專利名稱：米多霉素衍生物的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及米多霉素衍生物的制備方法，該衍生物作為殺菌劑的有效成分用于防治植物白粉病。
背景技術：
白粉病是由粉狀霉菌引起的一種世界性的植物主要病害，在世界各地區(qū)均有發(fā)生，尤其以溫暖潮濕的海洋性氣候環(huán)境的種植區(qū)發(fā)生較重。目前有效防治白粉病的化學殺菌劑的有效成份多屬于三唑酮類。但是由于多年連續(xù)使用，這類農藥的藥效已逐漸降低，白粉菌的耐藥性也逐漸增強。
米多霉素(mildiomycin，MIL)(又稱氨苷霉素)是1978年日本的Takashi Iwasa等人[Harada S.，Kishi T.，J.Antibiotics，31，519-524，1978.]從一株龜裂鏈輪絲菌(Streptoverticillium rimofaciens B-98891)的次級代謝產物中分離得到的一種新型核苷類抗生素，屬于抗真菌類抗生素，可安全高效的控制和根治植物白粉病的發(fā)生。
Takashi Suzuki等人在美國專利US4296107中揭示了在發(fā)酵前或發(fā)酵過程中添加胞嘧啶、胞苷或胞嘧啶核苷酸結構類似物就有可能得到米多霉素類衍生物，在該專利中代表十分廣的一類衍生物，也包括本發(fā)明的部分化合物。但是該專利涉及的培養(yǎng)基價格昂貴，分離過程中使用的樹脂Amberlite IRC-50和AmberliteCG-50皆為進口樹脂，價格昂貴，工業(yè)化生產成本較高，而且其中的活性炭吸附洗脫這步過程起到了脫色脫鹽的作用，但活性炭柱操作壓力高，難以再生，環(huán)境污染較大，而且活性炭柱收率較低。
浙江大學的陳勇等人對發(fā)酵液中米多霉素的分離純化條件進行優(yōu)化，經過粗制和精制過程，最終可以得到純度大于95％的米多霉素粉末，且材料全部實現了國產化。但是由于米多霉素和衍生物結構過于接近，該工藝并未能將他們徹底分離，得到的粉末是米多霉素和衍生物的混合物。
本發(fā)明是在米多霉素的研究基礎上開展的，克服了上述所述的制備和純化過程中的缺陷，研究發(fā)現在用龜裂鏈輪絲菌Zju5119(Streptoverticillium rimofaciensZju5119)發(fā)酵生產米多霉素的過程中添加含胞嘧啶結構類似物能夠制備出具有比米多霉素更高生物活性的衍生物，并通過下游的分離純化工作得到純度大于95％的純品。解決了米多霉素合成成本高的缺陷，而且能夠得到純凈單一的的米多霉素衍生物。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供具有下面結構式(I)的米多霉素衍生物的制備方法， 其中R可以是H、鹵素原子、低鏈烷基或羥甲基，或它們的鹽。其中優(yōu)選R為H、F或CH2OH，當R是CH2OH時，化合物的名稱即為米多霉素(簡稱MIL)；當R是F時，化合物命名為米多霉素5-F衍生物(簡稱為FIL)；當R是H時，化合物命名為米多霉素5-H衍生物(簡稱為HIL)；上述結構式(I)的米多霉素衍生物的制備方法是在龜裂鏈輪絲菌Zju5119(Streptoverticillium rimofaciens Zju5119)的培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)基中添加具有如下 結構(II)的胞嘧啶結構類似物其中R’是H、鹵素原子、低級烷基或羥甲基，或它們的鹽。其中優(yōu)選R’為H、F或CH2OH，當R’為H時結構式(II)的化合物就是胞嘧啶，當R’為F時結構式(II)的化合物就是5-氟胞嘧啶。
本發(fā)明中所用的龜裂鏈輪絲菌Zju5119是將土壤中篩選到的原始菌種龜裂鏈輪絲菌再經過誘變篩選后獲得的一株高產菌株，在中國專利局指定的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.1503。
經過龜裂鏈輪絲菌Zju5119在搖瓶中8～10的發(fā)酵，可得到含有結構式(I)的米多霉素衍生物的發(fā)酵液，將此發(fā)酵液經過離子交換層析柱和C18層析柱分離純化最終得到結構式(I)的米多霉素衍生物純品。
根據本發(fā)明上述結構式(I)的化合物的制備方法，將龜裂鏈輪絲菌Zju5119在28℃恒溫培養(yǎng)8-10天，這樣即可得到含有結構式(I)的化合物的發(fā)酵液。根據本發(fā)明上述的結構式(I)的化合物的制備方法，在發(fā)酵72小時內在搖瓶培養(yǎng)基或發(fā)酵罐培養(yǎng)基中添加0.1～2％的胞嘧啶，這樣培養(yǎng)后即可從發(fā)酵液中得到HIL。而在發(fā)酵36～72小時期間，在搖瓶培養(yǎng)基或發(fā)酵罐培養(yǎng)基中添加0.1～2％的5-氟胞嘧啶，培養(yǎng)后即可從發(fā)酵液中得到FIL。
根據本發(fā)明上述的結構式(I)的化合物的制備方法，將含有結構式(I)的化合物的發(fā)酵液用離子交換層析柱進行分離純化，得到含有結構式(I)的化合物的混合物粗品，將此粗品再經過C18層析柱進行精制，最終得到純度大于95％的衍生物。
根據上述的制備方法，其中在得到混合物粗品后，將混合物粗品溶于適量0.01M的三氯乙酸緩沖液中，并將其以0.5～1樹脂體積/小時流速通過C18層析柱吸附，用0.01M的三氯乙酸緩沖液以0.5～3樹脂體積/小時流速洗脫，分別收集結構式(I)的化合物的純度大于95％的粉末。
根據本發(fā)明上述的結構式(I)的化合物的制備方法，其中使用的培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機鹽、Fe2+、Mg2+等營養(yǎng)。碳源可以是豆油、木糖、糊精、甘油、米粉、山梨糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖或玉米淀粉，其中玉米淀粉作為碳源時米多霉素的產量最高，其次是葡萄糖和可溶性淀粉。氮源可以是有機氮源蛋白胨、酵母膏、玉米漿，花生餅粉、黃豆餅粉、棉子粉、胰蛋白胨、乳酪蛋白、干酪素、酵母粉、豆粕粉、牛肉浸膏或尿素；也可以是無機氮源如NH4NO3或(NH4)2SO4，上述氮源可以單獨使用，也可以混和使用，其中有機氮源和無機氮源混合使用時米多霉素的產量較高。而乳酪蛋白和干酪素最為有機氮源時米多霉素的產量最高，其次是魚粉和豆餅粉，考慮到乳酪蛋白和干酪素價格昂貴，本發(fā)明中以工業(yè)常用的豆餅粉和NH4NO3作為混合氮源。
根據本發(fā)明上述的結構式(I)的化合物的制備方法，在培養(yǎng)龜裂鏈輪絲菌Zju5119的過程中依次用到的培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、搖瓶培養(yǎng)基、發(fā)酵罐培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)的組成如下斜面培養(yǎng)基(g/L)可溶性淀粉15.0～25.0，蛋白胨3.0～7.0，KNO30.5～1.5，NaCl0.2～0.7，K2HPO4·3H2O 0.2～0.7，MgSO4·7H2O 0.2～0.7，FeSO4·7H2O0.005～0.02，瓊脂粉15.0～25.0，調pH6.5～7.5；種子培養(yǎng)基的組成(g/L)為葡萄糖15.0～25.0，黃豆餅粉20.0～40.0，酵母抽提物0.2～0.7，(NH4)2SO40.5～1.5，MgSO4·7H2O 0.2～0.7，CaCO31.0～5.0；搖瓶培養(yǎng)基的組成(g/L)為葡萄糖60.0～100.0，黃豆餅粉30.0～50.0，KH2PO40.2～0.6，CaCO35.0～15.0，(NH4)2SO42.0～8.0，N，N-二甲基乙酰胺2.0～8.0。
發(fā)酵罐培養(yǎng)基的組成(g/L)為玉米淀粉80.0～120.0(玉米淀粉先加1～3U淀粉酶/g干淀粉于PH6.06，70℃下保溫1hr)，葡萄糖8.0～12.0，黃豆餅粉20～50，硝酸銨2.0～8.0，磷酸二氫鉀0.2～0.6，七水硫酸亞鐵0.01～0.1，碳酸鈣5.0～15.0，消泡劑0.5～2.0，調pH6.5～7.5。


圖1是衍生物HIL的HPLC圖譜；圖2是衍生物FIL的HPLC圖譜；MIL及其衍生物在HPLC下有相對較為固定的保留時間，HIL和FIL在如下色譜條件下可分別得到如圖1和圖2所示的色譜峰，即色譜柱Hypersil BDSC18(大連依利特科學儀器公司)；檢測波長279nm；流動相由10mmol/L的三氯乙酸和8％的甲醇(V/V)組成；流速1.0ml·min-1；進樣量10μl；檢測器靈敏度0.02AuFs；柱溫20℃。
圖3是HIL的質譜圖，通過電噴霧質譜圖確定HIL的分子量為485.3；圖4是FIL的質譜圖，通過電噴霧質譜圖確定FIL的分子量為503.2；圖5是是HIL的核磁共振氫譜；圖6是是FIL的核磁共振氫譜。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明方法解決了米多霉素合成成本高的缺陷，采用本發(fā)明方法能夠制備出具有比米多霉素更高生物活性的衍生物，通過下游的分離純化工作可以得到純度大于95％的純品。
具體實施例方式
實施例1龜裂鏈輪絲菌Zju5119用斜面培養(yǎng)基28℃活化，培養(yǎng)基組成(g/L)可溶性淀粉20.0，蛋白胨5.0，KNO31.0，NaCl0.5，K2HPO4·3H2O0.5，MgSO4·7H2O0.5，FeSO4·7H2O0.01，瓊脂粉20.0，調pH7.0。在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后可見菌落表面產生大量孢子。挖塊接種至種子培養(yǎng)基(100ml/500ml)培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖20.0，黃豆餅粉30.0，酵母抽提物0.5，(NH4)2SO41.0，MgSO4·7H2O0.5，CaCO33.0，消泡劑0.25；在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)40小時后，按10％接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(裝液量100ml/500ml或30ml/250ml)或發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基(裝液量6L/10L)，搖瓶培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖80.0，黃豆餅粉40.0，KH2PO40.4，CaCO310.0，(NH4)2SO45.0，N，N-二甲基乙酰胺4.7，消泡劑0.5；發(fā)酵罐培養(yǎng)基玉米淀粉100(玉米淀粉先加2U淀粉酶/g干淀粉于PH6.06，70℃下保溫1hr)，葡萄糖10，黃豆餅粉40，硝酸銨5，磷酸二氫鉀0.4，七水硫酸亞鐵0.05，碳酸鈣10，消泡劑1，調pH7.0。
在28℃，200rpm下培養(yǎng)。發(fā)酵48hr-60hr時添加0.75g/L的5-氟胞嘧啶作為前體，在28℃繼續(xù)培養(yǎng)5-6天，即可得到含0.7g/L的FIL的發(fā)酵液。
實施例2培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基組成同實例一，只是在發(fā)酵之前在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.75g/L的胞嘧啶作為前體，在28℃培養(yǎng)7-8天，即可得到含0.6g/LHIL的發(fā)酵液。
實施例3向含米多霉素和衍生物的發(fā)酵液中加入草酸，調節(jié)pH值至2～3，靜置，過濾或離心，得到澄清濾液，然后用堿調至pH7.0～7.5，靜置，過濾去沉淀，得到澄清的預處理液。
將預處理的發(fā)酵液，用弱酸性陽離子交換樹脂以0.5～2樹脂體積/小時流速吸附，優(yōu)選0.5樹脂體積/小時流速，用濃度為2～3.5％氨水以0.5～3樹脂體積/小時流速洗脫，優(yōu)選2樹脂體積/小時流速，收集活性組分，得到洗脫液。
洗脫液用酸調至pH7.0-7.5后用陰離子交換樹脂以2～4樹脂體積/小時的流速脫色，優(yōu)選2樹脂體積/小時流速，收集活性組分，得到脫色液，即米多霉素和衍生物的混合物粗品；將上述混合物再用C18填料柱進行分離純化。稱取粗制得到的衍生物的粗粉1～3g，溶于20ml0.01M的三氯乙酸緩沖液后用C18層析柱以0.5～3樹脂體積/小時流速吸附，優(yōu)選1樹脂體積/小時流速吸附后，用0.01M的三氯乙酸緩沖液以0.5～3/樹脂體積/小時流速洗脫，優(yōu)選1.5樹脂體積/小時流速進行洗脫，分別收集純度大于95％的米多霉素和衍生物的粉末。
實施例4發(fā)酵液中衍生物的含量可以用HPLC進行測定，色譜條件如下色譜柱Hypersil BDS C18(250×4.6mm I.D.，5um)(大連依利特科學儀器公司)；檢測波長279nm；流動相由三氯乙酸和甲醇組成；流速1.0ml·min-1；進樣量10μl；檢測器靈敏度0.02AuFs；柱溫20℃。FIL和HIL的HPLC的保留時間在柱溫20℃時分別為14.5min和21.9min。
實施例5
米多霉素衍生物的體外活性試驗根據《中華人民共和國藥典》2000版二部，采用二倍稀釋發(fā)測定了FIL和HIL的MIC。
分別配制0.05％的HIL和FIL水溶液(pH7.0)，進行紫外波長掃描，檢測其最大吸收波長。
米多霉素衍生物的一些理化性質如表1所示表1 HIL和FIL部分理化特性

表2 HIL和FIL的核磁共振氫譜各原子化學位移

實施例6薄層色譜法的操作依照《中華人民共和國藥典》2000版二部。分別選用了硅膠G板和纖維素板作為薄層色譜的支持介質，所采用的展開劑以及FIL和HIL的Rf值如表3所示表3 HIL和FIL的薄層層析Rf值

標注*溶劑1-3分別指以下試劑混合物(v/v/v)溶劑1 甲醇∶三氯乙酸(10mmol/L)∶水(4∶10∶36)溶劑2 正丁醇∶冰乙酸∶水(1∶1∶3)溶劑3 氯仿∶甲醇∶17％氨水(2∶2∶1)，靜置分層取其上清液實施例7FIL和HIL室內盆栽活性測定的試驗對象為黃瓜白粉病。選擇2片真葉期的盆栽黃瓜苗，將不同稀釋倍數的原液稀釋液分別對黃瓜苗進行噴霧處理，自然晾干，在藥劑處理后24h進行接種。接種方法采用孢子懸浮液(濃度控制在1×106個/毫升左右)噴霧接種，噴濕不滴水為宜，自然晾干，然后移至恒溫室(22℃左右)中保濕培養(yǎng)，7-8天后視對照發(fā)病情況調查防效。
室內盆栽試驗結果顯示FIL和HIL的EC90值(mg/L)分別為52.89和54.47，對照品米多霉素的EC90值(mg/L)是153.22。而目前農業(yè)上防治白粉病常用的三唑酮，濃度為100mg/L時的防效僅為68.89％?？梢姷玫降娜N新衍生物的生物活性明顯優(yōu)于米多霉素，也遠遠高于三唑酮。
HIL小區(qū)藥效試驗是在浙江紹興市現代農業(yè)園區(qū)的南瓜田內進行，將0.432g/L的HIL制劑以10倍處理時防效為81.7％，優(yōu)于對照藥劑20％粉銹寧EC1000倍處理的防效(72.9％)，HIL制劑20倍、40倍二個處理的防效(59.4％、43.4％)均低于對照藥劑20％粉銹寧EC1000倍處理的防效。
對南瓜的安全性研究結果表明，經藥后3、5天觀察，未見南瓜有葉色變化、畸形南瓜果產生，可見在本試驗條件下和劑量范圍內HIL制劑對南瓜安全。
實施例8對HIL和FIL分別進行急性毒性試驗和Ames試驗。毒理學試驗結果為微毒，無刺激，陰性。詳細見表4表4米多霉素衍生物的急性毒性試驗

權利要求
1.具有結構式(I)的米多霉素衍生物的制備方法，其特征在于在龜裂鏈輪絲菌Zju5119(Streptoverticillium rimofaciens Zju5119)的培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)基中添加結構式(II)的胞嘧啶結構類似物，經過培養(yǎng)得到含有結構式(I)的米多霉素衍生物的發(fā)酵液，將此發(fā)酵液經過離子交換層析柱和C18層析柱分離純化最終得到結構式(I)的米多霉素衍生物純品，其中結構式(I)中的R是H或F，結構式(II)中的R’是H或F，R和R’相同。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是龜裂鏈輪絲菌Zju5119經過28℃恒溫培養(yǎng)8～10天后得到含有結構式(I)的米多霉素衍生物的發(fā)酵液。
3.根據權利要求1或2所述方法，其特征是在發(fā)酵72小時內在搖瓶培養(yǎng)基或發(fā)酵罐培養(yǎng)基中添加0.1～2％的R’為H的結構式(II)的化合物，培養(yǎng)后得到HIL；或者在發(fā)酵36～72小時中在搖瓶培養(yǎng)基或發(fā)酵罐培養(yǎng)基中添加0.1～2％的R’為F的結構式(II)的化合物，培養(yǎng)后得到FIL。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征是將含有結構式(I)的米多霉素衍生物的發(fā)酵液用離子交換層析柱進行分離純化，得到含有結構式(I)的米多霉素衍生物的混合物粗品，將此粗品再經過C18層析柱進行精制，最終得到純度大于95％的衍生物。
5.根據權利要求4所述方法，其特征是將含有結構式(I)的米多霉素衍生物的混合物粗品溶于適量0.01M的三氯乙酸緩沖液以0.5～1樹脂體積/小時流速通過C18層析柱吸附，用0.01M的三氯乙酸緩沖液以0.5～3樹脂體積/小時流速洗脫，分別收集純度大于95％的米多霉素和衍生物的粉末。
6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于培養(yǎng)過程中依次使用斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、搖瓶培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)基。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于斜面培養(yǎng)基(g/L)組成為可溶性淀粉15.0～25.0，蛋白胨3.0～7.0，KNO30.5～1.5，NaCl 0.2～0.7，K2HPO4·3H2O 0.2～0.7，MgSO4·7H2O 0.2～0.7，FeSO4·7H2O 0.005～0.02，瓊脂粉15.0～25.0，調pH 6.5～7.5。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于種子培養(yǎng)基(g/L)組成為葡萄糖15.0～25.0，黃豆餅粉20.0～40.0，酵母抽提物0.2～0.7，(NH4)2SO40.5～1.5，MgSO4·7H2O 0.2～0.7，CaCO31.0～5.0。
9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于搖瓶培養(yǎng)基(g/L)組成為葡萄糖60.0～100.0，黃豆餅粉30.0～50.0，KH2PO40.2～0.6，CaCO35.0～15.0，(NH4)2SO42.0～8.0，N，N-二甲基乙酰胺2.0～8.0。
10.根據權利要求6所述的方法，其特征在于發(fā)酵罐培養(yǎng)基(g/L)玉米淀粉80.0～120.0，葡萄糖8.0～12.0，黃豆餅粉20～50，硝酸銨2.0～8.0，磷酸二氫鉀0.2～0.6，七水硫酸亞鐵0.01～0.1，碳酸鈣5.0～15.0，消泡劑0.5～2.0，調pH6.5～7.5，其中，玉米淀粉先加1～3U淀粉酶/g干淀粉于PH6.06，70℃下保溫1hr。
全文摘要
本發(fā)明提供了具有結構式(I)的米多霉素衍生物的制備方法，在米多霉素的發(fā)酵過程中添加胞嘧啶和5－氟胞嘧啶作為前體，得到兩種抑菌效果明顯優(yōu)于米多霉素的新的核苷類化合物，通過結構鑒定確定該化合物為米多霉素類衍生物，分別將其命名為米多霉素5－H衍生物(HIL)和米多霉素5－F衍生物(FIL)。
文檔編號C12P19/00GK1837230SQ20061004966
公開日2006年9月27日 申請日期2006年3月2日 優(yōu)先權日2006年3月2日
發(fā)明者徐志南, 葉丹, 梁立峰, 林建平, 岑沛霖 申請人:浙江大學