本發(fā)明涉及生物工程，尤其是涉及一種匹馬霉素B菌株的基因工程改造方法。
背景技術(shù)：
匹馬霉素是一種常用的多烯類抗生素，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，被廣泛用作食品防腐添加劑、抗真菌獸藥以及用于角膜炎治療。在目前最常用的四種多烯類抗生素(匹馬霉素、兩性霉素B、制霉菌素和殺念菌素)中，匹馬霉素的溶血毒性最低。但匹馬霉素的毒性依舊是限制其臨床應(yīng)用的重要原因。因此，通過基因工程改造或化學(xué)衍生的方法進(jìn)一步降低匹馬霉素的溶血毒性，將極大地促進(jìn)匹馬霉素的臨床應(yīng)用。在前期的研究中，我們通過基因工程改造的方法，對(duì)匹馬霉素生物合成基因簇中的P450單加氧酶基因pimG進(jìn)行了失活，并成功從其發(fā)酵產(chǎn)物中鑒定得到了一種低毒的匹馬霉素衍生物—匹馬霉素B(4,5-脫環(huán)氧-12-脫羧-12甲基-匹馬霉素)。經(jīng)體外活性實(shí)驗(yàn)測(cè)定，匹馬霉素B的活性與匹馬霉素相似，而其毒性卻極大的降低，因此，匹馬霉素B是一種非常安全的低毒匹馬霉素衍生物，具有良好的應(yīng)用前景。
但是，P450單加氧酶基因pimG失活菌株QZ01除產(chǎn)生匹馬霉素B外，還產(chǎn)生另一高活性的匹馬霉素A(12-脫羧-12甲基-匹馬霉素)及無活性的匹馬霉素C(2-氫-3-羥基-4,5-脫環(huán)氧-12-脫羧-12甲基-匹馬霉素)。菌株QZ01發(fā)酵產(chǎn)物的復(fù)雜性大大增加了后續(xù)分離純化的難度，而其較低的產(chǎn)量也限制了匹馬霉素B的工業(yè)化生產(chǎn)。因此，通過基因工程改造的方法，消除菌株QZ01中匹馬霉素A及無活性匹馬霉素C的產(chǎn)生，并進(jìn)一步提高匹馬霉素B的產(chǎn)量，將極大地推動(dòng)匹馬霉素B的工業(yè)化生產(chǎn)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，匹馬霉素A是匹馬霉素B在P450單加氧酶PimD的催化下發(fā)生C4-C5位環(huán)氧化轉(zhuǎn)化而來，而匹馬霉素C的產(chǎn)生則是由PKS基因中DH12結(jié)構(gòu)域的活性不完全造成的。因此，我們?cè)赒Z01菌株中嘗試通過以完全活性的DH11KR11結(jié)構(gòu)域替換DH12KR12結(jié)構(gòu)域并缺失基因pimD，消除匹馬霉素A及C的產(chǎn)生，并提高匹馬霉素B的產(chǎn)量，進(jìn)而達(dá)到優(yōu)化產(chǎn)生菌株的目的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的，就是為了提高匹馬霉素B的產(chǎn)量，提供一種匹馬霉素B菌株的基因工程改造方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：一種匹馬霉素B菌株的基因工程改造方法，是通過在菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01中以PKS基因中的DH11KR11結(jié)構(gòu)域替換DH12KR12結(jié)構(gòu)域并缺失后修飾基因pimD，實(shí)現(xiàn)匹馬霉素B產(chǎn)量的大幅度提高，并完全消除了匹馬霉素A與匹馬霉素C的產(chǎn)生。
所述DH11KR11結(jié)構(gòu)域來源于PKS基因pimS3，DH11KR11結(jié)構(gòu)域的序列如SEQ ID NO.1所示。
所述DH12KR12結(jié)構(gòu)域來源于PKS基因pimS4，PKS基因pimS4的序列如SEQ ID NO.2所示，其中DH12KR12結(jié)構(gòu)域的范圍為2713bp至4614bp。
所述pimD為P450單加氧酶基因，負(fù)責(zé)編碼催化匹馬霉素B到匹馬霉素A的轉(zhuǎn)化，pimD基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
所述以PKS基因中的DH11KR11結(jié)構(gòu)域替換DH12KR12結(jié)構(gòu)域并缺失后修飾基因pimD的構(gòu)建步驟如下：
一、設(shè)計(jì)并構(gòu)建用于DH12KR12結(jié)構(gòu)域替換的質(zhì)粒I；
二、在菌株QZ01的基礎(chǔ)上同框敲除PKS基因pimS4得到受體菌株QZ11；
三、將步驟一構(gòu)建得到的質(zhì)粒I接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入受體菌株QZ11中，篩選得到DH12KR12結(jié)構(gòu)域替換菌株QZ12；
四、在菌株QZ12的基礎(chǔ)上同框敲除后修飾基因pimD，得到DH12KR12結(jié)構(gòu)域替換及基因pimD缺失菌株QZ13。
步驟一中所述質(zhì)粒I的構(gòu)建方法是，在質(zhì)粒pIB139的NdeI/XbaI位點(diǎn)插入6.1kb測(cè)序確認(rèn)的DH12KR12結(jié)構(gòu)域已被替換為DH11KR11結(jié)構(gòu)域的基因pimS4的PCR片段。
步驟二中所述受體菌株QZ11的構(gòu)建方法是，首先構(gòu)建PKS基因pimS4的同框缺失質(zhì)粒，并通過接合轉(zhuǎn)移同框缺失菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01中的基因pimS4，得到受體菌株QZ11。
步驟四中所述基因pimD缺失菌株QZ13的構(gòu)建方法是，首先構(gòu)建后修飾基因pimD的同框缺失質(zhì)粒，并通過接合轉(zhuǎn)移同框缺失菌株QZ12中的后修飾基因pimD，得到DH12KR12結(jié)構(gòu)域替換及基因pimD缺失菌株QZ13。
采用本發(fā)明的方法，可以解除PKS中DH12KR12結(jié)構(gòu)域活性偏低的限制，從而消除匹馬霉素C的產(chǎn)生，并缺失后修飾基因pimD，從而阻斷匹馬霉素B到匹馬霉素A的轉(zhuǎn)化，消除匹馬霉素A的產(chǎn)生，最終使匹馬霉素B的產(chǎn)量提高了約11倍，實(shí)驗(yàn)室搖瓶發(fā)酵水平達(dá)到805mg/L，極大推動(dòng)了匹馬霉素B的工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，并給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件或制造廠商的建議條件。
實(shí)施例
步驟一：整合型質(zhì)粒I的構(gòu)建
以菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01的基因組DNA為模板，使用引物KSAT12-F/R、DHKR11-F/R、ACP12TE-F/R，通過PCR擴(kuò)增得到替換后PKS基因pimS4的三個(gè)片段KSAT12、DHKR11、ACP12TE，通過基因測(cè)序確認(rèn)PCR片段的正確性。在質(zhì)粒pIB139的NdeI/XbaI位點(diǎn)同時(shí)插入測(cè)序正確的KSAT12、DHKR11與ACP12TE基因片段(NdeI/XbaI酶切位點(diǎn))；通過上述方法得到用于DH12KR12結(jié)構(gòu)域置換的質(zhì)粒I。
上述步驟一中所用到的引物序列如表1所示：
表1
步驟二：在菌株QZ01的基礎(chǔ)上敲除PKS基因pimS4得到受體菌株QZ11。
以菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01的基因組DNA為模板，使用引物pimS4-L-F/R及pimS4-R-F/R，通過PCR擴(kuò)增得到敲除PKS基因pimS4所需的同源臂pimS4-L(HindIII/XbaI酶切位點(diǎn))及pimS4-R(HindIII/KpnI酶切位點(diǎn))。測(cè)序確認(rèn)后，左右同源臂連接至經(jīng)KpnI/XbaI處理的質(zhì)粒pJTU1278，獲得基因pimS4缺失質(zhì)粒。通過接合轉(zhuǎn)移進(jìn)一步將基因pimS4缺失質(zhì)粒轉(zhuǎn)入菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01中，獲得接合子，經(jīng)進(jìn)一步的無抗松弛及PCR驗(yàn)證后，即獲得受體菌株QZ11。
上述步驟二中所用到的引物序列如表2所示：
表2
步驟三：將整合型質(zhì)粒I通過接合轉(zhuǎn)移的策略導(dǎo)入菌株QZ11，并篩選得到DH12KR12結(jié)構(gòu)域替換菌株QZ12。
將已構(gòu)建完成用于基因過表達(dá)的質(zhì)粒I轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌宿主E.coli ET12567(含有pUZ8002質(zhì)粒)中。取該轉(zhuǎn)化子于含有氯霉素、卡那霉素和阿泊拉霉素三種抗生素的LB中于37℃過夜培養(yǎng)，用相同的培養(yǎng)基，將過夜培養(yǎng)物按10％的比例轉(zhuǎn)接一次并培養(yǎng)4h，然后用新鮮的LB溶液漂洗菌體以除去培養(yǎng)物中的抗生素。于此同時(shí)制備菌株QZ01的新鮮孢子約109個(gè)，用TES溶液漂洗2～3次之后再用2mLTES溶液懸浮孢子，于50℃熱激10min后，冷卻至室溫，等體積加入2×孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)液后于37℃培養(yǎng)2.5h，并用新鮮的LB溶液漂洗孢子2～3次。將預(yù)萌發(fā)的孢子與之前制備的大腸桿菌宿主菌E.coli ET12567混合(孢子和宿主菌的比例約為10:1)均勻后涂布于YMG平板，待平板吹干后轉(zhuǎn)移至30℃培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)17h后取出平板，分別取阿泊拉霉素和萘啶酮酸兩種抗生素混勻于1mL無菌水中，覆蓋于YMG平板上，將平板晾干后轉(zhuǎn)移至30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一般3～5天后可見平板上有單菌落接合子長(zhǎng)出，通過菌絲體PCR驗(yàn)證和抗性驗(yàn)證的方法驗(yàn)證接合子正確，即得到DH12KR12結(jié)構(gòu)域替換菌株QZ12。
步驟四：在菌株QZ12的基礎(chǔ)上敲除基因pimD得到改造菌株QZ13。
以菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01的基因組DNA為模板，使用引物pimD-L-F/R及pimD-R-F/R，通過PCR擴(kuò)增得到敲除基因pimD所需的同源臂pimD-L(HindIII/XbaI酶切位點(diǎn))及pimD-R(HindIII/KpnI酶切位點(diǎn))。測(cè)序確認(rèn)后，左右同源臂連接至經(jīng)KpnI/XbaI處理的質(zhì)粒pJTU1278，獲得基因pimD缺失質(zhì)粒。通過接合轉(zhuǎn)移進(jìn)一步將基因pimD缺失質(zhì)粒轉(zhuǎn)入菌株QZ12中，獲得接合子，經(jīng)進(jìn)一步的無抗松弛及PCR驗(yàn)證后，即獲得改造菌株QZ13。
上述步驟四中所用到的引物序列如表3所示：
表3
步驟五：改造菌株QZ13的發(fā)酵培養(yǎng)及其產(chǎn)量測(cè)定
種子培養(yǎng)基各組分質(zhì)量體積比為葡萄糖1.75％、胰蛋白胨1.5％、氯化鈉1.0％；發(fā)酵培養(yǎng)基各組分質(zhì)量體積比為葡萄糖6.0％、酵母提取物0.7％、黃豆餅粉2.8％。按種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)配方，分別配制種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基，并分裝于250mL三棱瓶中，每瓶裝50mL，115℃滅菌30min，將過表達(dá)菌株及對(duì)照菌株菌絲體接入上述種子培養(yǎng)基中，以220rpm轉(zhuǎn)速、30℃下、搖床培養(yǎng)24h得種子培養(yǎng)液。將種子培養(yǎng)液按10％接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，以220rpm轉(zhuǎn)速、30℃下，搖床培養(yǎng)5d。
使用Agilent公司的Agilent 1200系列HPLC進(jìn)行色譜分析，采用DAD二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定303nm下的色譜吸收峰。色譜柱的參數(shù)為：Agilent TC-C18，5μm，4.6×250mm；流動(dòng)相流速為1mL/min；流動(dòng)相組成及其體積比為：67％的含0.1％甲酸(v/v)的水溶液和33％的HPLC級(jí)乙腈。柱溫：35℃。
表4為出發(fā)菌株QZ01與改造菌株QZ13的發(fā)酵產(chǎn)量數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，改造菌株QZ13不再產(chǎn)生匹馬霉素A及無活性匹馬霉素C，并且低毒匹馬霉素B的產(chǎn)量提高了約11倍，達(dá)到805mg/L，為匹馬霉素B的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
表4：出發(fā)菌株QZ01與改造菌株QZ13的發(fā)酵產(chǎn)量數(shù)據(jù)
—表示該菌株不產(chǎn)生這一類抗生素。