專利名稱：：一種制備納他霉素的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種制備納他霉素的方法。技術背景納他霉素(Natamycin)是一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌抗生素，也稱游霉素或匹馬霉素(Pimaricin)，它由5個多聚乙酰合成酶基因編碼的多酶體系合成，能夠?qū)Ｐ砸种平湍妇兔咕?，阻止絲狀真菌中黃曲霉素的形成。其實際使用劑量為10—6數(shù)量級，具有低劑量、高效率，抗菌作用時間長的特點，是一種高效、安全的天然生物性食品防腐劑和抗菌添加劑，目前已在30多個國家廣泛使用，包括歐盟、大部分北美和東歐國家以及一些中東國家，甚至瑞士這樣對食品安全非常重視的國家也允許在面包和奶酪產(chǎn)品中使用納他霉素。1996年我國食品添加劑委員會對納他霉素進行評價并建議批準使用，1997年3月，我國衛(wèi)生部正式批準納他霉素作為食品防腐劑，其商品名稱為霉克(NatamycinTM)。納他霉素對幾乎所有的霉菌和酵母菌具有抗性，抑菌作用比山梨酸強50倍左右，且連續(xù)數(shù)年使用也不易引起靶標真菌形成抗性，但對細菌和病毒無效。因此它在以細菌發(fā)酵為基礎的食品行業(yè)有著廣泛的應用前景。作為食品防腐劑，可應用于果醬、黃油、桔汁、生肉和沙拉醬等的防霉，延長食品的保質(zhì)期，防止酵母和霉菌引起的霉變，減少因為變質(zhì)而引起的食品回收，降低生產(chǎn)成本，且不改變食品的風味，滿足消費者對天然食品的要求。納他霉素也可以作為醫(yī)學上的高效抗菌劑，對口腔念球菌感染，真菌性眼角膜潰瘍，角膜炎，皮膚及粘液膜真菌感染等疾病都有很好的治療效果。隨著研究的不斷深入，納他霉素的應用范圍正在繼續(xù)擴大，發(fā)揮著越來越大的作用。利迪鏈霉菌(S^repz^^ces7y力'cwsDeBoeretal.)是習居于土壤的腐生微生物，研究歷史悠久，已知有許多菌株在代謝過程中能夠產(chǎn)生各種抗菌活性物質(zhì)。其著名的代表菌株是S.7j^/icMNRRL2433，該菌株在醫(yī)藥領域研究和應用廣泛，可產(chǎn)生具有廣譜抗細菌和分枝桿菌作用的利迪霉素(Lydimycin)和抗革蘭氏陽性細菌和分枝桿菌的利迪鏈菌素(Str印tolydigin);另外有產(chǎn)生抗少數(shù)大腸桿菌和克氏肺炎桿菌的蘋果酸氧霉素(Malioxamycin)的&7y^'c^1574，以及產(chǎn)生抗革蘭氏陽性細菌和耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的抗生素Lydicamycin的菌株。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種制備納他霉素的方法。本發(fā)明所提供的制備納他霉素的方法，是發(fā)酵利迪鏈霉菌(5Yr印"/^c^"&'CM)得到納他霉素。所述禾U迪鏈霉菌(5Yrep"/HycesJ70^cws)可為禾廿迪鏈霉菌(5Yre/^o/HycesJ7力'cws)AOlCGMCCNo.1653或利迪鏈霉菌(5"z^印t咖yces7;^/icws)A02CGMCCNo.1654。利迪鏈霉菌AOlCGMCCNo.1653是從北京密云縣蔬菜田土壤中分離篩選獲得，利迪鏈霉菌A02CGMCCNo.1654是從北京遠郊天然次生林土壤中分離篩選得到的。其已于2006年03月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏登記號分別為CGMCCNo.1653和CGMCCNo.1654。其中，發(fā)酵所述利迪鏈霉菌(6Yrepfo/^ces7yA'cw50AOlCGMCCNo.1653的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為每升培養(yǎng)基中含有黃豆粉2%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉O.5%，葡萄糖2%，玉米漿O.25%，(NH4)2S040.25%，MgS04.7H200.025%，K2HP040.002%，NaClO.4%，CaCO30.2%，其余為水；所述利迪鏈霉菌A01CGMCCNo.1653的發(fā)酵培養(yǎng)基的自然起始pH值約為5-6;所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。發(fā)酵所述利迪鏈霉菌(6Yre/^o歷7cesJyo^'c^)A01CGMCCNo.1653的條件可為在28。C的條件下，以13mm的旋轉(zhuǎn)半徑、180rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)。發(fā)酵所述利迪鏈霉菌(5"^re/力o/z/cesJyA'cws)A02CGMCCNo.1654的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為每升培養(yǎng)基中含有由15g黃豆粒得到的提取液，5g蛋白胨，10g蔗糖，10g淀粉，2.5g硫酸銨，0.25g硫酸鎂，0.2g磷酸二氫鉀，5g氯化鈉，lg碳酸鈣，其余為水；所述利迪鏈霉菌(6Yrepfo歷yces7j^2'cws)A02CGMCCNo.1654的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7-8。其中，由15g黃豆粒得到的提取液按如下方法制備將15g黃豆粒加入蒸餾水中，煮沸0.5-lh，濾去固形物，得到由15g黃豆粒得到的提取液。發(fā)酵所述利迪鏈霉菌(5Yrepto/ff7cesJ/心ciAs)A02CGMCCNo.1654的條件具體可為在31"C的條件下，以13mra的旋轉(zhuǎn)半徑、240rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)。所述制備納他霉素的方法還包括分離純化納他霉素的步驟。其中，分離純化納他霉素的步驟具體可為1)收集發(fā)酵所述利迪鏈霉菌(5Yre/^o/z/ces得到的發(fā)酵液，用無水乙醇進行沉淀，收集上清液；2)將所述上清液依次進行樹脂吸附層析、硅膠吸附層析和高效液相色譜分離，得到納他霉素。當所述利迪鏈霉菌(5Yrepfo/z7/ces7/力'c"s)為利迪鏈霉菌(5Yre/^o歷yces7yo7cws)A01CGMCCNo.1653時，分離純化方法具體如下所述樹脂吸附層析采用D4006大孔樹脂，洗脫條件是依次用1倍柱體積的去離子水、1.5倍柱體積的50%甲醇和2.5倍柱體積的80%乙醇洗脫，收集流出量為3.5倍至4.5倍柱體積之間的洗脫液；所述百分含量為體積百分含量；所述硅膠吸附層析采用200300目硅膠，洗脫條件是用體積比為l:2:l的正丁醇、甲醇和水的混合液進行洗脫，收集流出量為0.33倍至0.6倍柱體積之間的洗脫液；所述高效液相色譜分離采用LC-9101型循環(huán)制備高效液相色譜儀和JAIGEL-ODS-AP型SP-120-15制備柱，以體積比為7:3的甲醇和水的混合液為流動相，分離二次，收集第二次分離時保留時間為38.399min的洗脫峰。當所述利迪鏈霉菌(5Yre/^咖yces7j7/icws)為利迪鏈霉菌(6Yre/^咖ycesJ/力'c^)A02CGMCCNo.1654時，分離純化方法具體如下所述樹脂吸附層析采用X-5大孔樹脂，洗脫條件是依次用2倍柱體積的去離子水、2倍柱體積的30%甲醇和2倍柱體積的70%乙醇洗脫，收集流出量為4.8倍至5.6倍柱體積之間的洗脫液；所述百分含量為體積百分含量；所述硅膠吸附層析采用100200目硅膠，洗脫條件是用其體積比為8:1:1的乙醇、氨水和水的混合液進行洗脫，收集流出量為0.23倍至1.2倍柱體積之間的洗脫液；所述高效液相色譜分離采用LC-9101型循環(huán)制備高效液相色譜儀和JAIGEL-ODS-AP型SP-120-15制備柱，以體積比為7:3的甲醇和水的混合液為流動相，分離三次，收集第三次分離時保留時間為39.766min的洗脫峰。本發(fā)明生產(chǎn)納他霉素的方法，開創(chuàng)性地用利迪鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素，從而為生產(chǎn)納他霉素提供了新的途徑。本發(fā)明方法分離純化得到的納他霉素純度很高，達99%以上。因此，本發(fā)明將在高純度納他霉素的生產(chǎn)中得到廣泛應用。圖1A為利迪鏈霉菌(5Yr印t咖/ces77&'ci/s)A01CGMCCNo.1653無菌發(fā)酵濾液對酵母菌的抑制作用。圖IB為利迪鏈霉菌(5Yr印"/z^ces7y力'c(/s)AOlCGMCCNo.1653無菌發(fā)酵濾液對灰葡萄孢的抑制作用。圖2A為利迪鏈霉菌(5Yre;^咖ycesA02CGMCCNo.1654無菌發(fā)酵濾液對酵母菌的抑制作用。圖2B為利迪鏈霉菌(5"^re/7fo/^ces"Wcm)A02CGMCCNo.1654無菌發(fā)酵濾液對灰葡萄孢的抑制作用。圖3為利迪鏈霉菌(5"^re/Z^z^ces7yo7cws)AOlCGMCCNo.1653活性產(chǎn)物的捷克八溶劑系統(tǒng)紙層析結(jié)果。圖4為利迪鏈霉菌(6Yre/^咖yces77力'cfAs)AOlCGMCCNo.1653活性物質(zhì)粗提物的紫外吸收光譜圖。圖5A為利迪鏈霉菌(5Yrep"/z/cesJy&'ciAs)AOlCGMCCNo.1653活性產(chǎn)物的HPLC第一次分離譜圖。圖5B為利迪鏈霉菌(5Yr印fo/^cesAOlCGMCCNo.1653活性產(chǎn)物的HPLC第二次分離譜圖。圖6A為利迪鏈霉菌(5Yre;fo/^cesJya^'cws)A02CGMCCNo.1654活性產(chǎn)物的HPLC第一次分離譜圖。圖6B為利迪鏈霉菌(5Yre/^o/z^ces7y力'ciAs)A02CGMCCNo.1654活性產(chǎn)物的HPLC第三次分離譜圖。圖7A為利迪鏈霉菌(5Yre/^o/zyces^r力'c〃s)AOlCGMCCNo.1653活性產(chǎn)物純樣品的紫外掃描圖譜。圖7B為利迪鏈霉菌(5Yrepfo/z/ces7yo7cws)A02CGMCCNo.1654活性產(chǎn)物純樣品的紫外掃描圖譜。圖8A為利迪鏈霉菌(5Yre/^咖yces7yA'cw5)AOlCGMCCNo.1653活性產(chǎn)物純樣品的紅外吸收光譜。圖8B為利迪鏈霉菌(5Yre;^o/ff7cesJyWcM)A02CGMCCNo.1654活性產(chǎn)物純樣品的紅外吸收光譜。圖9A-a為利迪鏈霉菌(6Yre/JZ^yces7y力'ci/s)AOlCGMCCNo.1653活性產(chǎn)物純樣品的高分辨質(zhì)譜圖(負離子)。圖9A-b為利迪鏈霉菌(5Yrepfo/_KcesJj&'cws)AOlCGMCCNo.1653活性產(chǎn)物純樣品的高分辨質(zhì)譜圖(正離子)。圖9B-a為利迪鏈霉菌(5Yrept咖ycesA02CGMCCNo.1654活性產(chǎn)物純樣品的高分辨質(zhì)譜圖(負離子)。圖9B-b為利迪鏈霉菌(5Yrept咖yces7y力'cz/s)A02CGMCCNo.1654活性產(chǎn)物純樣品的高分辨質(zhì)譜圖(正離子)。圖IOA為利迪鏈霉菌(6Yr印z^z7cesAOlCGMCCNo.1653活性產(chǎn)物純樣品的核磁共振氫譜(500MHz)。圖IOB為利迪鏈霉菌(&rep^MycesJyo^cws)A01CGMCCNo.1653活性產(chǎn)物純樣品的核磁共振碳譜(500MHz)。圖IIA為利迪鏈霉菌(5Yr印"/H/ces7j^z'ct/s)A02CGMCCNo.1654活性產(chǎn)物純樣品的核磁共振氫譜(500MHz)。圖IIB為利迪鏈霉菌(5"tre/^咖7cesJy&'cM)A02CGMCCNo.1654活性產(chǎn)物純樣品的核磁共振碳譜(500MHz)。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。實施例中所使用的培養(yǎng)基如下1、高氏一號培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有K2HP040.5g，NaCl0.5g，KN031.0g，F(xiàn)eS047H200.01g，MgS047H200.5g，可溶性淀粉20g，瓊脂20g，其余為水；所述高氏一號培養(yǎng)基的pH為7.2-7.4。2、利迪鏈霉菌AOlCGMCCNo.1653的種子培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有黃豆粉20g，蛋白胨5g，可溶性淀粉10g，葡萄糖20g，玉米漿2.5g，(NH4)2S042.5g，K2HP040.02g，NaCl4g，CaC036g，其余為水；所述利迪鏈霉菌A01CGMCCNo.1653的種子培養(yǎng)基的pH為7.2。121。C滅菌30min。3、利迪鏈霉菌A01CGMCCNo.1653的發(fā)酵培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有黃豆粉2%，蛋白胨O.5%，可溶性淀粉O.5%，葡萄糖2%，玉米漿0.25%，(NH4)2S040.25%，MgS047H200.025%,K2HP040,002%，NaCl0.4%，CaC030.2%，其余為水；該發(fā)酵培養(yǎng)基的自然起始pH值為5.6。其中，各百分含量均為質(zhì)量百分含量。4、利迪鏈霉菌(5Yrep^wyces7yo7cws)A02CGMCCNo.1654的種子培養(yǎng)基由15g黃豆粒得到的提取液，5g蛋白胨，20g葡萄糖，10g淀粉，2.5g硫酸銨，0.25g硫酸鎂，0.2g磷酸二氫鉀，5g氯化鈉，配成水溶液，調(diào)pH7-8后，加lg碳酸l丐，加水定容至lOOOml。5、利迪鏈霉菌(5Yre;^M^cesJy&'c^)A02CGMCCNo.1654發(fā)酵培養(yǎng)基由15g黃豆粒得到的提取液，5g蛋白胨，10g蔗糖，10g淀粉，2.5g硫酸銨，0.25g硫酸鎂，0.2g磷酸二氫鉀，5g氯化鈉，配成水溶液，調(diào)pH7-8后，加lg碳酸鈣，加水定容至1000ml。其中，由15g黃豆粒得到的提取液按如下方法制備將15g黃豆粒加入適量蒸餾水中，煮沸0.5-lh，濾去固形物，得到由15g黃豆粒得到的提取液。6、PDA培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含有馬鈴薯200g，蔗糖10—20g，瓊脂17—20g，其余為水；pH自然。實施例l、利迪鏈霉菌(5Yr印z^M77ces7/Wc"s)A01CGMCCNo.1653的分離從北京密云縣蔬菜田采集土樣，取10g加入內(nèi)裝100ml無菌水和適量玻璃珠的三角瓶中，置搖床上100rpm振蕩20min,取O.5ml加入4.5ml無菌水中，再依次稀釋102、103、104倍，各取以上土壤懸液O.lml分別均勻涂布在高氏一號培養(yǎng)基平板上，超凈工作臺內(nèi)吹至略干；每濃度3個重復，置28"C恒溫箱中培養(yǎng)5-IO天，挑取放線菌單菌落進行稀釋劃線分離純化，得到純培養(yǎng)菌株。初篩獲得的純培養(yǎng)菌株進行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)O.45pm的無菌微孔濾膜過濾除菌獲得無菌發(fā)酵濾液；以釀酒酵母(&cc力aro/^cescerew'w'aeACCC20036)、黑曲霉"印ej^i"〃sd>erACCC30005)和灰葡萄孢(&t」ryd'sc&ereaACCC30091)為指示菌，利用管碟法或洋菜打孔法檢測發(fā)酵液的抑菌活性；對初篩獲得的有抑菌活性的菌株的無菌發(fā)酵濾液進行乙醇沉淀去除雜質(zhì)，上清液進行紫外掃描獲得紫外圖譜，并與多烯類抗生素的圖譜進行比較，篩選出具有多烯類典型吸收峰的紫外圖譜的菌株；將復篩獲得的菌株的無菌發(fā)酵濾液去除雜質(zhì)濃縮后進行柱層析分離，并用指示菌跟蹤檢測各分離組分的活性，對主要活性組分進行制備型高效液相色譜分離得到其純樣品；檢測鑒定該純樣品，最終篩選出能夠產(chǎn)生納他霉素的菌株——利迪鏈霉菌AOlCGMCCNo.1653。利迪鏈霉菌AOlCGMCCNo.1653的微生物學特性鑒定(1)菌體的形態(tài)特征革蘭氏染色陽性；在GYM瓊脂、JCM42"瓊脂、燕麥粉瓊脂等培養(yǎng)基上生長7天后，基內(nèi)菌絲發(fā)育良好，無橫隔，不斷裂；氣生菌絲生長良好，多分枝；孢子絲直、柔曲或彎曲，孢子橢圓形。(2)培養(yǎng)特性在6種固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性如表1所示。表1利迪鏈霉菌AOlCGMCCNo.1653的培養(yǎng)特性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(3)生理生化特性利迪鏈霉菌AOlCGMCCNo.1653的生理生化特性如表2所示。表2利迪鏈霉菌AOlCGMCCNo.1653的生理生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注"W"表示弱陽性結(jié)果；"+"表示陽性結(jié)果；"一"表示陰性結(jié)果。(4)16SrDNA序列利迪鏈霉菌AOlCGMCCNo.1653的部分16SrDNA序列如序列表中序列l(wèi)所示。與GenBank中相關序列Blast比較的結(jié)果表明其屬于鏈霉菌屬；其16SrDNA序列與已知的利迪鏈霉菌菌株NRRL2433相比相似性很高，為100%。綜合其形態(tài)學特征、培養(yǎng)特性、生理生化特性和16SrDNA序列分析的結(jié)果，將其鑒定為利迪鏈霉菌(5Yre/^o/^cesJ7^'cm)，并將此菌株定名為利迪鏈霉菌(5^repto歷7cesJj^/iciAs)AOl。禾!j迪鏈霉菌(5Yre/^o歷yces2j^z.ciAS)A01已于2006年03月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏登記號為CGMCCNo.1653。實施例2、利用利迪鏈霉菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素利迪鏈霉菌AOlCGMCCNo.1653和A02CGMCCNo.1654在代謝過程中能夠向培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量的生物活性物質(zhì)。該生物活性物質(zhì)對指示菌株釀酒酵母ACCC20036、黑曲霉ACCC30005和灰葡萄孢ACCC30091具有強烈的抑制作用；其捷克八溶劑系統(tǒng)的紙層析圖譜與多烯類抗生素的一致；其紫外光譜表現(xiàn)四烯類抗生素所特有的典型吸收峰，這與捷克八溶劑系統(tǒng)紙層析的結(jié)果相一致；對其進行初步分離后發(fā)現(xiàn)有2個活性組分，對主要活性組分純化后進行紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)和核磁共振譜(麗R)檢測分析，結(jié)果表明其分子量、分子式和化學結(jié)構(gòu)均與納他霉素相同。納他霉素的具體生產(chǎn)和鑒定方法如下一、納他霉素的制備1、利用利迪鏈霉菌(5Yre;^咖yces7y力'cws)AOlCGMCCNo.1653搖瓶發(fā)酵制備納他霉素斜面培養(yǎng)將利迪鏈霉菌(5"^re/z^/z7/ces7y^'ciAs)AOlCGMCCNo.1653接種到高氏一號斜面培養(yǎng)基上，28。C培養(yǎng)7-10天至其產(chǎn)生足量的孢子；種子培養(yǎng)用無菌鉑環(huán)刮取其孢子3—5環(huán)接種于裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶內(nèi)，置可控溫搖床上，在28。C條件下，以13mm的旋轉(zhuǎn)半徑、180rpm的轉(zhuǎn)速恒溫振蕩培養(yǎng)20-24h;發(fā)酵培養(yǎng)取上述種子培養(yǎng)液按3%(V/V)的接種量接種于裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶內(nèi)，在28。C條件下，以13mm的旋轉(zhuǎn)半徑、180rpm的轉(zhuǎn)速恒溫振蕩培養(yǎng)96h。此時菌株已在發(fā)酵液中產(chǎn)生高濃度的納他霉素。發(fā)酵液經(jīng)O.45pm的無菌微孔濾膜過濾除菌獲得無菌發(fā)酵濾液，分別以釀酒酵母ACCC20036和灰葡萄孢ACCC30091為指示菌，利用洋菜打孔法進行活性檢測，發(fā)酵液的抑菌圈直徑分別達31.Oran和43.0mra(圖lA和圖lB)。2、利迪鏈霉菌(5Yrept咖7ces7y力'c^)A02CGMCCNo.1654搖瓶發(fā)酵制備納他霉素斜面培養(yǎng)將利迪鏈霉菌(5Yrepz^/z7ces^g7cm)A02CGMCCNo.1654接種到高氏一號斜面培養(yǎng)基上，28"培養(yǎng)7-10天至其產(chǎn)生足量的孢子；種子培養(yǎng)用無菌鉑環(huán)刮取2—3環(huán)孢子接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶內(nèi)，在28X:條件下，以13mm的旋轉(zhuǎn)半徑、200rpm的轉(zhuǎn)速恒溫振蕩培養(yǎng)24h-30h;發(fā)酵培養(yǎng)在無菌條件下，將種子培養(yǎng)液以5y。(V/V)的接種量接種于裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶內(nèi)，在31。C條件下，以13mm的旋轉(zhuǎn)半徑、240rpm的轉(zhuǎn)速恒溫振蕩培養(yǎng)96h。此時菌株已在發(fā)酵液中產(chǎn)生高濃度的納他霉素。發(fā)酵液經(jīng)O.45pm的無菌微孔濾膜過濾除菌獲得無菌發(fā)酵濾液，按上述方法測定其抑菌活性，其對釀酒酵母ACCC20036和灰葡萄孢ACCC30091的抑菌圈直徑分別達32.0mm和47.0mm(圖2A和圖2B)。二、發(fā)酵液中納他霉素的粗提和初步鑒定(一)發(fā)酵液中納他霉素的粗提將上述利迪鏈霉菌(5Yre/^咖yces7yc/i'cws)A01CGMCCNo.1653和利迪鏈霉菌(5Yr印z^zyces7yo7c"s)A02CGMCCNo.1654的發(fā)酵液分別用3倍體積的無水乙醇預處理，4。C靜置2h，以沉淀菌體、固形顆粒、可溶性粘膠狀物、核酸和雜蛋白質(zhì)以及中間代謝產(chǎn)物等，上清液用2層濾紙以布氏漏斗真空抽濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45'C下減壓濃縮，濃縮液即為活性物質(zhì)粗提物，4r保存?zhèn)溆谩?二)發(fā)酵液中納他霉素的初步鑒定采用捷克八溶劑系統(tǒng)紙層析來鑒別活性物質(zhì)的化學類型，同時在190mn400nm范圍內(nèi)對其進行全波長掃描。1、捷克八溶劑系統(tǒng)紙層析溶劑系統(tǒng)為I.水飽和的正丁醇；II.含2%(質(zhì)量百分含量)對甲基苯磺酸的水飽和的正丁醇溶液；III.正丁醇醋酸水(體積比)=2:1:1;IV.含2%(質(zhì)量百分含量)六氫吡啶的水飽和的正丁醇；V.正丁醇飽和的0.5mo1/1pH為7.0的磷酸緩沖液；VI.含2%(質(zhì)量百分含量)對甲基苯磺酸的正丁醇飽和的水；W.苯甲醇(體積比)=4:1，濾紙用0.5mo1/1pH7.0的磷酸緩沖液處理；VID.甲醇3%(質(zhì)量百分含量)NaCl水溶液(體積比)=3:1，濾紙用5%(質(zhì)量百分含量)硫酸鈉水溶液處理；采用新華一號濾紙，裁成長16XIcm的紙條；層析在20cmX3cm的試管中進行；具體操作步驟如下①每支試管中分別加入各溶劑系統(tǒng)展開劑4ml，用橡皮塞封口，讓展開劑的蒸汽充滿整個展層空間；②取上述納他霉素粗提物樣品，用微量移液器或毛細管在濾紙條的一端分多次點樣，每次在自動干手器下邊點邊以熱風吹干，上樣量為15W，點樣的直徑以不超過5mm為宜；③待濾紙上的樣品吸干后，先將其懸掛在試管內(nèi)，用橡皮塞密閉管口，使濾紙在展開劑的蒸汽中平衡0.5h后，將其點樣端浸于展開劑中上行展層，勿使溶劑與樣品直接接觸；待展開劑接近前沿時，取出濾紙條懸于通風櫥中晾干或用熱吹風使溶劑盡量揮發(fā)；④在無菌條件下用定制的方形玻璃盤制備PDA平板，取適量培養(yǎng)好的灰葡萄孢ACCC30091的孢子懸浮液均勻涂布在平板上；將層析后的濾紙條依次貼于平板上，室溫靜置約30min，使紙條上相應部位的活性物質(zhì)滲透擴散到培養(yǎng)基中；用無菌小鑷子取出紙條，并標記其在平板上的位置；將平板置25。C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h進行生物學顯影；⑤根據(jù)生物活性顯示的結(jié)果，測量有效成分在不同pH下的展層距離，按下述公式計算遷移率Rf值，畫出pH層析譜Rf二原點到抑菌圈中心的距離/原點到溶劑前沿的距離。紙層析結(jié)果顯示，2個菌株的活性物質(zhì)的圖譜基本一致，在溶劑II和溶劑VI中不顯跡，溶劑W中不移動，即Rf值為O(圖3)，這與多烯類抗生素在八溶劑系統(tǒng)中的紙層析圖譜相近。這表明其產(chǎn)生的活性物質(zhì)可能屬于多烯類抗生素。其中在溶劑III中在點樣量大時偶爾出現(xiàn)一大(Rf=0.333)—小(Rf=0.754)兩個抑菌區(qū)域，表明該活性物質(zhì)至少有兩個活性組分。2、紫外掃描將步驟(一)獲得的納他霉素粗提物樣品用去離子水稀釋40倍，以去離子水做空白對照，采用日立UV-VIS3010紫外可見分光光度計在190nm400nm范圍內(nèi)進行全波長掃描。2個菌株粗提物的紫外吸收光譜中，雖然雜質(zhì)峰較多，但在292nm、305nm和319nm處有明顯的三個吸收峰(圖4)，多次重復該試驗發(fā)現(xiàn)樣品的濃度越大吸收峰的峰值越高，表明活性物質(zhì)的含量越高。這三個典型的吸收峰是多烯類中四烯類抗生素所特有的特征峰，這與捷克八溶劑系統(tǒng)紙層析的測定結(jié)果一致。據(jù)上述分析，初步確定2個菌株所產(chǎn)生的活性物質(zhì)的有效組分屬于四烯類抗生素。三、納他霉素粗提物的分離純化通過大孔樹脂柱層析、硅膠柱層析和高效液相色譜儀HPLC進行逐步分離純化。1、大孔樹脂吸附柱層析對于利迪鏈霉菌(5"^r印z^^cesJ/o7c^)A01CGMCCNo.1653，選用40cmX2.6cm玻璃層析柱，D4006大孔樹脂(天津南開大學化工廠)，大孔樹脂按廠家說明預處理后用適量去離子水調(diào)勻，緩慢加入裝有l(wèi)/3體積去離子水的層析柱中，同時從柱底部以勻速緩慢放出蒸餾水，使柱中液面始終保持在樹脂層上面。裝至約3/4柱高度，自然沉降610h，使平衡后的裝柱體積為150ml。將納他霉素粗提物與樹脂按2:l的體積比進行動態(tài)吸附；吸附完畢后，關閉與柱所連的恒流泵，層析柱靜置2h，然后依次用1倍柱體積的去離子水、1.5倍柱體積的50%(體積百分含量)甲醇和2.5倍柱體積的80%(體積百分含量)乙醇洗脫，洗脫速度為0.5ml/min，用自動部分收集器分管收集洗脫液，每管15ml。以釀酒酵母菌ACCC20036為指示菌，利用濾紙片瓊脂擴散法檢測每管洗脫液活性。結(jié)果表明活性洗脫液集中在第3545管(即自流出量為3.5倍柱體積至4.5倍柱體積之間的洗脫液)。對于利迪鏈霉菌(5"z^repto歷7ces"dic〃s)A02CGMCCNo.1654，選用40cmX2.6cm玻璃層析柱，X-5大孔樹脂(天津南開大學化工廠)。用上述同樣的方法裝柱。取納他霉素粗提物與樹脂按1:1的體積比進行動態(tài)吸附。洗脫過程為2倍柱體積的無離子水洗脫除去部分色素和大量水溶性雜質(zhì)；2倍柱體積的30%(體積百分含量)甲醇洗脫去色素；最后用2倍柱體積的70%(體積百分含量)乙醇洗脫活性成分。分管收集洗脫液，每管15ml，濾紙片法進行活性測定。結(jié)果表明活性洗脫液集中在第4856管(即自4.8倍柱體積至5.6倍柱體積之間的洗脫液)。分別合并各菌株有活性的洗脫液，45°C下減壓濃縮后供下一步分離。2、硅膠吸附柱層析對于利迪鏈霉菌(6Yr印z^/z/ces"o7c〃s)A01CGMCCNo.1653，選用40cmX2.6cm玻璃層析柱，200300目硅膠，以體積比為1:2:1的正丁醇、甲醇和水的混合液為洗脫液；取約150g硅膠用去離子水浸泡3h，傾去細小顆粒，布氏漏斗真空抽濾除去水分；再用6mol/LHCl浸泡12h，然后用去離子水洗至中性，真空抽干；用無水乙醇浸泡過夜，真空抽干；臨用前在120。C下活化2h，干燥至恒重；層析柱中裝入l/3柱體積的洗脫液，然后緩慢加入用洗脫液混合均勻的硅膠，約至3/4柱高時停止加入，靜置610h，使硅膠緩慢沉降。然后用23倍體積的洗脫液以lmL/min的流速沖洗柱體，使之平衡。平衡后的柱體積為150ml。取步驟1的大孔樹脂活性洗脫濃縮液10ml上柱進行動態(tài)吸附，用23倍柱體積的洗脫液按0.5ral/min的流速進行洗脫，用自動部分收集器分管收集洗脫液，每管5ml。以釀酒酵母菌ACCC20036為指示菌，利用濾紙片瓊脂擴散法檢測每管洗脫液活性。結(jié)果表明其洗脫液中的活性組分集中在第1018管(即自0.33倍柱體積至0.6倍柱體積之間的洗脫液)。對于利迪鏈霉菌(5Yrepfo/^ces7y力'c〃s)A02CGMCCNo.1654，選用40cmX2.6cm玻璃層析柱，100目200目硅膠，以體積比為8:1:1的乙醇、氨水和水的混合液為洗脫液；用同樣的方法裝柱、上樣吸附、洗脫并進行活性檢測。結(jié)果表明其洗脫液中的活性組分集中在第736管(即自0.23倍柱體積至1.2倍柱體積之間的洗脫液)。分別合并各菌株的活性洗脫液，45。C真空減壓濃縮，濃縮液用于下一步分離。3、制備型HPLC分離純化采用LC-9101型循環(huán)制備HPLC，JAIGEL-0DS-AP型SP-120-15制備柱。取步驟2的硅膠柱層析后的活性洗脫濃縮液，用0.45Wn微孔濾器過濾，自動進樣器進樣，每次進樣量6ml;以甲醇水(體積比為7:3)為流動相進行分離，利用UV檢測器在波長305nin處檢測并自動形成分離圖譜；利用餾分收集器分別收集圖譜中各曲線峰所對應的洗脫液；以釀酒酵母菌ACCC20036為指示菌，利用濾紙片瓊脂擴散法檢測每管洗脫液活性。對于菌株A01CGMCCNo.1653，以2ml/min的泵流速相繼分離2次；對于菌株A02CGMCCNo.1654，以2ml/min的泵流速進行第一次分離后，再以3ml/min的泵流速相繼分離2次。實驗結(jié)果表明，菌株AOlCGMCCNo.1653的第一次HPLC分離共檢測到6個峰，其中在保留時間為57.399min的峰為主要活性峰(圖5A);對其進行的第二次分離檢測到保留時間為38.399min的峰為活性峰(圖5B)，其相對峰面積百分比為99.503%，表明樣品純度達99.503%以上。菌株A02CGMCCNo.1654的第一次HPLC分離共檢測到30個峰，其中保留時間為57.866rain的強吸收峰為活性峰(圖6A)，其相對峰面積為35.121%;對其進行的第二次分離檢測到6個峰，其中保留時間為41.699min的峰為活性峰，其相對峰面積為97.020%;第三次分離檢測到保留時間為39.766min的峰為活性峰(圖6B),通過峰面積計算其純度為99.845%。對2個菌株的最終樣品分別進行真空濃縮，干燥后呈白色或奶油色粉末。利用島津分析型HPLC分別采用下述兩種方法對其進行純度驗證。1)取少量樣品溶于70%甲醇水溶液，以甲醇(A)和水(B)為流動相進行梯度洗脫。色譜條件為U反相柱，柱溫30°C，UV檢測器，檢測波長305nm，SIL-10ADVP自動進樣器進樣1(^1，以lml/min的流速洗脫60min。梯度洗脫步驟如下時間(分)A(%)B(%)0103565112050502130653531408020415095551601000結(jié)果顯示洗脫曲線為單一的峰，說明其為單一組分，純度達到化學結(jié)構(gòu)測定的要求。2)取少量樣品溶于70%甲醇水溶液，以乙腈(A)和水(B)為流動相進行梯度洗脫。色譜條件為ds反相柱，柱溫3(TC，UV檢測器，檢測波長305nm，SIL-10ADVP自動進樣器進樣10nl，以lml/min的流速洗脫60min。梯度洗脫步驟如下時間(分)A(%)B(%)0153565163050503145703046601000結(jié)果顯示洗脫曲線為單一的峰，說明其為單一組分，純度達到化學結(jié)構(gòu)測定的要求。兩種驗證方法得到的結(jié)果一致。四、純化樣品化學結(jié)構(gòu)的解析鑒定1、紫外吸收光譜(uv)將上述步驟三純化的樣品極微量溶于超純水中，用日立UV—VIS3010紫外可見分光光度計在190nm400nm波長范圍內(nèi)以超純水為空白對照進行全波長掃描，自動形成紫外吸收圖譜。由紫外掃描圖譜可見，2個菌株活性物質(zhì)的紫外吸收峰均表現(xiàn)出典型的四烯類抗生素譜型，即在波長281nm、291nm、305nm和319nm附近均有典型的共軛四烯發(fā)色基團的吸收峰，其中波長305nm處吸收值最大，281nm處吸收值最小(圖7A和7B)，再次驗證了該活性物質(zhì)屬于多烯類中的四烯抗生素。2、紅外吸收光譜(IR)采用KBr壓片法，用德國BRUKER公司TENSOR27傅立葉紅外光譜儀進行400cm—'-4000cm—'區(qū)域內(nèi)掃描。菌株A01CGMCCNo.1653所生產(chǎn)的納他霉素純化樣品的紅外光譜如圖8A所示，其中vMX3593、3493、3280cm—1為分子中N-H和-OH的伸縮振動特征吸收峰；v_3017、2978、2940cm—'為分子中-CH3和-CH2的伸縮振動特征吸收峰；vmax1716cm—1為OO的強吸收特征峰；vmax1634、1570cm—工為C^伸縮振動的特征吸收峰；另外，在vmax1401、1267、1190、1107、1060、1003、885、847、798cm—'等處都有吸收峰。菌株A02CGMCCNo.1654的純化樣品的紅外光譜如圖8B所示，其中vraax3416.78cm—'為-OH的特征吸收峰；vmax3288.23cm—'為N-H的伸縮振動特征吸收峰；vmax2940.44和2980.27cnf'是-CH3的特征吸收峰；vMX3017.23cm—'是-012的特征吸收峰；vmax1715.38cm—'表現(xiàn)典型的羰基強吸收峰；vmax1571.44cnf'表現(xiàn)-C《-的強吸收峰；v_163140cm—'表現(xiàn)-OC-的弱吸收峰。3、高分辨質(zhì)譜采用德國BRUKER公司超高分辨率9.4T混合型四級桿傅立葉串聯(lián)質(zhì)譜儀(9.4TQ-FT-MS);條件capillary4000，DryGas:4.0l/s，源溫180°C，scanrange:3002000，syringepump:1.5ml/min，數(shù)據(jù)分析軟件為BrukerDaltonicsDataAnalysis3.4。結(jié)果表明，對AOlCGMCCNo.1653所生產(chǎn)的納他霉素純化樣品進行分析的譜圖中，正離子檢測方式，檢測到分子離子峰[M+Na]+為m/z:688.2938的化合物(圖9A-b);負離子檢測方式檢測到分子離子峰[M-Hr為m/^664.2976的化合物(圖9A-a)。對A02CGMCCNo.1654所生產(chǎn)的納他霉素純化樣品進行分析的圖譜中，采用正離子檢測方式檢測到加合離子[M+Na]+為m/z688.2937(圖9B-b);采用負離子檢測方式檢測到準分子離子[M-H]+為m/z664.2975的化合物(圖9B-a);采用正、負離子檢測方式對A02拮抗產(chǎn)物純品進行檢測分析，確定664.2975為分子離子峰。綜上所述，分析確定2個菌株所產(chǎn)生的活性物質(zhì)的主要活性組分的分子式均為C33H47N013，分子量為665;由公式不飽和度(n)=1+Nc+(Nn-Nh)/2(Nc:碳原子數(shù)；Nn:氮原子數(shù)；Nh:氫原子數(shù))計算其分子式的不飽和度為11，表明其分子結(jié)構(gòu)中含有多個不飽和鍵與環(huán)等。4、核磁共振譜(NMR)以氘代-二甲基甲酰胺(d-DMF)為溶劑，以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標，室溫下測定。采用BrukerAVANCEDRX-500核磁共振譜儀(德國Bruker光譜儀器公司)，以氘代-二甲基甲酰胺(d-DMF)為溶劑，四甲基硅垸(TMS)為內(nèi)標，進行氫譜CHNMR)和碳譜(13CNMR)的測定；前者共振頻率為500.1325156MHz，采樣次數(shù)32768次；后者共振頻率125.7577612MHZ，采樣次數(shù)為65536次。實驗結(jié)果表明，在A01CGMCCNo.1653所產(chǎn)生的活性產(chǎn)物純樣品的'H-NMR圖譜(圖10A)中，由于采用DMF做溶劑，使得羧基上的氫被中和，5=12的峰消失，同時增加了5=3和8的兩處溶劑峰，5=6附近的一組峰代表了共軛多烯上的氫，5=5左右的一組峰則代表羥基；"C-麗R圖譜(圖10B)中，強度最大的峰系由溶劑DMF產(chǎn)生，S=180和165的峰表明分子中羧基和酯基的存在，S=130左右的一組峰則由共軛多烯產(chǎn)生；當6=135'時，DEPT譜圖中CH和CH3峰的譜線朝上，C仏峰的譜線朝下，分子中共有5個-CH2。從A02CGMCCNo.l654所產(chǎn)生的活性產(chǎn)物純樣品的核磁共振"C圖譜(圖11B)中可以看出，分子中有一個羧基碳原子的化學位移(S165.217);—個羰基碳原子的化學位移(S178.603);—組共軛四烯碳原子的化學位移(S125.089145.447);—組與羥基相連的碳原子的化學位移(566.10270.326);糖環(huán)上五個碳原子共振峰(S71.19497.894);甲基碳原子共振峰(S18.062，S20.360)。500兆赫的核磁共振^圖譜(圖11A)中可以看出，多烯環(huán)上和四個雙鍵相連的質(zhì)子氫(-CH-CH-)的化學位移(S5.6866.625ppm);五個羥基中的質(zhì)子氫的化學位移值(S4.1874.741ppm);五個亞甲基和兩個甲基中的質(zhì)子氫的化學位移(S1.2742.439ppm)。綜合分析上述實驗數(shù)據(jù)，判定這兩個菌株所產(chǎn)生的活性產(chǎn)物的主要活性組分為納他霉素，其化學結(jié)構(gòu)式為序列表<160〉1<210>1<211>1270〈212〉DNA〈213〉利迪鏈霉菌(5Yr一o季esJWc〃s)〈400〉1gggtctaataCCgg3t3Cg3cacggggtcgcatgacctccgtgtggaaagctccggcggt60gg3tgsgcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgatggcctaccaaggcgacga120cgggtagccggcctggggcgaccggcc3cactggga_ctgcacggcccagactcc180tacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcg3gcctgatgcagcgscgccg240cgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcggtga300cggtacctgcagaaggcgccggctaactacgtgccagc3gCCgCggt3atacgtaggg360cgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcacgtcgga420tgtagcccggggcttsaccccgggtctgcattcgatacgggcaggctagagttcggt■aggggtcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccgg540tggcgaaggcggatctctgggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcg600C3ggsttag3taccctggtagtccacgccgtacgttgggaactaggtgtgggcgacat660tccacgtcgtccgtgccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgca720aggctactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggcttaM780tcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcccggaaaaccctggag3ca_g840ggtcccccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgaga■tgttgggttaagtcccgcaaCgElgCgCCccttgttctgtgttgccagcatgcccttcg960gggtgatggggactcacaggctgccggggtcaactcggaggggtggggacgacgt1020caagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggccggtacaatga1080gctgcgataccgcgtggagcgaatctcaaaaagccggtctcagttcggattggggtc1140tgcaactcgacccc￡itga_a_gtcggagttgctagtaatcgctgctgcggtg1200aatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacg犯agtcggtascacccga1260agccggtggc1270權(quán)利要求1、一種制備納他霉素的方法，是發(fā)酵利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)得到納他霉素。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述利迪鏈霉菌(&re/^o/^ces^ro7cM)為利迪鏈霉菌(5Yr印fcMyces77力'cws)A01CGMCCNo.1653或利迪鏈霉菌(Stre/^0/z77ces2yo^.cws)A02CGMCCNo.1654。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于發(fā)酵所述利迪鏈霉菌(5Yre/^o/Byces7yWcM)A01CGMCCNo.1653的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為每升培養(yǎng)基中含有黃豆粉2%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉0.5%，葡萄糖2%,玉米漿O.25%，(NH4)2S040.25%，MgS04.7H200.025%，K2HP040.002%，NaCl0.4%，CaC030.2%，其余為水；所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。4、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于發(fā)酵所述利迪鏈霉菌(5Yrepz^z^cesJj^/cws)A01CGMCCNo.1653的條件為在28。C的條件下，以13mm的旋轉(zhuǎn)半徑、180rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于發(fā)酵所述利迪鏈霉菌(5Yrepz^7yces7yo7cws)A02CGMCCNo.1654的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為每升培養(yǎng)基中含有由15g黃豆粒得到的提取液，5g蛋白胨，10g蔗糖，10g淀粉，2.5g硫酸銨，0.25g硫酸鎂，0.2g磷酸二氫鉀，5g氯化鈉，lg碳酸鈣，其余為水；所述利迪鏈霉菌(6Yre/7力朋7cesA02CGMCCNo.1654的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7-8。6、根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的方法，其特征在于發(fā)酵所述利迪鏈霉菌(5^印t卿yces^o7c〃s)A02CGMCCNo.1654的條件為在31。C的條件下，以13鵬的旋轉(zhuǎn)半徑、240rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)。7、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法中還包括分離純化納他霉素的步驟。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述分離純化步驟包括1)收集發(fā)酵所述利迪鏈霉菌(5Yrep^/^ces7/A'cM)得到的發(fā)酵液，用無水乙醇進行沉淀，收集上清液；2)將所述上清液依次進行樹脂吸附層析、硅膠吸附層析和高效液相色譜分離，得到納他霉素。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述利迪鏈霉菌(5Yrep"/^ces7y力'c〃s)為利迪f連霉菌(5Yrepz^/^ces7y&'c〃s)A01CGMCCNo.1653;所述樹脂吸附層析采用D4006大孔樹脂，洗脫條件是依次用1倍柱體積的去離子水、1.5倍柱體積的50%甲醇和2.5倍柱體積的80%乙醇洗脫，收集流出量為3.5倍柱體積至4.5倍柱體積之間的洗脫液；所述百分含量為體積百分含量；所述硅膠吸附層析采用200300目硅膠，洗脫條件是用體積比為l:2:l的正丁醇、甲醇和水的混合液進行洗脫，收集流出量為0.33倍至0.6倍柱體積之間的洗脫液；所述高效液相色譜分離采用循環(huán)制備型高效液相色譜儀及JAIGEL-ODS-AP型SP-120-15制備柱，以體積比為7:3的甲醇和水的混合液為流動相，分離二次，收集第二次分離時保留時間為38.399min的洗脫峰。10、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述利迪鏈霉菌(&r印^/^c"7y力'c〃s)為利迪鏈霉菌(6Yr印foyz^ces7y力'c〃s)A02CGMCCNo.1654;所述樹脂吸附層析采用X-5大孔樹脂，洗脫條件是依次用2倍柱體積的去離子水、2倍柱體積的30%甲醇和2倍柱體積的70%乙醇洗脫，收集流出量為4.8倍至5.6倍柱體積之間的洗脫液；所述百分含量為體積百分含量；所述硅膠吸附層析采用100200目硅膠，洗脫條件是用體積比為8:1:1的乙醇、氨水和水的混合液進行洗脫，收集流出量為0.23倍至1.2倍柱體積之間的洗脫液；所述高效液相色譜分離采用循環(huán)制備型高效液相色譜儀及JAIGEL-ODS-AP型SP-120-15制備柱，以體積比為7:3的甲醇和水的混合液為流動相，分離三次，收集第三次分離時保留時間為39.766min的洗脫峰。全文摘要本發(fā)明涉及一種制備納他霉素的方法。本發(fā)明所提供的制備納他霉素的方法是發(fā)酵利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)得到納他霉素。本發(fā)明生產(chǎn)納他霉素的方法，開創(chuàng)性地用利迪鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素，從而為生產(chǎn)納他霉素提供了新的途徑。本發(fā)明方法生產(chǎn)的納他霉素的純度高。本發(fā)明將在高純度納他霉素的生產(chǎn)中得到廣泛應用。文檔編號C12P19/08GK101397579SQ20071018743公開日2009年4月1日申請日期2007年11月23日優(yōu)先權(quán)日2007年9月29日發(fā)明者霆劉,劉偉成,劉建華,劉德文,盧彩鴿,裘季燕,勤隋申請人:北京市農(nóng)林科學院