸屬于鈾形目（Scorpaeniformes)、六線魚科（Hexagrammidae)、六線魚屬 。大瀧六線魚屬冷溫性近海底層魚類，在我國(guó)主要分布于黃海和渤海沿岸多 巖礁海區(qū)，在青島等近海水域中容易捕獲。因此，以黃渤海常見魚種大瀧六線魚為實(shí)驗(yàn)生 物，建立其卵黃原蛋白的定量檢測(cè)技術(shù)，有助于開展我國(guó)近岸海域POPs生物監(jiān)測(cè)工作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的間接ELISA 試劑盒及其制備方法、檢測(cè)方法和應(yīng)用，以滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述要求。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下： 本發(fā)明提供的檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒，包括一個(gè)盒體，空白 96孔酶標(biāo)板1塊，包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終止劑和辣根過氧化物酶 標(biāo)記的羊抗兔二抗各1支，其特征在于它還裝有大瀧六線魚卵黃原蛋白純品1支、兔抗大 瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體1支。
[0009] 所述的包被液為50mM pH 9. 6碳酸鹽緩沖液：1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3，加蒸餾 水至 IOOOml ; 洗滌液為含〇.〇5%1?6611-20的15〇1111?117.4磷酸鹽緩沖液：8.(^似(：1，0.2 81((：1，2.98Na2HPO4 ? 12H20,0. 2g KH2PCM, 0? 5 ml Tween-20,加蒸餾水至 IOOOml ; 封閉液為含2% BSA的pH7. 4磷酸鹽緩沖液：0. 2g BSA溶于IOml pH7. 4的磷酸緩沖液 中； 樣品稀釋液為含〇. 05% Tween-20、1% BSA的150mM磷酸鹽緩沖液，pH 7. 4 :0. Ig BSA 溶于IOml洗滌液； 顯色液為北京諾博萊德科技有限公司生產(chǎn)的TMB單組分顯色液； 終止劑為2M的H2SO4水溶液。
[0010] 本發(fā)明還提供上述定量檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒的制備 方法，其特征包括以下步驟：1)制備大瀧六線魚卵黃原蛋白純品；2)利用步驟1)得到的大 瀧六線魚卵黃原蛋白純品制備兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體；3)將步驟1)得到 的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品1支、步驟2)得到的兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體 1支、以及包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊 抗兔二抗各1支放入盒內(nèi)，得到檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒。
[0011] 所述的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品的制備方法如下： 采用肌肉注射17，-雌二醇（17，-estradi〇l，E2)的方式誘導(dǎo)大瀧六線魚產(chǎn)生卵黃原 蛋白；注射一周后取血，4°C，5000 g離心10分鐘，收集上清液；向上清中加入等體積的飽和 硫酸銨溶液，冰浴條件下?lián)u晃2小時(shí)后離心，向沉淀中加入pH 7.5的25mM Tris-HCl，使 沉淀重新溶解；進(jìn)一步的純化采用1. 510 cm的Sephadex G-200層析柱，加入I ml上述 溶液，用pH 7.5的25mM Tris-HCl洗層析柱，收集第一個(gè)洗脫峰，即為大瀧六線魚卵黃原蛋 白。
[0012] 所述的兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體的制備方法如下： 取600 y g純化的大瀧六線魚卵黃原蛋白，加入等體積的弗氏完全佐劑，對(duì)大白兔進(jìn)行 背部皮下多點(diǎn)注射，兩周后再次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為600i! g/只，用弗氏不完全佐劑充分 乳化后進(jìn)行背部皮下注射；此后，每隔7天按以上方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫；于每5次注射5天后 從心臟取血，6000 g離心20分鐘，收集上清，獲得了兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗 血清；向抗血清中加入等體積的PH 7. 4 0. 02 mol/L磷酸緩沖液；在冰浴條件下加入硫酸 銨，至50%飽和度，(TC震蕩2h后，低溫離心，8000 g、15min，棄上清，沉淀用IOml 0. 02mol/ L磷酸緩沖液溶解；以0. 02mol/L磷酸緩沖液透析24h ;用0. 45微米孔徑的濾膜過濾后，上 Hitrap Protein G柱，隨后以0. 02 mol/L磷酸緩沖液洗脫10個(gè)柱體積，然后以0. IM甘氨 酸（pH2. 7)洗脫抗體，即獲得兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種利用所述的間接ELISA試劑盒檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白 的方法，包括以下步驟： 1) 用包被液稀釋試劑盒中的大瀧六線魚卵黃原蛋白至200 ng/L，在空白96孔酶標(biāo)板 中加入100 Ul/孔，4°C包被過夜，或者37°C下孵育2小時(shí)；棄去孔內(nèi)溶液，洗滌3次； 2) 在96孔酶標(biāo)板中加入封閉液，300 y L/孔，室溫下孵育1小時(shí)；棄去孔內(nèi)溶液，洗滌 3次； 3) 在96孔酶標(biāo)板中加入用樣品稀釋液稀釋了的大瀧六線魚卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè) 樣品50 y L/孔，并在每孔加入50 y L用樣品稀釋液1:5000倍稀釋的兔抗大瀧六線魚卵黃 原蛋白抗體，37°C下孵育2小時(shí)；棄去孔內(nèi)溶液，洗滌5次； 4) 在96孔酶標(biāo)板中加入用樣品稀釋液1:2000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔 二抗，100 U L/孔，室溫孵育1小時(shí)；棄去孔內(nèi)溶液，洗滌5次； 5) 在96孔酶標(biāo)板中加入新鮮配制的顯色液，IOOii L/孔，于室溫暗處37 °C反應(yīng) IOmin ； 6) 待呈現(xiàn)黃色后加終止劑，50 y L/孔； 7) 用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)下各孔的吸光值，測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn) 行； 8) 計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲 線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再 乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
[0014] 本發(fā)明的定量檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的試劑盒可以應(yīng)用在海洋內(nèi)分泌擾亂 化學(xué)物質(zhì)調(diào)查與篩選中。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明的試劑盒利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合能力，可靈敏、準(zhǔn)確、方便地檢測(cè) 大瀧六線魚血漿中、體表粘液、肝臟組織和肝細(xì)胞培養(yǎng)液中的卵黃原蛋白，其檢測(cè)范圍為 15. 625?1000 ng/ml，為內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)篩選、檢測(cè)和生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供了一個(gè) 有效的手段。
[0016]目前，國(guó)內(nèi)外尚未見大瀧六線魚卵黃原蛋白的純化與檢測(cè)技術(shù)報(bào)告，本申請(qǐng)首次 建立了六線魚卵黃原蛋白的純化方案，較其它魚類卵黃原蛋白的純化方案更加省時(shí)、操作 簡(jiǎn)便，還極大提高了純化蛋白的濃度，本發(fā)現(xiàn)的試劑盒利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合能 力，能夠靈敏、方便地定量檢測(cè)大瀧六線魚在不同污染物暴露下體內(nèi)卵黃原蛋白的生成水 平，為評(píng)價(jià)我國(guó)近岸海域的環(huán)境雌激素效應(yīng)提供了快捷的手段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明的試劑盒對(duì)大瀧六線魚卵黃原蛋白純品的檢測(cè)結(jié)果； 圖2為本發(fā)明的試劑盒對(duì)雌/雄大瀧六線魚血漿的檢測(cè)結(jié)果。
[0018]

【具體實(shí)施方式】： 實(shí)施例1 制備檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒分為以下步驟： (1)卵黃原蛋白的分離純化 采用肌肉注射17，-雌二醇（17，-estradi〇l，E2)的方式誘導(dǎo)大瀧六線魚產(chǎn)生卵黃原 蛋白。注射一周后取血，4°C，5000 g離心10分鐘，收集上清液；向上清中加入等體積的飽和 硫酸銨溶液，冰浴條件下?lián)u晃2小時(shí)后5000 g離心10分鐘，向沉淀中加入25mM Tris-HCl (pH 7. 5)，使沉淀重新溶解。進(jìn)一步的純化采用Sephadex G-200層析柱（1.5〃 20 cm),力口 入I ml上述溶液，用25mM Tris-HCl (pH 7. 5)以流速0.3 ml/min沖洗層析柱，收集第一 個(gè)洗脫峰，即為大瀧六線魚卵黃原蛋白。
[0019] (2)大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體的制備 取600 y g純化的大瀧六線魚卵黃原蛋白，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化后對(duì) 新西蘭大白兔進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射〇. lml，兩周后再次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為 600 U g/只，用弗氏不完全佐劑充分乳化后進(jìn)行背部皮下注射。此后，每隔7天按以上方法 進(jìn)行加強(qiáng)免疫。于每5次注射5天后從心臟取血，6000r/min離心20分鐘，收集上清，獲得了 兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗血清?？贵w的純化分為以下幾步，上樣前向多克隆抗 血漿中加入1/3左右的對(duì)照陰性樣品（雄魚勻漿液），低溫振蕩2h，4°C過夜，次日離心取上 清；向上清中加入等體積的〇.〇2 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4);在冰浴條件下加入硫酸銨， 至50%飽和度，0°C震蕩2h后，低溫離心（8000rpm, 15min)，棄上清，沉淀用IOml 0.02mol/ L磷酸緩沖液溶解；以0. 02mol/L磷酸緩沖液透析24h，其間換液4次；用0. 45微米孔徑的 濾膜過濾后，上Hitrap Protein G柱，隨后以0. 02mol/L磷酸緩沖液洗脫10個(gè)柱體積，然 后以〇. IM甘氨酸（pH2. 7)洗脫抗體，即獲得兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體。
[0020] (3)將制備的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品1支、兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克 隆抗體1支、空白96孔酶標(biāo)板一塊，以及包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終止 液和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗1支裝入盒體內(nèi)，構(gòu)成本發(fā)明的試劑盒。其具體組 成如下： 1) 1)空白96孔酶標(biāo)板1塊； 2) 大瀧六線魚卵黃原蛋白純品1支，使用前用樣品稀釋液稀釋到所需濃度； 3) 兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體1支，使用前用包被液按1:5000的體積比 稀釋； 4) 辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗1支，使用前用樣品稀釋液按1:2000的體積比 稀釋； 5) 包被液、洗滌液、封閉液、樣品稀釋液、顯色液、終止劑各1支， 所述的包被液為50mM pH 9. 6碳酸鹽緩沖液：1.59g Na2C03,2. 93g NaHCO3，加蒸餾水至 1000ml ； 洗滌液為含 〇. 05% Tween-20 的 150mM pH7. 4磷酸鹽緩沖液：8. Og NaCl，0. 2g KC1，2. 9g Na2HPO4 ? 12H20,0. 2g KH2P04, 0? 5 ml Tween-20,加蒸餾水至 1000ml ; 封閉液為含2% BSA的pH7. 4磷酸鹽緩沖液：0. 2g BSA溶于IOml pH7. 4的磷酸緩沖液 中； 樣品稀釋液為含〇. 05% Tween-20、1% BSA的150mM磷酸鹽緩沖液，pH 7. 4 :0. Ig BSA 溶于IOml洗滌液； 顯色液為北京諾博萊德科技有限公司生產(chǎn)的TMB單組分顯色液； 終止劑為2M的H2SO4水溶液。
[0021] 實(shí)施例2 本發(fā)明的檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒可用于海洋內(nèi)分泌擾亂化 學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)。檢測(cè)卵黃原蛋白的方法分為以下步驟： 1)用包被液稀釋試劑盒中的大瀧六線魚卵黃原蛋白至200 ng/L，在空白96孔酶標(biāo)板 中加入100 Ul/孔，4°C包被過夜，或者37°C下孵育2小時(shí)。棄去孔內(nèi)溶液，洗滌3次。
[0022] 2)在96孔酶標(biāo)板中加入封閉液，300 ii L/孔，室溫下孵育1小時(shí)。棄去孔內(nèi)溶液， 洗漆3次。
[0023] 3)在96孔酶標(biāo)板中加入用樣品稀釋液稀釋了的大瀧六線魚卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、 待測(cè)樣品50 y L/孔，并在每孔加入50 y L用樣品稀釋液1:5000倍稀釋的兔抗大瀧六線魚 卵黃原蛋白抗體，37°C下孵育2小時(shí)。棄去孔內(nèi)溶液，洗滌5次。
[0024] 4)在96孔酶標(biāo)板中加入用樣品稀釋液1:2000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊 抗兔二抗，1〇〇 UL/孔，室溫孵育1小時(shí)。棄去孔內(nèi)溶液，洗滌5次。
[0025] 5)在96孔酶標(biāo)板中加入新鮮配制的顯色液，IOOii L/孔，于室溫暗處37°C反應(yīng) IOmin0
[0026] 6)待呈現(xiàn)明顯的黃色后加終止劑，50 y L/孔。
[0027] 7)用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)下各孔的吸光值，測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi) 進(jìn)行。
[0028] 8)計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo) 準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃 度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃 度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。具體結(jié)果參見圖1。
[0029] 實(shí)施例3本發(fā)明ELISA試劑盒對(duì)雌/雄大瀧六線魚血漿的檢測(cè) 采用肌肉注射17，-雌二醇（17，-estradi〇l，E2)的方式誘導(dǎo)大瀧六線魚產(chǎn)生卵黃原 蛋白。注射一周后取血，對(duì)血漿進(jìn)行逐步稀釋后；采用實(shí)施例2的方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，具體 結(jié)果參見圖2. 實(shí)施例4最低檢測(cè)限的確定 取大瀧六線魚卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度為l〇ng/ml，逐步稀釋至5、2. 5、1. 25、0. 625、 0. 312和0. 156ng/ml，采用實(shí)施例2的方法對(duì)各濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度設(shè)置2個(gè)復(fù) 孔，空白孔加入與標(biāo)準(zhǔn)品組等量的樣品稀釋液做為對(duì)照，以測(cè)得的P/N值大于2. 1時(shí)的最低 濃度做為最低檢測(cè)限，經(jīng)檢測(cè)，本發(fā)明ELISA試劑盒的最低檢測(cè)限為2. 5ng/ml。
[0030] 實(shí)施例5樣品稀釋液組成的確定 樣品稀釋液一共分成5組，第1組：0. 15M的PBS ;第2組：PBST(0. 15M的PBS， 含 tween-20 0.05%，pH 7.4);第 3 組：PBST (0? 15M 的 PBS，含 tween-20 0.05%，pH 7. 4)+l%BSA ;第 4 組：PBST(0. IOM 的 PBS，含 tween-20 0? 05%，pH 7. 4)+l%BSA ;第 5 組：PBST(0.20M 的 PBS，含 tween-20 0.05%，pH 7.4)+l%BSA，用濃度為 20ng/ml 的大瀧六線 魚卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)(方法參見實(shí)施例2)，根據(jù)P/N值確定最佳的樣品稀釋液，具 體結(jié)果如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒，包括一個(gè)盒體，盒體內(nèi)有空 白96孔酶標(biāo)板1塊，封閉液、包被液、洗滌液、樣品稀釋液、顯色液、終止液和辣根過氧化物 酶標(biāo)記的羊抗兔二抗各1支，其特征在于該盒體還裝有：大瀧六線魚卵黃原蛋白純品1支， 兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體1支。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒，其特征在 于： 洗滌液為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)是〇. 05% Tween-20的150mM pH7. 4的磷酸鹽緩沖液； 封閉液為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)是2% BSA的pH7. 4的磷酸鹽緩沖液； 樣品稀釋液為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)是〇. 05% Tween-20、1% BSA的150mM磷酸鹽緩沖液； 顯色液為TMB單組分顯色液； 終止劑為2M的H2S04水溶液。
3. 制備權(quán)利要求1所述的檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒的方法，其 特征在于，包括下列步驟： 1) 制備大瀧六線魚卵黃原蛋白純品； 2) 利用步驟1)得到的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品制備兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多 克隆抗體； 3) 將步驟1)得到的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品1支、步驟2)得到的兔抗大瀧六線魚 卵黃原蛋白多克隆抗體1支、以及包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液及 辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗各1支放入盒內(nèi)，得到檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的間 接ELISA試劑盒。
4. 如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒的制備方法， 其特征在于，所述的大瀧六線魚卵黃原蛋白純品的制備方法如下： 采用肌肉注射17，-雌二醇（17，-estradi〇l，E2)的方式誘導(dǎo)大瀧六線魚產(chǎn)生卵黃原 蛋白；注射一周后取血，4°C，5000 g離心10分鐘，收集上清液；向上清中加入等體積的飽和 硫酸銨溶液，冰浴條件下?lián)u晃2小時(shí)后離心，向沉淀中加入pH 7. 5的25mM Tris-HCl，使 沉淀重新溶解；進(jìn)一步的純化采用1.510 cm的Sephadex G-200層析柱，加入1 ml上述 溶液，用pH 7.5的25mM Tris-HCl洗層析柱，收集第一個(gè)洗脫峰，即為大瀧六線魚卵黃原蛋 白。
5. 如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒，其特征在于， 所述的兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體的制備方法如下： 取600 y g純化的大瀧六線魚卵黃原蛋白，加入等體積的弗氏完全佐劑，對(duì)大白兔進(jìn)行 背部皮下多點(diǎn)注射，兩周后再次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為600 yg/只，用弗氏不完全佐劑充分 乳化后進(jìn)行背部皮下注射；此后，每隔7天按以上方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫；于每5次注射5天后 從心臟取血，6000 g離心20分鐘，收集上清，獲得了兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗 血清；向抗血清中加入等體積的PH 7. 4 0.02 mol/L磷酸緩沖液；在冰浴條件下加入硫酸 銨，至50%飽和度，0°C震蕩2h后，低溫離心，8000 g、15min，棄上清，沉淀用10ml 0. 02mol/ L磷酸緩沖液溶解；以0. 02mol/L磷酸緩沖液透析24h ;用0. 45微米孔徑的濾膜過濾后，上 Hitrap Protein G柱，隨后以0. 02 mol/L磷酸緩沖液洗脫10個(gè)柱體積，然后以0. 1M甘氨 酸（pH2. 7)洗脫抗體，即獲得兔抗大瀧六線魚卵黃原蛋白多克隆抗體。
6. 利用權(quán)利要求1所述的間接ELISA試劑盒檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的方法，其特 征在于，包括以下步驟： 1) 用包被液稀釋試劑盒中的大瀧六線魚卵黃原蛋白至200 ng/L，在空白96孔酶標(biāo)板 中加入100 yl/孔，4°C包被過夜，或者37°C下孵育2小時(shí)；棄去孔內(nèi)溶液，洗滌3次； 2) 在96孔酶標(biāo)板中加入封閉液，300 y L/孔，室溫下孵育1小時(shí)；棄去孔內(nèi)溶液，洗滌 3次； 3) 在96孔酶標(biāo)板中加入用樣品稀釋液稀釋了的大瀧六線魚卵黃原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè) 樣品50 y L/孔，并在每孔加入50 y L用樣品稀釋液1:5000倍稀釋的兔抗大瀧六線魚卵黃 原蛋白抗體，37°C下孵育2小時(shí)；棄去孔內(nèi)溶液，洗滌5次； 4) 在96孔酶標(biāo)板中加入用樣品稀釋液1:2000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔 二抗，100 y L/孔，室溫孵育1小時(shí)；棄去孔內(nèi)溶液，洗滌5次； 5) 在96孔酶標(biāo)板中加入新鮮配制的顯色液，lOOiiL/孔，于室溫暗處37 °C反應(yīng) lOmin ； 6) 待呈現(xiàn)黃色后加終止劑，50 y L/孔； 7) 用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)下各孔的吸光值，測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn) 行； 8) 計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，0D值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲 線，根據(jù)樣品的0D值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 0D值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的0D值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再 乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
7. 權(quán)利要求1所述的檢測(cè)大瀧六線魚卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒，在海洋環(huán)境雌 激素類物質(zhì)篩選與內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)研究中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/74GK104360075SQ201410644632
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】王松, 王駿, 張鐵軍, 冷凱良, 苗鈞魁, 姜勇, 羅忻, 吳振興 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所