專利名稱：一種從有效霉素制備有效霉醇胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種有效霉醇胺的制備方法，特別是涉及一種從有效霉素制備有效霉醇胺方法。
背景技術(shù)：
有效霉醇胺是醫(yī)藥中間體，是治療糖尿病的新藥伏格列波糖的中間體。新藥伏格列波糖，對(duì)小腸上絨毛膜刷狀緣上的雙糖水解酶有非常強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)α-淀粉酶幾乎無抑制作用這一特點(diǎn)有別于另一個(gè)糖苷酶抑制劑類的降糖藥阿卡波糖。對(duì)于麥芽糖酶和蔗糖酶，伏格列波糖的抑制作用分別約為阿卡波糖的20倍和30倍；另一方面，對(duì)于胰α-淀粉酶的抑制作用，伏格列波糖約為阿卡波糖的1/3000。同時(shí)腸道的副作用也相應(yīng)減輕，所以現(xiàn)有的糖苷酶抑制劑藥物中，伏格列波糖的生產(chǎn)應(yīng)用前景最廣。迄今為止，未見利用微生物法生產(chǎn)有效霉醇胺的研究報(bào)告和專利申請(qǐng)，采用化學(xué)法生產(chǎn)有效霉醇胺雖有報(bào)道，如日本武田制藥株式會(huì)社已有少量生產(chǎn)，但工藝復(fù)雜，生產(chǎn)過程中設(shè)備腐蝕和環(huán)境污染也較為嚴(yán)重，工人防護(hù)和生產(chǎn)安全有一定難度，且產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。國(guó)內(nèi)尚無有效霉醇胺產(chǎn)品的登記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種以有效霉素為原料經(jīng)過酶催化發(fā)酵、氧化、還原和純化得到有效霉醇胺的方法。有效霉素即井岡霉素。該制備方法工藝設(shè)計(jì)合理，過程操作簡(jiǎn)單，較好地解決了環(huán)保和安全問題，且產(chǎn)品純度高，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。
本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種從有效霉素制備有效霉醇胺的方法，其特征在于它由下列步驟組成(a)酶催化發(fā)酵以有效霉素為原料，用細(xì)小芽孢桿菌進(jìn)行催化發(fā)酵；(b)一次分離濃縮采用弱酸性樹脂從步驟(a)所得發(fā)酵液中分離得到含有效霉素烯胺、有效霉素霉胺和氧基胺的混合液，并通過膜濃縮得到含有效霉素烯胺的濃縮液；(c)氧化先用保護(hù)劑對(duì)在步驟(b)所得含有效霉素烯胺的濃縮液中的氨基進(jìn)行保護(hù)；再用氧化劑進(jìn)行氧化，得到氧化產(chǎn)物；
(d)分離對(duì)步驟(c)所得氧化產(chǎn)物進(jìn)行物理分離，去除雜質(zhì)；(e)還原先用還原劑對(duì)經(jīng)步驟(d)分離的氧化產(chǎn)物進(jìn)行還原，得到還原產(chǎn)物；再用脫保護(hù)劑對(duì)還原產(chǎn)物進(jìn)行脫保護(hù)，以脫除反應(yīng)產(chǎn)物中氨基上的保護(hù)物，得到含有效霉醇胺的混合液；(f)二次分離濃縮步驟(e)所得含有效霉醇胺的混合液經(jīng)膜分離濃縮，去除脫保護(hù)物，得到有效霉醇胺濃縮液；(g)結(jié)晶干燥用溶劑對(duì)步驟(f)所得有效霉醇胺濃縮液進(jìn)行稀釋后冷卻、結(jié)晶；晶漿經(jīng)過濾得到有效霉醇胺結(jié)晶品；然后在真空和加熱條件下進(jìn)行干燥。
步驟(a)中所述有效霉素原料為有效霉素濾液、40％A有效霉素粉劑或60％A有效霉素粉劑；當(dāng)以有效霉素濾液為原料時(shí)，投料過程中需調(diào)節(jié)至pH5～6，當(dāng)以40％A有效霉素粉劑為原料時(shí)，投入量為計(jì)料體積的5％，當(dāng)以60％A有效霉素粉劑為原料時(shí)，投入量為計(jì)料體積的3％。
在步驟(b)中，分離時(shí)所采用的弱酸性樹脂為D155、D152或H110樹脂，濃縮時(shí)所采用的膜的截留分子量為2000。
在步驟(d)中所述的物理分離采用D155、D152或H110樹脂。
在步驟(f)中，分離濃縮時(shí)所采用的膜的截留分子量為1000。
在步驟(g)中，結(jié)晶時(shí)冷卻到5℃，時(shí)間5小時(shí)；干燥時(shí)所采用的真空度為0.085Mpa，加熱溫度為50℃，時(shí)間4小時(shí)。
步驟(c)中所采用的保護(hù)劑為N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，加入的量為含有效霉素烯胺的濃縮液的1.0％～1.2％(W/V)，所采用的氧化劑為溴素，加入的量為含有效霉素烯胺的濃縮液的0.4％～0.5％(W/V)；在步驟(e)中所采用的還原劑為亞硫酸鈉，加入的量為含有效霉素烯胺的濃縮液的0.4％～0.5％(W/V)，所采用的脫保護(hù)劑為氫氧化鋇，加入的量為含有效霉素烯胺的濃縮液的0.4％～0.5％(W/V)；在步驟(g)中，對(duì)有效霉醇胺濃縮液進(jìn)行稀釋所采用的溶劑為乙醇，加入的量與有效霉醇胺濃縮液等量(V/V)。
過程中各相關(guān)物質(zhì)的優(yōu)選用量為所述保護(hù)劑N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯的加入量為含有效霉素烯胺的濃縮液的1.04％(W/V)，所述氧化劑溴素的加入量為含有效霉素烯胺的濃縮液的0.44％(W/V)，所述還原劑亞硫酸鈉的加入量為含有效霉素烯胺的濃縮液的0.44％(W/V)，所述脫保護(hù)劑氫氧化鋇的加入量為含有效霉素烯胺的濃縮液的0.44％(W/V)。
本發(fā)明工藝合理、操作簡(jiǎn)便，采用的溶劑單一，生產(chǎn)過程基本無“三廢”排放，環(huán)保條件好。通過對(duì)有效霉素(井岡霉素)濾液或高純度粉劑(40％A、60％A)酶催化發(fā)酵，得到含有效霉素烯胺的發(fā)酵混合液，通過一系列的中間反應(yīng)過程，得到純度較高、質(zhì)量穩(wěn)定的有效霉醇胺產(chǎn)品，具體技術(shù)指標(biāo)有效霉醇胺含量≥98.5％，干燥失重≤0.3％，溶液色澤(1∶100水溶液)為澄清、無色。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1在250L種子罐中投入米粉、黃豆粉、磷酸二氫鉀，加熱至121℃滅菌40分鐘，接入酶(細(xì)小芽孢桿菌)種子液，于40℃通氣培養(yǎng)36小時(shí)；在2.3M3發(fā)酵罐中發(fā)酵，計(jì)料體積1.2M3，投入有效霉素濾液1.2M3，調(diào)節(jié)pH5.5，加入磷酸二氫鉀、氯化鉀等無機(jī)鹽，于121℃滅菌40分鐘，冷卻；將在種子罐培養(yǎng)結(jié)束的種子液移入發(fā)酵罐中，于28℃培養(yǎng)4天放罐；再將放罐的發(fā)酵液通過加溫、冷卻處理，過濾去除顆粒狀雜質(zhì)。
所得濾液用300L D152弱酸性樹脂吸附，流量300L/h，吸附結(jié)束用純水洗滌；然后用NaOH溶液洗脫，洗脫量為樹脂體積的1.5倍，洗脫液通過截留分子量為2000的膜濃縮，得到濃縮液25L，有效霉素烯胺含量1.2％。
上述濃縮液加入保護(hù)劑N，N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯0.25kg，在常溫常壓下反應(yīng)6小時(shí)，取樣檢測(cè)，保護(hù)物比例占90％以上，結(jié)束反應(yīng)；把所得保護(hù)產(chǎn)物投入200L反應(yīng)釜中，加入氧化劑溴素0.1kg，在0℃左右反應(yīng)4小時(shí)，取樣檢測(cè)，保護(hù)物濃度≤5％，反應(yīng)結(jié)束。
將所得氧化產(chǎn)物用H110樹脂分離，去除雜質(zhì)。
所得濃縮液用0.1kg還原劑亞硫酸鈉進(jìn)行還原，常溫下反應(yīng)2小時(shí)，用酸調(diào)節(jié)至pH5.0；在還原產(chǎn)物中加入0.1kg的脫保護(hù)劑氫氧化鋇，在60℃反應(yīng)6小時(shí)，得到含有效霉醇胺的混合物。
將有效霉醇胺的混合物通過截留分子量為1000的膜濃縮，去除無機(jī)鹽，濃縮到1L體積。
將有效霉醇胺濃縮液冷卻到5℃結(jié)晶，時(shí)間5小時(shí)，所得晶漿經(jīng)過濾得到有效霉醇胺結(jié)晶粉；在0.085Mpa真空和50℃條件下，干燥4小時(shí)，得到有效霉醇胺312g，檢測(cè)得含量98.5％，水分0.2％，符合其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例2在250L種子罐中投入米粉、黃豆粉、磷酸二氫鉀，加熱至121℃滅菌40分鐘，接入酶(細(xì)小芽孢桿菌)種子液，于40℃通氣培養(yǎng)36小時(shí)；在2.3M3發(fā)酵罐中發(fā)酵，計(jì)料體積1.2M3，投入40％A高純度有效霉素粉劑60kg，磷酸二氫鉀、氯化鉀等無機(jī)鹽，于121℃滅菌40分鐘，冷卻；將在種子罐培養(yǎng)結(jié)束的種子液移入發(fā)酵罐中，于28℃培養(yǎng)4天放罐；再將放罐的發(fā)酵液通過加溫、冷卻處理，過濾去除顆粒狀雜質(zhì)。
所得濾液用300L D152弱酸性樹脂吸附，流量300L/h，吸附結(jié)束用純水洗滌；然后用NaOH溶液洗脫，洗脫量為樹脂體積的1.5倍，洗脫液通過截留分子量為2000的膜濃縮，得到濃縮液25L，有效霉素烯胺含量1.21％。
上述濃縮液加入保護(hù)劑N，N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯0.26kg，在常溫常壓下反應(yīng)6小時(shí)，取樣檢測(cè)，保護(hù)物比例占90％以上，結(jié)束反應(yīng)；把所得保護(hù)產(chǎn)物投入200L反應(yīng)釜中，加入氧化劑溴素0.11kg，在0℃左右反應(yīng)4小時(shí)，取樣檢測(cè)，保護(hù)物濃度≤5％，反應(yīng)結(jié)束。
將所得氧化產(chǎn)物用H110樹脂分離，去除雜質(zhì)。
所得濃縮液用0.11kg還原劑亞硫酸鈉進(jìn)行還原，常溫下反應(yīng)2小時(shí)，用酸調(diào)節(jié)至pH5.0；在還原產(chǎn)物中加入0.11kg的脫保護(hù)劑氫氧化鋇，在60℃反應(yīng)6小時(shí)，得到含有效霉醇胺的混合物。
將有效霉醇胺的混合物通過截留分子量為1000的膜濃縮，去除無機(jī)鹽，濃縮到1L體積。
將有效霉醇胺濃縮液冷卻到5℃結(jié)晶，時(shí)間5小時(shí)，所得晶漿經(jīng)過濾得到有效霉醇胺結(jié)晶粉；在0.085Mpa真空和50℃條件下，干燥4小時(shí)，得到有效霉醇胺325g，檢測(cè)得含量98.6％，水分0.2％，符合其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例3在250L種子罐中投入米粉、黃豆粉、磷酸二氫鉀，加熱至121℃滅菌40分鐘，接入酶(細(xì)小芽孢桿菌)種子液，于40℃通氣培養(yǎng)36小時(shí)；在2.3M3發(fā)酵罐中發(fā)酵，計(jì)料體積1.2M3，投入60％A高純度有效霉素粉劑36kg，磷酸二氫鉀、氯化鉀等無機(jī)鹽，于121℃滅菌40分鐘，冷卻；將在種子罐培養(yǎng)結(jié)束的種子液移入發(fā)酵罐中，于28℃培養(yǎng)4天放罐；再將放罐的發(fā)酵液通過加溫、冷卻處理，過濾去除顆粒狀雜質(zhì)。
所得濾液用300L D152弱酸性樹脂吸附，流量300L/h，吸附結(jié)束用純水洗滌；然后用NaOH溶液洗脫，洗脫量為樹脂體積的1.5倍，洗脫液通過截留分子量為2000的膜濃縮，得到濃縮液25L，有效霉素烯胺含量1.21％。
上述濃縮液加入保護(hù)劑N，N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯0.3kg，在常溫常壓下反應(yīng)6小時(shí)，取樣檢測(cè)，保護(hù)物比例占90％以上，結(jié)束反應(yīng)；把所得保護(hù)產(chǎn)物投入200L反應(yīng)釜中，加入氧化劑溴素0.12kg，在0℃左右反應(yīng)4小時(shí)，取樣檢測(cè)，保護(hù)物濃度≤5％，反應(yīng)結(jié)束。
將所得氧化產(chǎn)物用H110樹脂分離，去除雜質(zhì)。
所得濃縮液用0.12kg還原劑亞硫酸鈉進(jìn)行還原，常溫下反應(yīng)2小時(shí)，用酸調(diào)節(jié)至pH5.0；在還原產(chǎn)物中加入0.12kg的脫保護(hù)劑氫氧化鋇，在60℃反應(yīng)6小時(shí)，得到含有效霉醇胺的混合物。
將有效霉醇胺的混合物通過截留分子量為1000的膜濃縮，去除無機(jī)鹽，濃縮到1L體積。
將有效霉醇胺濃縮液冷卻到5℃結(jié)晶，時(shí)間5小時(shí)，所得晶漿經(jīng)過濾得到有效霉醇胺結(jié)晶粉；在0.085Mpa真空和50℃條件下，干燥4小時(shí)，得到有效霉醇胺315g，檢測(cè)得含量98.5％，水分0.2％，符合其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種從有效霉素制備有效霉醇胺的方法，其特征在于它由下列步驟組成(a)酶催化發(fā)酵以有效霉素為原料，用細(xì)小芽孢桿菌進(jìn)行催化發(fā)酵；(b)一次分離濃縮采用弱酸性樹脂從步驟(a)所得發(fā)酵液中分離得到含有效霉素烯胺、有效霉素霉胺和氧基胺的混合液，并通過膜濃縮得到含有效霉素烯胺的濃縮液；(c)氧化先用保護(hù)劑對(duì)在步驟(b)所得含有效霉素烯胺的濃縮液中的氨基進(jìn)行保護(hù)；再用氧化劑進(jìn)行氧化，得到氧化產(chǎn)物；(d)分離對(duì)步驟(c)所得氧化產(chǎn)物進(jìn)行物理分離，去除雜質(zhì)；(e)還原先用還原劑對(duì)經(jīng)步驟(d)分離的氧化產(chǎn)物進(jìn)行還原，得到還原產(chǎn)物；再用脫保護(hù)劑對(duì)還原產(chǎn)物進(jìn)行脫保護(hù)，以脫除反應(yīng)產(chǎn)物中氨基上的保護(hù)物，得到含有效霉醇胺的混合液；(f)二次分離濃縮步驟(e)所得含有效霉醇胺的混合液經(jīng)膜分離濃縮，去除脫保護(hù)物，得到有效霉醇胺濃縮液；(g)結(jié)晶干燥用溶劑對(duì)步驟(f)所得有效霉醇胺濃縮液進(jìn)行稀釋后冷卻、結(jié)晶；晶漿經(jīng)過濾得到有效霉醇胺結(jié)晶品；然后在真空和加熱條件下進(jìn)行干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從有效霉素制備有效霉醇胺的方法，其特征在于步驟(a)中所述有效霉素原料為有效霉素濾液、40％A有效霉素粉劑或60％A有效霉素粉劑；當(dāng)以有效霉素濾液為原料時(shí)，投料過程中需調(diào)節(jié)pH5～6，當(dāng)以40％A有效霉素粉劑為原料時(shí)，投入量為計(jì)料體積的5％(W/V)，當(dāng)以60％A有效霉素粉劑為原料時(shí)，投入量為計(jì)料體積的3％(W/V)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從有效霉素制備有效霉醇胺的方法，其特征在于在步驟(b)中，分離時(shí)所采用的弱酸性樹脂為D155、D152或H110樹脂，濃縮時(shí)所采用的膜的截留分子量為2000。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從有效霉素制備有效霉醇胺的方法，其特征在于在步驟(d)中所述的物理分離采用D155、D152或H110樹脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從有效霉素制備有效霉醇胺的方法，其特征在于在步驟(f)中，分離濃縮時(shí)所采用的膜的截留分子量為1000。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從有效霉素制備有效霉醇胺的方法，其特征在于在步驟(g)中，結(jié)晶時(shí)冷卻到5℃，時(shí)間5小時(shí)；干燥時(shí)所采用的真空度為0.085Mpa，加熱溫度為50℃，時(shí)間4小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5或6所述的一種從有效霉素制備有效霉醇胺的方法，其特征在于步驟(c)中所采用的保護(hù)劑為N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，加入的量為含有效霉素烯胺的濃縮液的1.0％～1.2％(W/V)，所采用的氧化劑為溴素，加入的量為含有效霉素烯胺的濃縮液的0.4％～0.5％(W/V)；在步驟(e)中所采用的還原劑為亞硫酸鈉，加入的量為含有效霉素烯胺的濃縮液的0.4％～0.5％(W/V)，所采用的脫保護(hù)劑為氫氧化鋇，加入的量為含有效霉素烯胺的濃縮液的0.4％～0.5％(W/V)；在步驟(g)中，對(duì)有效霉醇胺濃縮液進(jìn)行稀釋所采用的溶劑為乙醇，加入的量與有效霉醇胺濃縮液等量(V/V)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種從有效霉素制備有效霉醇胺的方法，其特征在于所述保護(hù)劑N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯的加入量為含有效霉素烯胺的濃縮液的1.04％(W/V)，所述氧化劑溴素的加入量為含有效霉素烯胺的濃縮液的0.44％(W/V)，所述還原劑亞硫酸鈉的加入量為含有效霉素烯胺的濃縮液的0.44％(W/V)，所述脫保護(hù)劑氫氧化鋇的加入量為含有效霉素烯胺的濃縮液的0.44％(W/V)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從有效霉素(井岡霉素)制備有效霉醇胺方法?；瘜W(xué)法生產(chǎn)有效霉醇胺工藝復(fù)雜，設(shè)備腐蝕和環(huán)境污染也較嚴(yán)重，工人防護(hù)和生產(chǎn)安全有一定難度，且產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。本發(fā)明提出一種以有效霉素為原料經(jīng)過酶催化發(fā)酵、氧化、還原和純化得到有效霉醇胺的方法，所用有效霉素原料為有效霉素濾液、40％A有效霉素粉劑或60％A有效霉素粉劑；酶催化發(fā)酵采用的生物酶為細(xì)小芽孢桿菌。本發(fā)明工藝合理、操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)過程基本無“三廢”排放，環(huán)保條件好，且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，有效霉醇胺含量≥98.5％。
文檔編號(hào)C12R1/07GK101029318SQ200710067849
公開日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者裘國(guó)寅, 姚萍華, 王雪鋼 申請(qǐng)人:浙江錢江生物化學(xué)股份有限公司