本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種石斑魚神經(jīng)壞死病毒Coat基因、在大腸桿菌中表達(dá)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

魚類病毒性神經(jīng)壞死病(viral nervous necrosis，VNN)，是世界范圍的一種魚類流行性傳染病，對(duì)仔魚和幼魚危害極大，嚴(yán)重者在一周內(nèi)死亡率可達(dá)100％。由于其極高的傳染性和危害性，被國(guó)際獸醫(yī)組織(OIE)列為重要的魚類病害(OIE，2001)。目前，該病在除非洲以外的國(guó)家和地區(qū)迅速蔓延，受感染的魚類已達(dá)40余種，給各國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的危害。導(dǎo)致該傳染病的致病原為神經(jīng)壞死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)，它屬于諾達(dá)病毒科(Nodaviridae)中的β-諾達(dá)病毒屬，是一種小RNA病毒。

石斑魚是目前海水養(yǎng)殖魚類中的高檔優(yōu)質(zhì)魚類。隨著我國(guó)石斑魚人工育苗技術(shù)的成熟和斜帶石斑魚苗種產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，成為重要的海水魚類養(yǎng)殖品種。但這幾年石斑魚苗種期頻繁發(fā)生神經(jīng)壞死病毒病，引發(fā)苗種大量死亡，育苗成活率只有3～5％，有時(shí)不到1％，甚至全軍覆沒，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失外還常常導(dǎo)致苗種供不應(yīng)求，影響?zhàn)B成生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者從化學(xué)藥物、生物疫苗、RNA干擾(RNAi)及養(yǎng)殖模式等方面對(duì)該病的防治進(jìn)行了大量的研究，但是到目前為止仍然沒有找到有效的防治措施。

對(duì)于魚類的病毒病，最有效、安全且無環(huán)境副作用的首選免疫保護(hù)方法即疫苗的使用。經(jīng)過疫苗的保護(hù)，養(yǎng)殖魚類抵抗了各種病毒的侵染，使得集約化和工廠化的高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展成為可能。目前進(jìn)口水產(chǎn)疫苗產(chǎn)品多來源于真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)亞單位疫苗，價(jià)格昂貴，生產(chǎn)能力和銷售價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足中國(guó)市場(chǎng)需求，不適合于我國(guó)海水養(yǎng)殖生產(chǎn)中推廣，而國(guó)內(nèi)目前還沒有可用的石斑魚神經(jīng)壞死病毒的疫苗產(chǎn)品。

傳統(tǒng)疫苗(減毒疫苗、滅活疫苗)存在安全性和保護(hù)效果差的缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)傳統(tǒng)疫苗的不足，提供一種通過基因工程手段研發(fā)的重組蛋白和重組DNA技術(shù)的新一代疫苗克服了傳統(tǒng)疫苗的種種缺陷，本發(fā)明旨在提出一種石斑魚神經(jīng)壞死病毒Coat基因、在大腸桿菌中表達(dá)方法及應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種石斑魚神經(jīng)壞死病毒Coat基因，其序列全長(zhǎng)為1433bp，核苷酸序列如SIDNO:1。

本發(fā)明的再一個(gè)目的在于公開了一種石斑魚神經(jīng)壞死病毒Coat蛋白，其氨基酸序列如SID NO:2，全長(zhǎng)為338aa，由上述的石斑魚神經(jīng)壞死病毒Coat基因通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)得到。

石斑魚神經(jīng)壞死病毒Coat基因全長(zhǎng)1433bp，包括26bp的5’非翻譯區(qū)(1-26bp)、1017bp的開放閱讀框(27-1043bp)和390bp的3’非翻譯區(qū)(1044-1433bp)，編碼338個(gè)氨基酸；，序列中雙下劃線標(biāo)示的atg為起始密碼子，單下劃線標(biāo)示的taa為終止密碼子。

本發(fā)明又一個(gè)目的在于上述的Coat蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)的方法，包括重組載體的構(gòu)建、重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞、菌種保存、誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定。

優(yōu)選的，所述表達(dá)載體為pET30a，所述感受態(tài)細(xì)胞為BL21(DE3)。

優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)表達(dá)的具體方法如下：

步驟1：取陽(yáng)性克隆按1：100比例接種到含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于搖床中37℃*200rpm生長(zhǎng)過夜；

步驟2：第二天將上述菌液按1:100比例接種到含50μg/mL硫酸卡那霉素抗性的2L TB培養(yǎng)基中，放入搖床中37℃*200rpm生長(zhǎng)至OD₆₀₀＝0.6-0.8時(shí)，將搖床溫度降至15-25℃，1-3h后加入終濃度0.10-0.30mM IPTG誘導(dǎo)生長(zhǎng)16h；

步驟3：將誘導(dǎo)后的菌液于4℃*8000rpm離心15min棄上清，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液PBS重懸并重復(fù)離心過程以清洗菌體；放置于-20℃保存。

優(yōu)選的，所的重組載體轉(zhuǎn)化的具體方法如下：

步驟1：從-80℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，并將其迅速置于冰水中，在冰上融化2-5min；

步驟2：融解后輕彈管壁1-2次以重懸細(xì)胞；將約100ng的表達(dá)載體質(zhì)粒DNA直接加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕微搖動(dòng)混和隨后置于冰水浴上30min；

步驟3：取出后放入水浴鍋中：42℃，熱激90s，熱激完迅速放回冰水浴中3min；拿出后取200μL無抗性的LB液體培養(yǎng)基加入到已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞中；

步驟4：放入搖床中37℃*195rpm生長(zhǎng)1h，吸取50μL-80μL懸液均勻涂布含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板上，倒置、37℃培養(yǎng)過夜。

優(yōu)選的，所述的菌株的保存及誘導(dǎo)表達(dá)的具體方法如下：

步驟1：從轉(zhuǎn)化平板中挑取單克隆，加入4mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中；

步驟2：37℃*200rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.5-0.8，2-3小時(shí)；無菌條件下取出生長(zhǎng)過程中樣品測(cè)定OD₆₀₀值；

步驟3：取管中0.9mL的菌液與0.1mL80％無菌甘油混合，存于－80℃冰箱中；

步驟4：向試管培養(yǎng)液中加入終濃度0.375mM IPTG，放置37℃誘導(dǎo)4h。

優(yōu)選的，所述鑒定采用SDS-PAGE和電鏡觀察法。

本發(fā)明的再一個(gè)目的在于公開一種抗石斑魚神經(jīng)壞死病毒的疫苗，含有上述石斑魚神經(jīng)壞死病毒Coat蛋白或其任意混合物。

本發(fā)明的最好一個(gè)目的在于公開一種上述的石斑魚神經(jīng)壞死病毒Coat基因在抗石斑魚神經(jīng)壞死病毒中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明通過石斑魚神經(jīng)壞死病毒Coat基因的獲得，填補(bǔ)了石斑魚神經(jīng)壞死病毒Coat基因研究的空缺。同時(shí)根據(jù)石斑魚神經(jīng)壞死病毒Coat基因序列可以人工合成或轉(zhuǎn)基因生物合成具有生物活性的重組蛋白，有助于我們了解石斑魚神經(jīng)壞死病毒基因制備疫苗，基因工程疫苗使用還可以大幅度降低養(yǎng)殖生產(chǎn)中藥物的使用量，從根本上消除水產(chǎn)品的藥物殘留隱患，為消費(fèi)者提供健康優(yōu)質(zhì)的綠色水產(chǎn)品。

本發(fā)明蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)過程中對(duì)溫度、轉(zhuǎn)速、IPTG的濃度和時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，誘導(dǎo)時(shí)溫度為15-25℃、IPTG濃度為0.10-0.30mM、誘導(dǎo)時(shí)間為16h，可增加重組蛋白的溶解性，有利于蛋白折疊形成正確的構(gòu)型，從而具有生物學(xué)活性。

附圖說明

附圖1為SDS-PAGE分析Coat蛋白于BL21(DE3)表達(dá)情況；

Lane M：SDS-PAGEProtein marker；Lane 0：對(duì)照；Lane 1:15℃誘導(dǎo)過夜；Lane 2:37℃誘導(dǎo)4h；

附圖2為電鏡觀察比較VLP與NNV病毒結(jié)構(gòu)，(A)為NNV病毒結(jié)構(gòu)，(B)為VLP蛋白結(jié)構(gòu)；

附圖3為SDS-PAGE分析Coat蛋白上清純化結(jié)果；

Lane M：SDS-PAGEProtein marker；Lane 1：全菌破菌離心后上清；Lane 2：上清同Ni-IDA孵育后流出液；Lane 3-4：50mM咪唑的BufferA(不含TritonX-100)洗脫液；Lane 5-6：100mM咪唑的BufferA(不含TritonX-100)洗脫液；Lane 7-10：300mM咪唑的BufferA(不含TritonX-100)洗脫液；Lane 11-12：500mM咪唑的BufferA(不含TritonX-100)洗脫液；

附圖4為Coat蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線；

附圖5為抗體檢測(cè)效果曲線。

具體實(shí)施方式

下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)

人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)施例1：石斑魚神經(jīng)壞死病毒Coat基因設(shè)計(jì)與優(yōu)化采用德泰生物最新開發(fā)的密碼子優(yōu)化軟件Max Codon TMO ptimization Program(V13)，目標(biāo)蛋白Coat最終優(yōu)化的結(jié)果，其序列全長(zhǎng)為1433bp，其核苷酸序列如SIDNO:1。

實(shí)施例2：石斑魚神經(jīng)壞死病毒Coat蛋白表達(dá)與純化

1、Coat蛋白表達(dá)與鑒定

1.1表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化

步驟1：從-80℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，并將其迅速置于冰水中，在冰上融化2-5min。

步驟2：融解后輕彈管壁1-2次以重懸細(xì)胞。將約100ng的表達(dá)載體質(zhì)粒DNA直接加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕微搖動(dòng)混和隨后置于冰水浴上30min(此時(shí)可以準(zhǔn)備42℃水浴鍋)。

步驟3：取出后放入水浴鍋中(42℃)，熱激90s；熱激完迅速放回冰水浴中3min；拿出后取200μL無抗性的LB液體培養(yǎng)基加入到已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞中。

步驟4：放入搖床(37℃*195rpm)中生長(zhǎng)1h，吸取50μL-80μL懸液均勻涂布含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板中，倒置、37℃培養(yǎng)過夜。

1.2菌株的保存及誘導(dǎo)表達(dá)

步驟1：從轉(zhuǎn)化平板中挑取3個(gè)單克隆，加入4mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，編號(hào)為標(biāo)記為“0”“1”“2”。

步驟2：37℃*200rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀約為0.5-0.8(通常需要2－3小時(shí))。生長(zhǎng)過程中無菌條件下取出樣品測(cè)定OD₆₀₀值。

步驟3：取“1”“2”號(hào)管中各0.9mL的菌液與0.1mL80％無菌甘油混合，存于－80℃冰箱中。

步驟4：向試管培養(yǎng)液中加入終濃度0.375mM IPTG(“0”對(duì)照組不加IPTG)，通?！?”“1”放置15℃誘導(dǎo)過夜，“2”放置37℃誘導(dǎo)4h。

1.3SDS-PAGE鑒定誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

步驟1.分別取“0”“1”“2”試管中各400-600μL培養(yǎng)液12000rpm*10min*4℃離心，去除上清液，加入500μL ddH₂O重懸菌體，并再次12000rpm*10min*4℃離心，去除上清液。

步驟2.加入50μL的磷酸鹽緩沖液(PBS)混合以重懸沉淀。

步驟3.加入50μL的2×SDS上樣緩沖液迅速在100℃加熱樣品15min使蛋白變性，然后12000rpm*5min*4℃離心取上清電泳。電泳前10min100V穩(wěn)壓電泳，待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，200V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍(lán)帶遷移至離凝膠底部1cm，取出凝膠用考馬斯亮蘭染色液染色，隨后轉(zhuǎn)入脫色液中，脫色至背景清晰。如圖1所述。

1.4電鏡觀察蛋白形態(tài)

取神經(jīng)壞死病毒NNV與表達(dá)出的蛋白VLP制片，并于電鏡下觀察兩者形態(tài)如圖2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者大小和形態(tài)極為相似。

1.5Coat蛋白放大培養(yǎng)

步驟1：取“1”和“2”保種的菌種按1:100比例接種到含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于搖床中(37℃*200rpm)生長(zhǎng)過夜

步驟2：第二天將上述菌液按1:100比例接種到含50μg/mL卡那霉素抗性的2L TB培養(yǎng)基中，放入搖床中(37℃*200rpm)生長(zhǎng)至OD₆₀₀＝0.6～0.8時(shí)，將搖床溫度降至15-25℃，約1-3h后加入終濃度0.10-0.30mM IPTG誘導(dǎo)生長(zhǎng)16h

步驟3：將誘導(dǎo)后的菌液于4℃*8000rpm離心15min棄上清，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液PBS重懸并重復(fù)離心過程以清洗菌體；放置于-20℃保存。(如果收菌當(dāng)天不純化的話，放置于-20℃)

2、Coat蛋白純化

2.1Coat蛋白上清純化(整個(gè)純化過程在低溫下操作)

步驟1：用BufferA：50mMTris，150mM NaC，1mM DTT，1％TritonX-100，1μg/mL Pepstatin A，1μg/mL Leupeptin，20mM咪唑，pH8.0重懸菌泥(通常裂解液用量為10-15mL/g菌泥)

步驟2：超聲裂解，用500W功率，在冰浴中進(jìn)行超聲，每超聲3s，間歇6s，總計(jì)15min，結(jié)束在顯微鏡下觀察破碎結(jié)果。(根據(jù)破碎結(jié)果可適當(dāng)調(diào)節(jié)破碎時(shí)間)

步驟3：13000rpm*30min*4℃離心保留上清，并用0.45um濾膜過濾

步驟4：用BufferB:50mM Tris，150mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0平衡3mL Ni-IDA柱，平衡約5-10CV直至紫外示數(shù)達(dá)到基線

步驟5：將3步過濾的上清同平衡后的Ni-IDA柱混合后置于旋轉(zhuǎn)混合儀上于4℃孵育60-80min

步驟6：用一空的層析柱截留含有Coat蛋白的Ni-IDA柱，并用Buffer B沖洗10-20CV，流速控制在1.0mL/min，直至紫外示數(shù)達(dá)到基線

步驟7：用分別含有50mM、100Mm、300mM咪唑以及500mM咪唑的Buffer B洗脫目標(biāo)蛋白，流速控制在1.5mL/min，并收集每個(gè)咪唑梯度的洗脫液組分

步驟8：取每個(gè)組分20μL加入20μL的2×SDS上樣緩沖液迅速在100℃加熱樣品10min使蛋白變性，然后12000rpm*5min*4℃離心取上清電泳。電泳前10min100V穩(wěn)壓電泳，之后溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠200V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍(lán)帶遷移至離凝膠底部1cm,取出凝膠用考馬斯亮蘭染色液染色,隨后轉(zhuǎn)入脫色液中，脫色至背景清晰。(在平衡Coat蛋白得率和純度的時(shí)，可通過適當(dāng)?shù)販p少Ni-IDA柱體積以獲得高純度的目標(biāo)蛋白)如圖3所述。

3Coat蛋白透析分裝

3.1將上述收集的目標(biāo)蛋白用3.5kDa透析袋透析到500mL Buffer C：1×PBS，10％Glycerol，pH 7.4中，用磁力攪拌器4℃旋轉(zhuǎn)，每隔2h換液一次，總計(jì)換液4次。

3.2透析結(jié)束后用0.22um膜過濾，并分裝凍于-80℃。

4.Coat蛋白質(zhì)檢

4.1Coat蛋白穩(wěn)定性測(cè)試(凍融實(shí)驗(yàn))

取一支分裝后凍于-80℃的Coat蛋白，放置于冰水混合物中待其緩慢融化，融化后無明顯懸浮物并且13000rpm*30min*4℃離心亦無沉淀，說明Coat蛋白凍融實(shí)驗(yàn)是正常的。

4.2Coat蛋白濃度測(cè)定

測(cè)定蛋白濃度采用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒。其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。測(cè)得其OD＝0.275，最終換算濃度為0.380mg/mL。

實(shí)施例3：

將實(shí)施例2獲得石斑魚神經(jīng)壞死病毒Coat蛋白制成疫苗VLP直接注射魚體，選擇大小為4-6cm的魚體。

注射方式為肌肉注射；VLP注射量為0.2-8.5μg/g魚；

VLP7D代表VLP注射后魚體7天取血檢測(cè)抗體水平，VLP14D代表14天后取血檢測(cè)抗體水平，NNV7D代表魚體注射神經(jīng)壞死病毒(NNV)7天后取血檢測(cè)抗體水平，NNV14D代表魚體注射神經(jīng)壞死病毒(NNV)14天后取血檢測(cè)抗體水平(NNV相當(dāng)于陽(yáng)性對(duì)照)，對(duì)照7d代表注射生理鹽水7天取血，對(duì)照14d代表注射生理鹽水14天取血檢測(cè)抗體水體。

抗體檢測(cè)效如圖5所示：注射VLP跟NNV病毒液抗體效價(jià)都達(dá)到幾萬，對(duì)照組抗體效價(jià)為90左右，說明本發(fā)明制備的VLP疫苗能夠和病毒原液產(chǎn)生幾乎相同的效價(jià)。