本發(fā)明一般的涉及重組大腸桿菌工程菌，特別的涉及表達抗體Fab片段的重組大腸桿菌工程菌。
背景技術：
抗體(antibody，Ab)是一種由抗原(例如細菌、病毒及它們的組分，異源蛋白質(zhì))誘導，由機體淋巴細胞(漿細胞)合成與分泌的，用來鑒別與中和抗原的免疫球蛋白類物質(zhì)?？贵w分為多克隆抗體(polyclonal antibody，pAb)和單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)，其中前者是由異源抗原或不同的抗原表位刺激機體產(chǎn)生的，后者是由同源抗原乃至相同的抗原表位刺激機體產(chǎn)生的。因此，單克隆抗體較多克隆抗體特異性更強，靈敏度更高，但制備難度與成本也更高。
傳統(tǒng)的抗體分子由兩條相同的輕鏈(light chain，LC)與兩條相同的重鏈(heavy chain，HC)形成對稱的Y形結構，分子量150KD左右，輕鏈和重鏈靠近N端的一側形成可變區(qū)(variable region，VR，不同抗體的同型可變區(qū)氨基酸序列不同)，包括重鏈可變區(qū)(heavy chain variable region，HV)與輕鏈可變區(qū)(light chain variable region，LV)；靠近C端的一側形成恒定區(qū)(constant region，CR，不同抗體的同型恒定區(qū)氨基酸序列相同)，包括重鏈恒定區(qū)(heavy chain constant region，Hc)與輕鏈恒定區(qū)(light chain constant region，Lc)。而重鏈和輕鏈可變區(qū)又分別由交錯排布的四個框架區(qū)(framework region，F(xiàn)R，不同抗體的氨基酸序列變化較小)與三個互補決定區(qū)(complementarity determining region，CDR，不同抗體的氨基酸序列變化較大，尤其是CDR3)組成。兩側的重鏈和輕鏈之間均通過二硫鍵連接起來，兩條重鏈之間亦通過二硫鍵連接。
哺乳動物抗體分子的重鏈一共有五種，分別用希臘字母α、δ、ε、γ和μ來命名，相對應的抗體分別稱為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。不同的重鏈在大小和組成上有所區(qū)別，α和γ包含大約450個氨基酸，而μ和ε則有大約550個氨基酸。
哺乳動物抗體分子輕鏈只有λ型和κ型兩種類型。輕鏈的長度大約為211～217個氨基酸。
抗體分子可以被蛋白水解酶如木瓜蛋白酶水解成2個Fab段和一個Fc段，或者被胃蛋白酶從鉸鏈區(qū)(用于連接Fab和Fc段的富含脯氨酸的結構區(qū)域，其包含了重鏈間的二硫鍵)斷開，水解成一個F(ab)2段和一個Fc段。Fab片段是由重鏈Fd段和完整輕鏈通過鏈間二硫鍵形成的異二聚體，質(zhì)量約占抗體分子的1/3。由于缺少Fc段，F(xiàn)ab段既不會和抗原發(fā)生沉淀，也不會在活體研究中被免疫細胞捕獲。
傳統(tǒng)的單克隆抗體是通過雜交瘤細胞技術制備的，屬于鼠源性抗體。為了降低乃至消除鼠源性抗體用于人體引起的人抗鼠抗體反應(HAMA)，自上世紀80年代中后期開始，研究者探索以基因工程方法改造鼠源性單克隆抗體，從而制備出了包括嵌合抗體(將鼠抗體的恒定區(qū)替換為人抗體的恒定區(qū))與人源化抗體(在嵌合抗體的基礎上進一步將可變區(qū)的框架區(qū)替換為人抗體的框架區(qū))的基因工程抗體，并在此基礎上進一步制備獲得了重組的全人序列的全人抗體。同時，鑒于完整的抗體分子因表達量及產(chǎn)量低、純化及質(zhì)控難、成本高等原因較難以制備，分子量過大難以穿過細胞外間隙進入細胞，容易引起免疫反應等原因，所以又采用基因工程方法使抗體分子小型化，制備出了各種小分子抗體，包括單鏈抗體(scFv，由抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過15～20個氨基酸的短肽(linker)連接而成)、Fab抗體等。
抗體藥物是以細胞工程技術和基因工程技術為主體的抗體工程技術制備的藥物，具有特異性高、性質(zhì)均一、可針對特定靶點定向制備等優(yōu)點。截至2014年底，全球共有針對37種靶標的59個抗體藥物產(chǎn)品被批準上市，針對包括各種腫瘤、自身免疫性疾病在內(nèi)的36種適應癥，形成了847億美元的年市場銷售額，且當年全球銷售額排名前10的藥物中有6個是抗體藥物。而在這37種靶標中，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是最熱門的靶標，僅此一個靶標的抗體藥物2014年全球銷售額就達到了345億美元，高居所有靶標抗體藥物銷售額之首，也使自身免疫性疾病適應癥力壓腫瘤適應癥成為抗體藥物銷售額最高的適應癥。
以TNF為靶標的抗體藥物主要針對以類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)、節(jié)段性腸炎(Crohn′s disease，CD)、強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)、銀屑病關節(jié)炎(psoriatic arthritis，PA)為代表的自身免疫性疾病的治療。目前上市的抗TNF抗體藥物主要有5種，分別為infliximab(英夫利昔單抗，商品名Remicade，嵌合抗體)、adalimumab(阿達木單抗，商品名Humira，全人抗體)、golimumab(戈利木單抗，商品名Simponi，全人抗體)、certolizumab(賽妥珠單抗，商品名Cimzia，人源化PEG修飾的Fab抗體)以及etanercept(依那西普，商品名Enbrel，TNF受體與抗體Fc段的融合蛋白)，其中adalimumab、infliximab、etanercept在2014年全球銷售排名前10的藥物中分別排名第1、3、4位，而certolizumab在2014年的全球銷售額也達到了10億美元以上的規(guī)模。
鑒于如前所述的小分子抗體相較于完整分子抗體的優(yōu)勢，類比certolizumab先制備抗TNF抗體Fab片段的小分子抗體，再用PEG修飾以克服小分子抗體半衰期短、穩(wěn)定性差的缺點就有了相當?shù)目尚行浴?/p>
雖然Fab抗體可以利用諸多表達系統(tǒng)，如細菌、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲和植物表達系統(tǒng)表達，但應用最為廣泛的還是大腸桿菌(E.coli)表達系統(tǒng)。但大腸桿菌表達Fab抗體最大的問題是容易形成包涵體表達造成表達產(chǎn)物不溶解和無活性，由此必須進一步進行的變復性過程更容易造成Fab抗體的錯誤折疊和二硫鍵(Fab抗體有4個鏈內(nèi)和1個鏈間二硫鍵)的錯誤配對。解決這一問題的方法是盡量讓Fab抗體表達在大腸桿菌周質(zhì)空間(periplasm space)中。不過即使Fab抗體在大腸桿菌周質(zhì)空間中表達，如果過量表達仍然存在錯誤折疊和二硫鍵錯誤配對的問題，由此對表達Fab抗體的量及其以二硫鍵形成為代表的正確結構的形成、生物學活性都有較大影響。
現(xiàn)有技術中公開了一些共表達分子伴侶(molecular chaperones)類物質(zhì)以解決大腸桿菌周質(zhì)空間中表達抗體片段存在上述問題的方法。例如發(fā)表在Microbial Cell Factories 2010年第9卷第1期上的文獻Co-expression of Skp and FkpA chaperones improves cell viability and alters the global expression of stress response genes during scFvD1.3production公開了在E.coli BL21中將scFvD1.3抗體片段與Skp或FkpA共表達。又如發(fā)表在FEBS Letters 1996年第380卷第194-197頁上的文獻Co-expression of human protein disulphide isomerase(PDI)can increase the yield of an antibody Fab'fragment expressed in Escherichia coli公開了在野生型E.coli菌株W3110(ATCC 27325)中將Fab抗體與人二硫鍵異構酶(human protein disulfide isomerase，hPDI)共表達，并提及了可共表達二硫鍵合成酶(DsbA、DsbB、DsbC)。又如發(fā)表在Biotechnology and Bioengineering 2012年第109卷第2期第517-527頁上的文獻Growth and Productivity Impacts of Periplasmic Nuclease Expression in an Escherichia coli Fab’Fragment Production Strain公開了在E.coli周質(zhì)空間中共表達Fab抗體與核酸酶(Nuclease)。又如發(fā)表在Journal of Immunological Methods 2013年第394卷第10-21頁上的文獻Enhancement of antibody fragment secretion into the Escherichia coli periplasm by co-expression with the peptidyl prolyl isomerase,FkpA,in the cytoplasm公開了在E.coli周質(zhì)空間中共表達scFv或Fab抗體和肽基脯氨酰順反異構酶(peptidyl prolyl isomerase)、FkpA。
但是在眾多的分子伴侶類物質(zhì)中哪種最適于與抗TNF抗體Fab片段在大腸桿菌中共表達，以最大限度的提高抗TNF抗體Fab片段周質(zhì)空間表達量的同時明顯促進其中鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵的正確形成，需要通過大量的優(yōu)化研究確定。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種重組大腸桿菌工程菌，以在明顯提高抗TNF抗體Fab片段周質(zhì)空間表達量的同時明顯促進其中鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵的正確形成。
在基礎的實施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌工程菌轉化有重組表達載體，所述的重組表達載體含有表達抗TNF抗體Fab片段的基因和表達二硫鍵異構酶的基因。
本發(fā)明的重組大腸桿菌工程菌可以利用商業(yè)化的大腸桿菌工程菌轉化重組表達載體后制備，也可以對商業(yè)化的大腸桿菌工程菌做進一步的改造后轉化重組表達載體制備，制備方法是本領域技術人員公知的。商業(yè)化的大腸桿菌工程菌例如BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)、Arctic Express、Origami B(DE3)。其中BL21菌株及其衍生菌株被廣泛用于重組蛋白的表達，該類菌株為蛋白酶基因缺陷型菌株，能夠有效避免重組蛋白酶解。BL21(DE3)工程菌包含整合在BL21菌株染色體上的λ噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)的lacUV5啟動子可以調(diào)控T7RNA聚合酶的表達，尤其適用于T7啟動子系統(tǒng)。
制備本發(fā)明的重組大腸桿菌工程菌的表達載體可以選擇質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體，但優(yōu)選質(zhì)粒載體。用于轉化大腸桿菌的質(zhì)粒載體包括，例如pET23b、pET24a、pET28a、pET30a、pET32a、pCDFDuet-1、pET15b、pET21a、pETDuet-1、pACYC 184、pTXB 1、pTYB21。
制備本發(fā)明的重組大腸桿菌工程菌的表達抗TNF抗體Fab片段的基因可以是表達鼠源抗體Fab片段的基因、表達嵌合抗體Fab片段的基因、表達人源化抗體Fab片段的基因或表達全人抗體Fab片段的基因，但優(yōu)選是表達嵌合抗體Fab片段的基因、表達人源化抗體Fab片段的基因或表達全人抗體Fab片段的基因，尤其是表達已經(jīng)上市的infliximab、adalimumab、golimumab、certolizumab的Fab片段的基因，即SEQ ID No:1、SEQ ID No:3、SEQ ID No:5、SEQ ID No:7的重鏈氨基酸序列與分別對應的SEQ ID No:2、SEQ ID No:4、SEQ ID No:6、SEQ ID No:8的輕鏈氨基酸序列所對應的基因。
二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase，PDI)屬于分子伴侶的一種，當用于大腸桿菌產(chǎn)物表達時能夠促進表達產(chǎn)物在周質(zhì)空間中形成，可以通過維持適當?shù)难趸€原態(tài)勢使蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物的二硫鍵正確形成，并在體外實驗中被證明能輔助表達產(chǎn)物正確折疊。由于PDI基因自身攜帶信號肽功能區(qū)，通過將抗TNF抗體Fab片段的輕、重鏈表達基因和PDI表達基因克隆到重組表達載體，轉化到同一個大腸桿菌工程菌，就可以在大腸桿菌周質(zhì)空間內(nèi)實現(xiàn)可溶性共表達。因此，本發(fā)明在重組大腸桿菌工程菌中轉入表達抗TNF抗體Fab片段的基因的同時轉入表達二硫鍵異構酶的基因。所述的二硫鍵異構酶優(yōu)選為人二硫鍵異構酶(hPDI)。
制備本發(fā)明的重組大腸桿菌工程菌的表達抗TNF抗體Fab片段的基因和表達二硫鍵異構酶的基因可以位于同一重組表達載體內(nèi)，也可以位于不同的重組表達載體內(nèi)，但優(yōu)選位于不同的重組表達載體內(nèi)。當它們位于不同的重組表達載體內(nèi)時，不同的重組表達載體之間必須是兼容的，即不會彼此影響所攜帶的外源基因的正確表達。
根據(jù)本領域技術人員公知常識，外源基因利用大腸桿菌優(yōu)選密碼子可以在大腸桿菌內(nèi)實現(xiàn)更高效的表達。所以制備本發(fā)明的重組大腸桿菌工程菌時表達抗TNF抗體Fab片段的基因和/或表達二硫鍵異構酶的基因優(yōu)選為大腸桿菌密碼子優(yōu)化的。
在一種優(yōu)選的實施方案中，制備獲得本發(fā)明的重組大腸桿菌工程菌的大腸桿菌工程菌選自BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)、Arctic Express、Origami B(DE3)中的一種。
在一種優(yōu)選的實施方案中，制備獲得本發(fā)明的重組大腸桿菌工程菌的大腸桿菌工程菌為BL21(DE3)。
在一種優(yōu)選的實施方案中，制備獲得本發(fā)明的重組大腸桿菌工程菌的表達載體是質(zhì)粒載體，選自pET23b、pET24a、pET28a、pET30a、pET32a、pCDFDuet-1、pET15b、pET21a、pETDuet-1、pACYC 184、pTXB 1、pTYB21。
在一種優(yōu)選的實施方案中，制備獲得本發(fā)明的重組大腸桿菌工程菌的表達抗TNF抗體Fab片段的基因和表達二硫鍵異構酶的基因位于同一或不同的重組表達載體內(nèi)，且當位于不同的重組表達載體內(nèi)時不同的重組表達載體之間是兼容的。
在一種優(yōu)選的實施方案中，制備獲得本發(fā)明的重組大腸桿菌工程菌的表達抗TNF抗體Fab片段的基因位于重組質(zhì)粒載體pET30a內(nèi)，表達二硫鍵異構酶的基因位于重組質(zhì)粒載體pCDFDuet-1內(nèi)。
在一種優(yōu)選的實施方案中，制備獲得本發(fā)明的重組大腸桿菌工程菌的抗TNF抗體Fab片段的重鏈氨基酸序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:3、SEQ ID No:5或SEQ ID No:7所示，與之對應的輕鏈氨基酸序列分別如SEQ ID No:2、SEQ ID No:4、SEQ ID No:6或SEQ ID No:8所示。
在一種優(yōu)選的實施方案中，制備獲得本發(fā)明的重組大腸桿菌工程菌的抗TNF抗體Fab片段的重鏈氨基酸序列如SEQ ID No:7所示，輕鏈氨基酸序列如SEQ ID No:8所示。
在一種優(yōu)選的實施方案中，制備獲得本發(fā)明的重組大腸桿菌工程菌的表達抗TNF抗體Fab片段的基因和/或表達二硫鍵異構酶的基因為大腸桿菌密碼子優(yōu)化的。
在一種優(yōu)選的實施方案中，制備獲得本發(fā)明的重組大腸桿菌工程菌的二硫鍵異構酶為人二硫鍵異構酶，其氨基酸序列如SEQ ID No:9所示。
本發(fā)明中使用的術語“大腸桿菌工程菌”是指經(jīng)過人工改造，易于接受外源基因，進行外源產(chǎn)物表達的大腸桿菌。
本發(fā)明中使用的術語“重組大腸桿菌工程菌”是通過染色體整合，表達載體傳遞等方式接受了外源基因，能夠進行外源產(chǎn)物表達的大腸桿菌?！爸亟M大腸桿菌工程菌”與“大腸桿菌工程菌”的區(qū)別是前者已經(jīng)接受了外源基因，能夠進行外源產(chǎn)物表達；但后者只是具備接受外源基因，表達外源產(chǎn)物的能力，但尚未接受外源基因，尚不能表達外源產(chǎn)物。
本發(fā)明中使用的術語“表達載體”即空表達載體，是經(jīng)過人工改造，能夠載有表達外源產(chǎn)物的基因，如果轉入外源基因并轉入大腸桿菌工程菌形成重組大腸桿菌工程菌則能夠在實現(xiàn)自我復制的同時表達外源產(chǎn)物的DNA分子。常見的表達載體包括細菌質(zhì)粒、噬菌體和病毒等。
本發(fā)明中使用的術語“重組表達載體”是指經(jīng)過人工改造，載有表達外源產(chǎn)物的基因，如果通過轉入大腸桿菌工程菌形成重組大腸桿菌工程菌則能夠在實現(xiàn)自我復制的同時表達外源產(chǎn)物的DNA分子?！爸亟M表達載體”與“表達載體”的區(qū)別是前者已經(jīng)轉入外源基因，但后者只是具備轉入外源基因的能力，尚未轉入外源基因。
本發(fā)明中使用的術語“Fab片段”，也即“Fab抗體”，是指廣義的Fab片段或Fab抗體，即包括不含重鏈鉸鏈區(qū)的Fab片段或Fab抗體，也包括含有重鏈鉸鏈區(qū)的Fab’片段或Fab’抗體。
具體實施方式
通過如下的實施例對本發(fā)明的實施作進一步說明，但本發(fā)明的實施方式并不局限于如下的實施例。
實施例1：共表達hPDI與SEQ ID No:7的重鏈氨基酸序列、SEQ ID No:8的輕鏈氨基酸序列的Fab片段的重組大腸桿菌工程菌的構建
Fab抗體在大腸桿菌的周質(zhì)空間分泌表達是通過在空質(zhì)粒表達載體中導入目的基因，構建重組質(zhì)粒表達載體，然后轉入大腸桿菌工程菌構建重組大腸桿菌工程菌來實現(xiàn)的。
1)目的基因的構建與擴增
在Fab抗體的重鏈基因序列(對應的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示)前引入一段OmpA信號肽基因序列(對應的氨基酸序列如SEQ ID No:9所示)，之后插入一段包含核糖體結合位點的連接序列，之后再在引入一段OmpA信號肽基因序列后連接Fab抗體的輕鏈基因序列(對應的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示)，由此構建表達Fab抗體的目的基因(對應序列如SEQ ID No:10所示)。
構建的表達hPDI的目的基因對應的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示，其中已經(jīng)包含一段信號肽序列。
表達Fab抗體的目的基因與表達hPDI的目的基因均通過基因全合成的方式獲得，并進行了針對大腸桿菌BL21(DE3)偏愛密碼子的優(yōu)化。
通過PCR方式擴增合成的表達Fab抗體的目的基因cDNA，5’端引物包含Nde Ⅰ酶切位點，3’引物包含EcoR Ⅰ酶切位點，將這兩個酶切位點分別加到目的基因的5’端和3’端。具體的PCR反應條件為：反應模版(100ng/μl)1μl，5’引物(50ng/μl)與3’引物(50ng/μl)各2μl，PCR反應混合液(北京天根生物科技有限公司)12.5μl，加dd H2O至25μl；循環(huán)開始前94℃5分鐘，循環(huán)開始后94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘，共30個循環(huán)，循環(huán)結束后72℃10分鐘。
具體采用的引物如下：
5’引物：GGGTTTCATATGAAAAAGACAGCT
3’引物：CGGGGTACCGAATTCTTAGCAT
通過PCR方式擴增合成的表達hPDI的目的基因cDNA，5’端引物包含Nde Ⅰ酶切位點，3’引物包含Xho Ⅰ酶切位點，將這兩個酶切位點分別加到目的基因的5’端和3’端。具體的PCR反應條件為：反應模版(100ng/μl)1μl，5’引物(50ng/μl)與3’引物(50ng/μl)各2μl，PCR反應混合液(北京天根生物科技有限公司)12.5μl，加dd H2O至25μl；循環(huán)開始前94℃5分鐘，循環(huán)開始后94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘，共30個循環(huán)，循環(huán)結束后72℃10分鐘。
具體采用的引物如下：
5’引物：GGGTTTCATATGCTGCGTCGTGCTCT
3’引物：CCGCTCGAGTCATTACTTATCGT
2)重組質(zhì)粒表達載體HL-pET30a的構建
pET系列空質(zhì)粒載體的蛋白表達區(qū)域是由T7啟動子引導的，后面連接乳糖操縱子(lac operator)序列，之后有一段核糖體結合位點(ribosome binding site,RBS)，之后的序列中包含包括Nde I、Bgl II、Kpn I、Nco I、EcoR V、BamH I、EcoR I、Sac I、Sal I、Hind III、Not I、Xho I在內(nèi)的一系列酶切位點。pET系列載體為氨芐霉素(Ampicillin)或卡那霉素(kanamycin)抗性標記的。通過用Nde I和EcoR I酶切空質(zhì)粒載體后連接如上PCR擴增的目的基因，可以構建表達SEQ ID No:7的重鏈氨基酸序列和SEQ ID No:8的輕鏈氨基酸序列的Fab片段的重組質(zhì)粒表達載體，且由于質(zhì)粒載體中有乳糖操縱子序列，因此可以通過IPTG或乳糖調(diào)控目的基因的表達。
具體的Nde I和EcoR I酶切空質(zhì)粒載體pET30a和表達Fab抗體的目的基因的條件為：空質(zhì)粒載體或目的基因1μg，Nde I 2μl，EcoR I 2μl，10×H buffer 4μl，加dd H2O至40μl；37℃反應過夜。
酶切后經(jīng)瓊脂糖電泳回收5400bp左右的空質(zhì)粒載體片段和1500bp左右的目的基因片段，然后進行連接反應，反應條件為：酶切回收后的空質(zhì)粒載體0.06pmol，表達Fab抗體的目的基因0.6pmol，T4DNA ligase 2μl，T4buffer 2.5μl，加dd H2O至25μl；16℃反應過夜。
由此制備獲得的重組質(zhì)粒表達載體命名為HL-pET30a，其進一步的擴增方法如下：
大腸桿菌Top10菌株適用于高效的DNA克隆和質(zhì)粒擴增，能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳。先將連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌Top10克隆感受態(tài)細胞中，具體的轉化條件為：
向100μl Top10感受態(tài)細胞中加入連接產(chǎn)物10μl，混勻，冰浴30min。離心管置于42℃水浴60s，快速移至冰浴中，冷卻2-3min。向每管加入900μl的無菌LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后置于37℃搖床上震蕩培養(yǎng)45min(200rpm)。離心后用100μl LB培養(yǎng)基重懸活化后的菌體，用涂布棒在LB(kanamycin+)平板上輕輕涂勻。將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)16h。
經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，測定質(zhì)粒濃度為82ng/μl，用Nde I和EcoR I對重組質(zhì)粒表達載體進行酶切后的瓊脂糖電泳鑒定，結果表明有正確大小的表達Fab抗體的目的基因被擴增與分離。
3)重組質(zhì)粒表達載體hPDI-pCDFDuet的構建
pCDFDuet-1空質(zhì)粒載體中有兩組啟動子和多克隆位點，本發(fā)明選用的是其中一組，蛋白表達區(qū)域是由T7啟動子引導的，后面連接乳糖操縱子(lac operator)序列，之后有一段核糖體結合位點(ribosome binding site,RBS)。多克隆位點包含Nde I、Bgl II、Mfe I、EcoR V、Fse I、AsiS I、Zral I、Aat II、Acc65I、Kpn I、Ava I、Xho I、Pac I、Avr I。pCDFDuet-1載體為鏈霉素(Streptomycin)抗性標記的。通過用Nde I和Xho I酶切空質(zhì)粒載體后連接如上PCR擴增的目的基因，可以構建表達SEQ ID No:9的氨基酸序列的hPDI的重組質(zhì)粒表達載體，且由于質(zhì)粒載體中有乳糖操縱子序列，因此可以通過IPTG或乳糖調(diào)控目的基因的表達。
具體的Nde I和Xho I酶切空質(zhì)粒載體pCDFDuet-1和表達hPDI的目的基因的條件為：空質(zhì)粒載體或目的基因1μg，Nde I 2μl，Xho I 2μl，10×H buffer 4μl，加dd H2O至40μl；37℃反應過夜。
酶切后經(jīng)瓊脂糖電泳回收3800bp左右的空質(zhì)粒載體片段和1500bp左右的目的基因片段，然后進行連接反應，反應條件為：酶切回收后的空質(zhì)粒載體0.06pmol，表達hPDI的目的基因0.6pmol，T4DNA ligase 2μl，T4buffer 2.5μl，加dd H2O至25μl；16℃反應過夜。
由此制備獲得的重組質(zhì)粒表達載體命名為hPDI-pCDFDuet，其進一步的擴增方法如下：
向100μl Top10感受態(tài)細胞中加入連接產(chǎn)物10μl，混勻，冰浴30min。離心管置于42℃水浴60s，快速移至冰浴中，冷卻2-3min。向每管加入900μl的無菌LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后置于37℃搖床上震蕩培養(yǎng)45min(200rpm)。離心后用100μl LB培養(yǎng)基重懸活化后的菌體，用涂布棒在LB(Streptomycin+)平板上輕輕涂勻。將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)16h。
經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，測定質(zhì)粒濃度為214ng/μl，用Nde I和Xho I對重組質(zhì)粒表達載體進行酶切后的瓊脂糖電泳鑒定，結果表明有正確大小的表達hPDI的目的基因被擴增與分離。
4)重組大腸桿菌工程菌HL-pET30a/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)的構建
大腸桿菌工程菌來源為感受態(tài)的大腸桿菌BL21(DE3)(購自北京天根生物科技有限公司)。BL21菌株及其衍生菌株被廣泛用于重組蛋白的表達，該類菌株為蛋白酶基因缺陷型菌株，能夠有效避免重組蛋白酶解。BL21(DE3)工程菌包含整合在BL21菌株染色體上的λ噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)的lacUV5啟動子可以調(diào)控T7RNA聚合酶的表達，尤其適用于T7啟動子系統(tǒng)。
將hPDI-pCDFduet轉化到感受態(tài)的BL21(DE3)中，得到重組大腸桿菌中間菌株hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)。具體的轉化條件為：
向100μl BL21(DE3)感受態(tài)細胞中加入hPDI-pCDFduet質(zhì)粒2μl，混勻，冰浴30min。離心管置于42℃水浴60s，快速移至冰浴中，冷卻2-3min。向每管加入900μl的無菌LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后置于37℃搖床上震蕩培養(yǎng)45min(200rpm)。取100μl活化后的菌液，用涂布棒在LB(Streptomycin+)平板上輕輕涂勻。將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)16h。
將hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)轉接至12ml LB(Streptomycin+)培養(yǎng)基活化擴增，分裝至1.5ml離心管中，冰浴20分鐘。于4℃8000rpm×45s離心回收細胞。每1.5ml培養(yǎng)液離心后的菌體用預冷的0.1M CaCl2 500μl重懸洗滌。于4℃5000rpm×45s離心回收細胞。每1.5ml培養(yǎng)液離心后的菌體用冰預冷的85μl 0.1M CaCl2重懸，使之成為感受態(tài)細胞。
將HL-pET30a轉化到hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，得到重組大腸桿菌工程菌株HL-pET30a/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)。具體的轉化條件為：
向85μl hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)中間感受態(tài)細胞中加入HL-pET30a質(zhì)粒2μl，混勻，冰浴30min。離心管置于42℃水浴60s，快速移至冰浴中，冷卻2-3min。向每管加入900μl的無菌LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后置于37℃搖床上震蕩培養(yǎng)45min(200rpm)。取100μl活化后的菌液，用涂布棒在LB(kanamycin+，Streptomycin+)平板上輕輕涂勻。將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)16h。
實施例2：共表達hPDI與SEQ ID No:1的重鏈氨基酸序列、SEQ ID No:2的輕鏈氨基酸序列的Fab片段的重組大腸桿菌工程菌的構建
方法基本參照實施例1，但區(qū)別如下：
1)構建表達Fab抗體的目的基因時Fab抗體的重鏈基因序列為SEQ ID No:1的氨基酸序列對應的核苷酸序列，F(xiàn)ab抗體的輕鏈基因序列為SEQ ID No:2的氨基酸序列對應的核苷酸序列。
2)空質(zhì)粒載體為pET23b，由此制備獲得的重組質(zhì)粒表達載體命名為HL-pET23b。
3)HL-pET23b轉化到hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，得到重組大腸桿菌工程菌株HL-pET23b/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)。
實施例3：共表達hPDI與SEQ ID No:3的重鏈氨基酸序列、SEQ ID No:4的輕鏈氨基酸序列的Fab片段的重組大腸桿菌工程菌的構建
方法基本參照實施例1，但區(qū)別如下：
1)構建表達Fab抗體的目的基因時Fab抗體的重鏈基因序列為SEQ ID No:3的氨基酸序列對應的核苷酸序列，F(xiàn)ab抗體的輕鏈基因序列為SEQ ID No:4的氨基酸序列對應的核苷酸序列。
2)空質(zhì)粒載體為pET24a，由此制備獲得的重組質(zhì)粒表達載體命名為HL-pET24a。
3)HL-pET24a轉化到hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，得到重組大腸桿菌工程菌株HL-pET24a/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)。
實施例4：共表達hPDI與SEQ ID No:5的重鏈氨基酸序列、SEQ ID No:6的輕鏈氨基酸序列的Fab片段的重組大腸桿菌工程菌的構建
方法基本參照實施例1，但區(qū)別如下：
1)構建表達Fab抗體的目的基因時Fab抗體的重鏈基因序列為SEQ ID No:5的氨基酸序列對應的核苷酸序列，F(xiàn)ab抗體的輕鏈基因序列為SEQ ID No:6的氨基酸序列對應的核苷酸序列。
2)空質(zhì)粒載體為pET28a，由此制備獲得的重組質(zhì)粒表達載體命名為HL-pET28a。
3)HL-pET28a轉化到hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，得到重組大腸桿菌工程菌株HL-pET28a/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)。
實施例5：重組大腸桿菌工程菌的發(fā)酵
1)重組大腸桿菌工程菌HL-pET30a/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)的發(fā)酵
發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：胰蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖10g/L、檸檬酸鈉3g/L、KH2PO4·3H2O 5.2g/L、(NH4)2SO4 1.5g/L、Na2HPO4 4.05g/L、MgSO4·7H2O 1.0g/L，NaH2PO4·2H2O 3.0g/L、NH4Cl 0.2g/L、FeSO4·7H2O 5.45μg/L、ZnSO4·7H2O 2.55μg/L、CaCl2·2H2O 3.8μg/L、MnSO4·5H2O 1.5μg/L、CuSO4·5H2O 0.8μg/L、AlCl3·6H2O 0.3μg/L、(NH4)6IMo7O24·4H2O 0.1μg/L、H3BO3 0.5μg/L，Vitamin B1 2μg/L。
補料培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖750g/L、MgSO4·7H2O 20g/L、檸檬酸3g/L、KH2PO4·3H2O 7.15g/L、(NH4)2SO4 4.8g/L、Na2HPO4·12H2O 4g/L。
將重組大腸桿菌工程菌株HL-pET30a/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)克隆活化后保存甘油菌，成為一級種子。取10μl甘油菌至100ml LB培養(yǎng)基(kanamycin+，Streptomycin+，終濃度分別為100μg/ml、50μg/ml)中，于37℃、200rpm條件下過夜搖菌活化至OD＝4.0。成為二級種子。
將活化后的菌液以1:100的比例用無菌針筒接種至NBS(型號BioFlo III)發(fā)酵罐3.5L的發(fā)酵培養(yǎng)基(kanamycin+，Streptomycin+，終濃度分別為100μg/ml、50μg/ml)中，于37℃，攪拌速度250rpm開始培養(yǎng)，初始pH調(diào)整至7.0。利用Biocommand軟件(NBS發(fā)酵罐自帶控制軟件)記錄實時發(fā)酵參數(shù)：攪拌速度(Agitation)，溶解氧濃度(DO)，pH值，溫度(Temp)。每隔1小時取樣檢測OD600數(shù)值。
當溶氧下降到40％以下時，程序調(diào)整轉速由250rpm上升至400rpm，通入壓縮空氣，通氣量至1升/分鐘。5.5-6h，pH明顯上升，提示初始加入的葡萄糖被菌體消耗完畢，菌體開始利用含氮有機物作為碳源，產(chǎn)生的銨離子使發(fā)酵液pH上升，pH上升到7.05時使用Biocommand軟件程序自動補料，pH低于7.05時停止補料，pH下降到6.98時程序設定補充28％氨水調(diào)整pH值。從6h開始，溶氧下降到20％以下，此時增大通氣量至4升/分鐘。至OD600為12.0時，降溫到30℃，加入α-乳糖(20g/L)作為誘導劑進行誘導，加入速度為10g/L·h，流加結束后加入IPTG(1mM)進行進一步誘導，誘導時間為18h，總發(fā)酵時間為24h。
2)其他重組大腸桿菌工程菌的發(fā)酵
用與HL-pET30a/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)的發(fā)酵相同組成的培養(yǎng)基與相同的發(fā)酵條件進行HL-pET23b/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)、HL-pET24a/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)、HL-pET28a/hPDI-pCDFduet/BL21(DE3)的發(fā)酵。
實施例6：周質(zhì)空間發(fā)酵表達Fab抗體的提取
實施例5的各發(fā)酵液經(jīng)4℃，6000rpm離心處理30分鐘后取沉淀，按質(zhì)量體積比(g/ml)1:5加入如下組成的提取液：100mM濃度的醋酸鈉，50mM濃度的EDTA，100mM濃度的NaCl，并在沉淀與提取液混合后調(diào)節(jié)pH為9.5。然后于搖床內(nèi)37℃，200rpm震蕩提取48小時。4℃，6000rpm離心處理30分鐘后取上清即得提取液。
實施例7：周質(zhì)空間發(fā)酵表達Fab抗體量及其中正確二硫鍵組成比例的檢測
1)周質(zhì)空間發(fā)酵表達Fab抗體量檢測
采用ELISA法檢測周質(zhì)空間發(fā)酵表達Fab抗體的量，具體方法如下：
包被抗體為羊抗人IgG(Fab段特異，Jackson ImmunoResearch 109-001-006)以碳酸鹽緩沖液(50mM Na2CO3，50mM NaHCO3)稀釋至100μg/ml，使用96孔酶標板，每孔加入100μl，4℃過夜包被。棄去孔內(nèi)溶液，PBST洗滌緩沖液200μl/孔洗3次；每孔加封閉液(5％BSA-PBS緩沖液)100μl，37℃封閉1h。棄去孔內(nèi)溶液，PBST 200μl/孔洗3次。將人Fab抗體片段標準品(Jackson ImmunoResearch 009-000-007)稀釋至0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.08、0.06、0.05、0.04、0.02、0.01μg/ml，用PBS稀釋，每孔100μl；稀釋后的各實施例6的方法得到的提取液每孔100μl，37℃下孵育2h。棄去孔內(nèi)溶液，PBST洗孔5次，加對人源IgG Fab’有特異性的HRP標記二抗(Sigma A0293，1:5000，溶于5％BSA-PBS溶液)，100μl/孔，室溫孵育1h。棄去孔內(nèi)溶液，PBST洗孔5次，每孔200μl，加TMB底物顯色液，每孔100μl，室溫孵育20-30min后，各孔加100μl2M H2SO4終止反應，使用酶標儀檢測OD450，繪制標準曲線，計算樣品濃度。
2)周質(zhì)空間發(fā)酵表達Fab抗體中正確二硫鍵組成比例的檢測
按實施例6的方法獲得的各提取液通過SDS-PAGE非還原電泳后的Western blot進行正確二硫鍵組成比例的檢測。
其中SDS-PAGE非還原電泳的條件為：濃縮膠電泳電壓80V，時間20min；分離膠(濃度12％)電泳電壓120V，時間1h。SDS-PAGE電泳結束后，將去除濃縮膠后的分離膠取出，浸在純化水中。硝酸纖維素膜放入10ml電轉移緩沖液中2min。使用7分鐘轉移槽(南京金斯瑞生物科技有限公司)，將蛋白質(zhì)轉移夾心，從下至上順序為：陽極墊-硝酸纖維素膜-蛋白質(zhì)凝膠-防短路絕緣圈-陰極墊。陽極墊邊緣不要接觸金屬塊。轉膜7min。取出轉膜后的硝酸纖維素膜，標記，用TBST溶液快搖洗滌3次，每次5min。將硝酸纖維素膜放入TBST配制的5％牛血清白蛋白(BSA)中，室溫封閉1h。TBST溶液洗膜3次，取對人源IgG Fab有特異性的HRP標記二抗(Sigma A0293)，于5％BSA溶液中(1:5000)，浸沒硝酸纖維素膜，室溫孵育1h。TBST溶液洗膜3次。增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色。使用賽智凝膠成像儀拍照成像保存。
采用ImageJ軟件(美國國立衛(wèi)生研究院公共圖像處理軟件)確定顯色的各條帶的比例，從而確定周質(zhì)空間發(fā)酵表達Fab抗體中正確二硫鍵組成比例(正確組裝的抗TNF抗體Fab片段的分子量為47.8KD左右)。
通過以上兩步測定得到的各重組大腸桿菌工程菌發(fā)酵提取液上清中可溶性Fab抗體的含量及其中正確二硫鍵組成的比例如下表1所示，其中有效Fab抗體的含量為可溶性Fab抗體的含量與正確二硫鍵組成的比例的乘積。
表1各發(fā)酵提取液上清中可溶性Fab抗體的含量與正確二硫鍵組成的比例(一)
實施例8：對比實施例
類比實施例1的方法構建共表達葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease，氨基酸序列如SEQ ID No:12所示)與SEQ ID No:1的重鏈氨基酸序列、SEQ ID No:2的輕鏈氨基酸序列的Fab片段的重組大腸桿菌工程菌。
類比實施例2的方法構建共表達大腸桿菌二硫鍵合成酶(DsbC，氨基酸序列如SEQ ID No:13所示)與SEQ ID No:3的重鏈氨基酸序列、SEQ ID No:4的輕鏈氨基酸序列的Fab片段的重組大腸桿菌工程菌。
類比實施例3的方法構建共表達大腸桿菌肽基脯氨酰順反異構酶(PPIB，氨基酸序列如SEQ ID No:14所示)與SEQ ID No:5的重鏈氨基酸序列、SEQ ID No:6的輕鏈氨基酸序列的Fab片段的重組大腸桿菌工程菌。
類比實施例4的方法構建共表達分子伴侶“大腸桿菌17KD蛋白質(zhì)”(seventeen kilodalton protein，Skp，氨基酸序列如SEQ ID No:15所示)與SEQ ID No:7的重鏈氨基酸序列、SEQ ID No:8的輕鏈氨基酸序列的Fab片段的重組大腸桿菌工程菌。
Staphylococcal nuclease、DsbC、PPIB、Skp為四種其他常見的分子伴侶類物質(zhì)。
然后類比實施例5-7的方法進行發(fā)酵、提取與檢測，結果如下表2所示。
表2各發(fā)酵提取液上清中可溶性Fab抗體的含量與正確二硫鍵組成的比例(二)