本發(fā)明涉及一種利用重組大腸桿菌合成3'-唾液乳糖的方法，屬于代謝工程領域。

背景技術：

母乳中包含嬰兒生長和發(fā)育所必須的營養(yǎng)物質，但是它同時也含有傳統(tǒng)營養(yǎng)物質中所沒有的物質，這些物質對身體是有益的。其中一些物質就是人乳寡糖（HMOs）。唾液乳糖是常見的人乳寡糖，具有抗黏附，維持腸道微生物組成及糖組修飾等功能, 在營養(yǎng)和藥用方面，也是很有前途的寡糖。

唾液乳糖，如3'-唾液乳糖在糖組修飾方面起著重要的作用，調節(jié)腸內上皮細胞表面多糖的表達，調節(jié)大多數病原菌和共生菌的黏附位點。暴露在3'-唾液乳糖的情況下，CaCo-2細胞可以改變其細胞表面多糖組成，3'-唾液乳糖是母乳中一種主要的成分。因為暴露在3'-唾液乳糖的情況下，細胞表面α2-3和α2-6連接的唾液酸殘基明顯的減少。在細菌和宿主相互作用的情況下，為了評估這些細胞表面糖組變化的重要性，Angeloni等對腸道致病性大腸桿菌的黏附是否改變進行了評估。腸道致病性大腸桿菌黏附到宿主腸上皮細胞表面的多糖上。事實上，3'-唾液乳糖在上皮細胞表面糖組中引起了的變化，這種變化導致腸道致病性大腸桿菌的黏附于對照組相比，減少了90%。這些結果表明，低聚糖如3'-唾液乳糖對宿主和細菌的相互作用的調節(jié)存在新的機制。另外，據報道，研究表明，含有3'-SL的奶會通過集群梭菌屬IV的細菌影響腸內定植。

目前，3'-唾液乳糖的生產方法主要為化學法，化學法生產存在諸多弊端，如合成步驟過多，生成的產物較多，副產物復雜，其反應液對環(huán)境產生污染等，通過生物法來制備3'-唾液乳糖越來越受到研究者的關注。

本發(fā)明中構建的重組工程菌實現了3'-唾液乳糖的生物合成，為生物法探索生成目標代謝產物提供了新思路。

技術實現要素：

本發(fā)明通過構建一株重組大腸桿菌，實現了從乳糖到3'-唾液乳糖的生物合成。所采取的技術方案如下：

本發(fā)明的第一個目的在于提供了一種利用乳糖合成3'-唾液乳糖的重組大腸桿菌。其特征在于，具有3'-唾液乳糖的合成途徑。名稱為E.coli-XYY。同時過表達乙酰神經氨酸合成酶基因（neuB），CMP-乙酰神經氨酸合成酶基因（neuA），N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因（neuC），β-半乳糖苷透性酶基因（lacY），唾液酸轉移酶基因（lst），并敲除Neu5Ac轉運子（nanT），Neu5Ac醛縮酶基因（nanA），N-乙酰甘露糖胺激酶基因（nanK），N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向異構酶基因（nanE），葡萄糖胺-6-磷酸脫氨酶基因（nagB），N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸脫乙酰酶基因（nagA）和β-半乳糖苷酶基因（lacZ）。

所述CMP-乙酰神經氨酸合成酶基因neuA，基因登錄號GI：7152208; 乙酰神經氨酸合成酶基因neuB，基因登錄號GI：7152206；N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因neuC，基因登錄號GI：7152210；β-半乳糖苷透性酶基因lacY，基因登錄號GI：949083；來源于大腸桿菌。所述唾液酸轉移酶基因（lst），基因登錄號GI：325207958來源于腦膜炎奈瑟菌。所述具有3'-唾液乳糖合成途徑，是指過表達CMP-乙酰神經氨酸合成酶，乙酰神經氨酸合成酶，N-乙酰葡萄糖胺異構酶，β-半乳糖苷透性酶和唾液酸轉移酶。

本發(fā)明第二個目的在于提供了大腸桿菌基因工程菌的構建方法，其特征在于步驟如下：

1）分別制備含有乙酰神經氨酸合成酶基因（neuB），CMP-乙酰神經氨酸合成酶基因（neuA），N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因（neuC）的重組質粒，含有β-半乳糖苷透性酶基因（lacY）的重組質粒，含有唾液酸轉移酶基因（lst）的重組質粒，獲得構建代謝途徑的質粒；

2）將質粒pSim導入轉化到宿主菌E.coliBL21（DE3）中，獲得攜帶質粒的宿主菌；

3）以pKD3為模板，分別擴增帶有Neu5Ac醛縮酶基因nanA，N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK，N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向異構酶基因nanE，葡萄糖胺-6-磷酸脫氨酶基因nagB，N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸脫乙酰酶基因nagA，Neu5Ac轉運子nanT基因，β-半乳糖苷酶基因lacZ同源臂的抗性敲除片段；

4) 先向步驟2所得的攜帶質粒pSim的宿主菌中轉化同一個基因的抗性敲除片段，獲得缺失一個基因的重組菌；

5) 將步驟4所得的重組菌進行溶源化處理，利用pCP20質粒進行抗性消除；

6) 以步驟5所得的缺失一個基因的重組菌為宿主菌，重復步驟5）的操作，獲得缺失兩個基因的重組菌，再重復步驟5）的操作，每次操作均以上一次操作獲得的重組菌為宿主菌，直至將步驟3）所述的基因全部敲除，獲得缺失7個基因的重組大腸桿菌；

7) 將步驟6）中基因敲除的大腸桿菌進行溶源化處理，再將步驟1）所得的代謝途徑構建質粒轉化到溶源菌中，獲得能夠利用乳糖合成3'-唾液乳糖的重組大腸桿菌；

其中所述構建Neu5Ac醛縮酶基因nanA，N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK，N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向異構酶基因nanE，Neu5Ac轉運子nanT的缺失引物和鑒定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4 所示；構建葡萄糖胺-6-磷酸脫氨酶基因nagB，N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸脫乙酰酶基因nagA的缺失引物和鑒定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8所示；構建β-半乳糖苷酶基因lacZ的缺失引物和鑒定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.12所示：

本發(fā)明第三個目的在于提供了采用所獲得的大腸桿菌基因工程菌E.coli-XYY進行發(fā)酵合成3'-唾液乳糖，培養(yǎng)基和發(fā)酵方法如下：

LB培養(yǎng)基（1L）:Tryptone(胰蛋白胨)：10g，Yeast Extract（酵母提取物）：5g，NaCl（氯化鈉）：5g。若配置固體培養(yǎng)基，則再加入15g Agar（瓊脂）。

M9培養(yǎng)基（1L）：Na₂HPO₄·7H₂O（七水合磷酸氫二鈉）：12.8g，KH₂PO₄（磷酸二氫鉀）3g，NaCl（氯化鈉）：0.5g，NH₄Cl（氯化銨）2g，MgSO₄·7H₂O（七水合硫酸鎂）0.25g，Yeast Extract（酵母提取物）2g，Glycerol（甘油）：20g。

將所得基因工程菌在5mL含有卡那霉素50 μg/ml，氨芐青霉素100 μg/ml，鏈霉素50 μg/ml的LB培養(yǎng)基中37℃，220rpm/min培養(yǎng)12h，轉入M9培養(yǎng)基，M9培養(yǎng)基在使用前加入卡那霉素，氨芐青霉素，鏈霉素（卡那霉素50 μg/ml，氨芐青霉素100 μg/ml，鏈霉素50 μg/ml），37℃，培養(yǎng)月3h左右，加入IPTG（IPTG 0.2mM）,并轉入25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)約2h后，加入乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，取樣。該方法的具體步驟如下：

1）制備含有乙酰神經氨酸合成酶基因（neuB），CMP-乙酰神經氨酸合成酶基因（neuA），N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因（neuC），β-半乳糖苷透性酶基因（lacY），唾液酸轉移酶基因（lst）的重組質粒，獲得構建代謝途徑的質粒；

2）將質粒pSim導入轉化到宿主菌E.coli BL21（DE3）中，獲得攜帶質粒的宿主菌；

3）分別構建Neu5Ac醛縮酶基因nanA，N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK，N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向異構酶基因nanE，Neu5Ac轉運子基因nanT，4個基因的帶有同源臂的抗性消除片段，葡萄糖胺-6-磷酸脫氨酶基因nagB， N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸脫乙酰酶基因nagA，2個基因的帶有同源臂的抗性消除片段，β-半乳糖苷酶基因lacZ的帶有同源臂的抗性消除片段；

4）先向步驟2所得的攜帶質粒pSim的宿主菌中轉化一個基因帶有同源臂的抗性消除片段，獲得缺失一個基因的重組菌；

5）將步驟4）所獲得的缺失一個基因的重組菌進行溶源化處理，利用pCP20質粒進行抗性消除；

6）以步驟5）所得的缺失一個基因的重組菌為宿主菌，重復步驟4）和步驟5）的操作，獲得缺失兩個基因的重組菌，再重復步驟4）和步驟5）的操作，每次操作均以上一次操作獲得的重組菌為宿主菌，直至將步驟2）所述的基因全部敲除，獲得缺失7個基因的重組大腸桿菌；

7）將步驟6）中基因敲除的大腸桿菌進行溶源化處理，再將步驟1）所得的代謝途徑構建質粒轉化到溶源菌中，獲得能夠利用乳糖合成3'-唾液乳糖的重組大腸桿菌；

8）利用步驟7）所得的重組大腸桿菌合成3'-唾液乳糖；

所述任一大腸桿菌工程菌在生產3'-唾液乳糖中的應用，也在本發(fā)明的保護范圍之內。所述應用的步驟如下：

1） 活化大腸桿菌基因工程菌，獲得種子液；

2） 將步驟1）獲得的種子液與含有卡那霉素、氨芐青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基，按照種子液:培養(yǎng)基=1:100的比例接種至新鮮的培養(yǎng)基，35~37℃，180rpm~220rpm/min,培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.6~0.8，并加入誘導劑IPTG至終濃度為0.2mM~0.3mM, 然后轉入20~25℃，180rpm~220rpm/min,補加乳糖繼續(xù)培養(yǎng)4~6h；發(fā)酵生產3'-唾液乳糖過程中，大腸桿菌基因工程菌所用的培養(yǎng)基包括各種適于所選用的宿主細胞（大腸桿菌）生長的培養(yǎng)基，碳源優(yōu)選為低成本的葡萄糖。

本發(fā)明公開的構建重組大腸桿菌生物合成3'-唾液乳糖的方法與現有技術相比所具有的積極效果在于：

（1）本發(fā)明所構建的大腸桿菌基因工程菌具有以葡萄糖為碳源發(fā)酵合成3'-唾液乳糖的特點，發(fā)酵4h，可以得到2~4g/L的3'-唾液乳糖。

（2）本發(fā)明建立了一條3'-唾液乳糖的合成途徑，本發(fā)明同時克服了現有的技術難題，獲得了一個高效的基因敲除方案；原始菌株在通過基因工程改造以后，除了生產3'-唾液乳糖外，沒有改變菌株的其它特性，不影響發(fā)酵生產；該菌株采用的質粒為成熟的大腸桿菌質粒，因此在代謝過程中不影響細菌生長和正常代謝。

附圖說明

圖1是質粒pCOLADuet-1-neuA-neuB-neuC的圖譜，用來過表達3'-唾液乳糖合成途徑中的neuA、neuB, neuC基因；

圖2是質粒pET-Duet1-lacY的圖譜，用來過表達3'-唾液乳糖合成途徑中的lacY基因；

圖3是質粒pCDF-Duet-1-lst的圖譜，用來過表達3'-唾液乳糖合成途徑中的lst基因；

圖4是敲除nanA nanT nanE nanK 4個基因后的PCR驗證產物的電泳圖；（圖中，M:Marker；泳道1-2分別為：陰性對照,（nanA -T-E-K)；

圖5是敲除nagA nagB基因后的PCR驗證產物的電泳圖；（圖中，M:Marker；泳道1-2分別為：陰性對照（nagA-B）；

圖6是敲除lacZ基因后的PCR驗證產物的電泳圖； （圖中，M:Marker；泳道1-2分別為：陰性對照 lacZ）；

圖7是本發(fā)明中構建的合成3'-唾液乳糖的代謝途徑；

圖8是ESI-MS檢測重組菌株發(fā)酵液，其中655.15為目的產物3'-唾液乳糖。

具體實施方式

下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發(fā)明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明所用原料及試劑均有市售。以下實施例中所用的材料、試劑、儀器和方法未經特殊說明均為本領域中的常規(guī)材料、試劑、儀器和方法，均可通過商業(yè)渠道獲得；例如Tryptone(胰蛋白胨)，Yeast Extract（酵母提取物），Agar（瓊脂）；卡那霉素，氨芐青霉素，鏈霉素，E.coliDH5α等等。

本發(fā)明中質粒提取采用生工生物工程（上海）有限公司的SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒（Catalog NO.：B518191），切膠回收是采用生工生物工程（上海）有限公司的SanPrep柱式膠回收試劑盒（Catalog NO.：B518131），DNA片段的連接是使用fermentas公司的T4 DNA Ligase（Catalog NO.：EL0014），DNA片段的擴增使用fermentas公司的pfu DNA polymerase（Catalog NO.：EP0571）,PCR質粒模板的消化使用fermentas公司的Falst Digelst KpnI（Catalog NO.：FD0524），BamHI（Catalog NO.：FD0054） NcoI（Catalog NO.：FD0574）BglII（Catalog NO.：FD0083）E.coli電擊轉化實驗使用Bio-Rad的電轉儀（Catalog NO.：165-2100）。細菌基因組提取使用北京康為世紀生化科技有限公司的細菌基因組提取試劑盒（Catalog NO.：CW0552S）。

實施例1

基因的獲?。?/p>

本實施例中，獲取來源于大腸桿菌的CMP-乙酰神經氨酸合成酶基因neuA（基因登錄號 GI:7152208）,乙酰神經氨酸合成酶基因neuB（基因登錄號 GI:7152206）, N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因neuC（基因登錄號 GI:7152210），β-半乳糖苷透性酶基因lacY(基因登錄號 GI:949083)的基因序列。獲取來源于Neisseria meningitidis的lst基因（基因登錄號 GI:325207958）。

實施例2

重組質粒的制備

使用設計的引物F₁，R₁對實施例1中獲得的來源于大腸桿菌的CMP-乙酰神經氨酸合成酶基因neuA，乙酰神經氨酸合成酶基因neuB，N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因neuC進行PCR擴增，擴增后的片段進行切膠純化，并用NcoI和BamHI進行雙酶切，酶切后的片段與同樣經過NcoI和BamHI雙酶切的質粒pCOLADuet-1質粒進行連接，將載體：目的片段按摩爾比為1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下酶連5h，連接產物轉化E.coliDH5α，并在卡納霉素板上進行篩選，獲得重組質粒pCOLADuet-1-neuBAC。

使用設計的引物F₂，R₂對實施例1中獲得的來源于Neisseria meningitidis的lst基因進行PCR擴增，擴增后的片段進行切膠純化，并用NcoI和BamHI進行雙酶切，酶切后的片段與同樣經過NcoI和BamHI雙酶切的質粒pCDFDuet-1質粒進行連接，將載體：目的片段按摩爾比為1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下酶連5h，連接產物轉化E.coliDH5α，并在鏈霉素板上進行篩選，獲得重組質粒pCDFDuet-1-lst。

使用設計的引物F₃，R₃對實施例1中獲得的來源于大腸桿菌的β-半乳糖苷透性酶基因（lacY）進行PCR擴增，擴增后的片段進行切膠純化，并用KpnI和BglII進行雙酶切，酶切后的片段與同樣經過KpnI和BglII雙酶切的質粒pETDuet-1質粒進行連接，將載體：目的片段按摩爾比為1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下酶連5h，連接產物轉化E.coliDH5α，并在氨芐青霉素板上進行篩選，獲得重組質粒pETDuet-1-lacY。

實施例3

基因的敲除

本實施例使用λRed重組系統(tǒng)敲除E.coliBL21(DE3)的多個基因，該方法每敲除一個基因都進行抗性的消除。下面以lacZ基因為例，詳細闡述基因敲除的步驟，其余6個基因的敲除與此相同。在NCBI中查找E.coliBL21lacZ基因的核苷酸序列，設計lacZ基因的缺失引物和鑒定引物。lacZ基因的缺失引物和鑒定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.12 所示。

實施例4

缺失型E.coliBL21(DE3) 7的構建

4.1質粒pSim的轉化

挑取-80℃凍存的野生型E.coliBL21(DE3)在無抗性的LB平板上劃線，37℃過夜培養(yǎng)。第二天挑取單克隆，接種至5mL LB培養(yǎng)基中，37℃，220rpm/min，過夜培養(yǎng)。第二天按1%的接種量，轉接至200ml的LB培養(yǎng)基中。37℃，220rpm/min，培養(yǎng)至OD₆₀₀約為0.6~0.8，冰浴20min，5500rpm，5min，收集菌體于已滅菌的50ml離心管中，4℃，5500rpm，離心5min，棄上清，用50ml冰浴過的無菌的10%甘油重懸菌體，4℃，5500rpm，再離心5min，重復上述操作3次，最后一次，利用棄上清時的殘余液體重懸菌體，取80μL于至新的無菌EP管中。-80℃凍存。

將-80℃凍存的感受態(tài)細胞置于冰中融化10min，加入1μL的pSim質粒，混勻后加入電擊杯中，冰浴2min，1.8KV電擊轉化，電擊后立即加入1ml的LB培養(yǎng)基，30℃，220rpm/min復蘇20min，取適量菌液涂布于滅瘟素平板上（滅瘟素濃度200μg/ml），30℃倒置過夜培養(yǎng)，第二天長出的單克隆即是攜帶pSim質粒的E.coliBL21(DE3)。

4.2 目的基因的敲除

4.2.1同源重組片段的制備

以pKD3質粒為模板，使用引物SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10進行PCR擴增，切膠純化回收，獲得兩端含有lacZ同源臂的敲除片段lacZ-Fragment I。

4.2.2 第一步同源重組（lacZ-Fragment I的轉化）

挑取攜帶pSim質粒的E.coliBL21(DE3)單克隆接種至5ml LB培養(yǎng)基中，37℃，220rpm/min，過夜培養(yǎng)。第二天按1%的接種量，轉接至200ml的LB培養(yǎng)基中。37℃，220rpm/min，培養(yǎng)至OD₆₀₀約為0.6~0.8，將菌液轉至42℃水浴搖床中，150rpm/min，20min，然后冰浴20min，4℃，5500rpm/min，離心5min，收集菌體于已滅菌的50ml離心管中，4℃，5500rpm，離心5min，棄上清，用50ml冰浴過的無菌的10%甘油重懸菌體，4℃，5500rpm，再離心5min，重復上述操作3次，最后一次，利用棄上清時的殘余液體重懸菌體，取80μL于至新的無菌EP管中，加入4μLlacZ-Fragment I片段，混勻后加入電擊杯中，冰浴2min，1.8KV電擊轉化，電擊后立即加入1ml的LB培養(yǎng)基，37℃，180rpm/min，培養(yǎng)2h，取適量菌液涂布于抗性平板上，37℃過夜培養(yǎng)。第二天挑取單克隆，PCR鑒定出lacZ基因被lacZ-Fragment I替換的正確克隆，即E.coliBL21（DE3） lacZ。

基因缺失后抗性的消除

4.3.1E.coli BL21 (DE3) lacZ菌株感受態(tài)細胞的制備

挑取E.coliBL21 (DE3) lacZ單克隆接種至5ml的LB培養(yǎng)基中，按照上面步驟制備感受態(tài)，電轉pCP20質粒，電擊后立即加入1ml的LB培養(yǎng)基，30℃，180rpm/min，培養(yǎng)20min，取適量菌液涂布于氨芐青霉素平板上（氨芐青霉素濃度100 μg/ml），30℃過夜培養(yǎng)。第二天挑取單克隆至5ml的LB培養(yǎng)基中（氯霉素濃度25μg/ml），30℃，180rpm/min, 培養(yǎng)10h，轉移至新的液體培養(yǎng)基，不加抗生素，42℃，培養(yǎng)6h后，稀釋涂板，37℃，倒置過夜培養(yǎng)，第二天挑單克隆，分別在無抗板和氯霉素板上進行影印。氯霉素板上未長，但是無抗板對應位置上長出的單克隆，即為抗性消除成功的陽性克隆，進一步通過PCR驗證。

4.4 剩余6個基因的敲除

剩余6個基因的敲除原理和步驟與lacZ相同，以敲除了lacZ基因的菌株為基礎，通過重復實驗步驟中的4.2和4.3，可依次將全部7個基因敲除，最終構建出缺失的E.coliBL21 (DE3) 7。

圖4為野生型E.coliBL21(DE3)和E.coli BL21 (DE3) 7的PCR驗證結果，兩組結果使用相同的鑒定引物，圖4中泳道2的條帶泳道1的條帶相比，出現了顯著的減小，表明相應目的基因已經被成功敲除。pSim質粒為溫度敏感型質粒，培養(yǎng)溫度高于30℃的條件下，質粒將會丟失，因此，在將pSim質粒轉入E.coliBL21(DE3)后，菌株將一直在30℃條件下培養(yǎng)，以防止pSim質粒的丟失。

實施例5

產3'-唾液乳糖E.coliBL21 (DE3) 7菌株的構建

以敲除7個基因的E.coliBL21 (DE3)7菌株為基礎，制備感受態(tài)細胞（方法參照實驗步驟4.1），將pETDuet-1-lacY，pCDFDuet-1-lst，pCOLADuet-1-neuBAC轉入，在LB平板（卡那霉素50 μg/ml，氨芐青霉素100 μg/ml，鏈霉素50 μg/ml）上篩選正確的克隆。經雙酶切驗證得到攜帶整個3'-唾液乳糖合成途徑的菌株E.coliBL21(DE3) 7/3'-SL。得到2~4g/L的3'-唾液乳糖，圖7為本發(fā)明中合成3'-唾液乳糖的代謝途徑。

實施例6

E.coli BL21 7/3'-SL菌株3'-唾液乳糖合成的驗證

將菌株接種至5mL的LB培養(yǎng)基中（卡那霉素50 μg/ml，氨芐青霉素100μg/ml，鏈霉素50μg/ml），37℃，220rpm/min，過夜培養(yǎng)。第二天按1%的接種量轉接至優(yōu)化的M9培養(yǎng)基中，OD₆₀₀約為0.6時誘導（IPTG濃度0.2mM），轉至25℃，誘導2h后，加入2mL乳糖，約4h后取樣，4℃，7000rpm/min，離心10min，將上清與沉淀分開。上清過0.22μm濾膜。通過ESI-MS和高效液相色譜檢測。

沉淀首先用滅菌水懸浮，4℃，7000rpm/min，離心10min，重復一次，然后采取反復凍融來破碎細胞，破碎后，4℃，5100rpm/min，離心25min，

離心，將上清轉移至10mL的離心管中，過0.22μm濾膜，通過ESI-MS檢測。

3'-唾液乳糖的檢測：（1） ESI-MS，

儀器：Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer (Thermo Electron,CA)

離子化模式：電噴霧負離子模式;

電噴霧范圍：400-700m/z;

干燥器溫度：220℃；

噴霧壓力：45psi；

毛細管電壓：4500V;

進樣量：0.2mL/min;

碰撞氣體為氮氣，輔助氣體為氦氣；

（2）高效液相檢測

色譜柱：Venusil C18柱（5μm particle size，4.6 by 250mm）;

流動相：10% 乙腈， 90% 三乙胺冰醋酸（pH 6.0）;

流速：0.6mL/min;

進樣量5μL。

以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其進行限制，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。而這些修改或替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明所要求保護的技術方案的范圍和精神。

SEQUENCE LISTING

<110> 南開大學

<120> 一種構建的重組大腸桿菌及生物合成3'-唾液乳糖的方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctggtataac aggtataaag gtatatcgtt tatcagacaa gcatcacttc agaggtattt 60

gtcttgagcg attgtgtagg 80

<210> 2

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgcgtcctgt aacgcaggat gtaacccagc agacggtaat gactgtactt cacccatcac 60

ttaacggctg acatgggaa 79

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtatggggt gttgcttaat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctgtaattc gtaacgaccc 20

<210> 5

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttacgctta aagatgccta atccgccaac ggcttacatt ttacttattg aggtgaatag 60

tcttgagcga ttgtgtagg 79

<210> 6

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctgttttacg agatcaacat tacctatctg agcttgtccg cctggtgtca tactttctcc 60

ttaacggctg acatgggaa 79

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aatcaggtcg gattgacgcc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caatcaggcg ataaaccgcc 20

<210> 9

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgaccatga ttacggattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccgt 60

gtaggctgga gctgcttcg 79

<210> 10

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttatttttga caccagacca actggtaatg gtagcgaccg gcgctcagct ggaattccgc 60

atatgaatat cctccttag 79

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctggcacgac aggtttcc 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgtagccaaa tcgggaaaa 19