專利名稱：制備默諾霉素a的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從微生物培養(yǎng)液中分離默諾霉素A的方法。
默諾霉素及其許多衍生物很早以前就已知了(參考DE-A 3704659，EP 0355 679，G.Huber在“Antibiotics”中，F(xiàn).Hahn編，Springer Verlag，柏林1979，IV卷，135頁以后，Welzel等人在四面體中，1983，39卷，9期，1583-1591)。默諾霉素例如默諾霉素A優(yōu)選通過微生物發(fā)酵及隨后純化得到。
為本專利申請的目的，術(shù)語默諾霉素指默諾霉素組分(如微生物產(chǎn)生的)復合物以及單個的組分，默諾霉素A為默諾霉素復合物中具有特殊抗生素活性的組分。
該默諾霉素A具有下面結(jié)構(gòu)式
除默諾霉素A外，主要組分為A11，A12，C1，C2，C3和C4組分。
產(chǎn)生默諾霉素復合物的微生物實施例為班堡鏈霉菌，加納鏈霉菌，埃德鏈爾霉菌和噴泉鏈霉菌。特別優(yōu)選班堡鏈霉菌(關(guān)于這點參見Huber在上述引文中)。
最近已發(fā)現(xiàn)默諾霉素，尤其是默諾霉素A，適于控制幽門螺旋桿菌感染(HOE，93/F 392)。幽門螺旋桿菌感染是人類胃炎和潰瘍的主要原因。
雖然默諾霉素復合物適于作為人用藥，但由于依賴發(fā)酵的微生物原因?qū)е碌慕M分組成變化，劑量成問題。為此，對僅用單一化合物(單組分)作為活性物質(zhì)來說人用藥中活性成份存在著變化。
根據(jù)“抗微生物藥與化療”1965，737，可通過硅膠柱色譜及分離后用丙醇/氨混合物洗脫從默諾霉素復合物中分離四種組分A，B1，B2和C，它們也可在正丙醇/2N NH3(70∶30)體系中色譜展開后在薄層色譜上檢測并通過用氯磺酸/冰醋酸噴霧定位且具有不同RF值的分離斑。默諾霉素組分彼此在化學上非常近似，在溶解性、酸性、顏色反應和紙色譜和紙電泳行為方面默諾霉素復合物未表現(xiàn)出差別。它們彼此區(qū)別在于硅膠色譜行為及組分B1和B2無特征性UV吸收。
最近通過使用逆相(RP)色譜如在LiChroprepRP-18上將組分進行了分離(J.Scherben beck等人，四面體，49卷，15期，3091-3100，1993)。
然后，這些實驗室方法無一適用于工業(yè)分離默諾霉素組分硅膠色譜已過時，因為它難于重復應用載體且價格昂貴，逆相色譜法需要非常高的花費，其它分離方法如離子交換劑的使用至今還是不成功的，因為其不足以將默諾霉素A組分與C組分分離。專利GB 1068639和DE1236726記載了在纖維素基的離子交換劑上純化默諾霉素復合物的方法，然而該純化方法不適于分離各種組分。另外，該方法難用于工業(yè)規(guī)模，主要由于纖維素載體對壓力的感性。德國專利1617 466報導了在強堿性聚苯乙烯基的離子交換劑上分離默諾霉素D、E、F、C和H的方法。然而由于缺乏選擇性，所述方法不適于純化默諾霉素A組分。因而不足以把A組分和C組分分離開。
現(xiàn)在令人驚奇地發(fā)現(xiàn)默諾霉素A可借助于陰離子交換色譜法低成本大規(guī)模地從默諾霉素復合物中分出。
因此本發(fā)明涉及制備默諾霉素A的方法，該方法是通過產(chǎn)生默諾霉素的微生物的發(fā)酵，隨后用色譜法將培養(yǎng)基濾液的其它組分與默諾霉素A分離開，其中陰離子交換劑用作色譜材料。
優(yōu)選的陰離子交換材料為改性的二乙基氨基乙基作功能基的甲基丙烯酸酯共聚物。
特別適合的陰離子交換材料為產(chǎn)品Toyopearl DEAE-650S(TOSOHAAS，Montgomeryville，PA 18936 USA)或Fractogel TSKDEAE-650S(E、Merck，Darmstadt)。
本發(fā)明色譜法可在PH5-9，優(yōu)選PH7-8之間進行。在該PH范圍有效的許多緩沖體系適用于分離，例如磷酸鹽，檸檬酸鹽，tris/HCl緩沖體系或其它緩沖體系等。
采用不斷增加的鹽梯度，優(yōu)選0-4，特別是0-2摩爾濃度梯度從陰離子交換劑中洗脫(脫附)默諾霉素組分。特別適合的鹽為NaCl和KCl。
還可以使用不斷下降的PH梯度，優(yōu)選從PH9到PH3，尤其是從PH8到PH4.5。
可用已知方法從作為緩沖劑的1/15M Na2HPO4(-PH 8)開始，線性變化到1/15 MKH2PO4(-PH 4.9)產(chǎn)生這種類型PH梯度。
適當時，也可用含一定比例有機溶劑的緩沖體系實現(xiàn)陰離子交換劑上的分離?？墒褂玫膶嵗秊橹宕既鐫舛葹?-95％，優(yōu)選15-40％的甲醇、乙醇、丙醇或其它醇。離子交換劑能力隨有機溶劑濃度增大而下降，因此也可用有機溶劑百分比增加的梯度洗脫默諾霉素組分。在默諾霉素組分中，默諾霉素A與本發(fā)明載體結(jié)合最弱，結(jié)果該化合物首先洗脫分離。
根據(jù)本發(fā)明，借助陰離子交換劑預先純化培養(yǎng)基濾液對分離默諾霉素A是有利的。可用中性吸附樹脂進行預純化。合適中性吸附樹脂的實例為Mcl GEL CHP 20P和DIAIONHP 20SS(Mitsubishi化學公司)或AmberliteXAD 16和XAD 1180S(Rohm&Hass)。這使培養(yǎng)基濾液與吸附樹脂接觸，從萃取的培養(yǎng)基濾液中分離負載的樹脂，用有機溶劑在水中的混合物按已知方法洗脫(脫附)抗生素。在中性吸附樹脂上的這種預純化方法從粗默諾霉素中除去鹽和脂類，并濃縮了粗默諾霉素，這樣對離子交換步驟的分離效率是有益的。
另一種預純化的方法在于用非極性溶劑萃取培養(yǎng)基濾液，適當時以濃縮或干燥形式，在這情況下非極性雜質(zhì)溶于非極性溶劑中。適當?shù)姆菢O性溶劑的實例為石油醚，丙酮，甲乙酮等。然后可用極性溶劑如甲醇從余下的培養(yǎng)基濾液中萃取默諾霉素復合物。適當時可通過例如蒸餾、超濾、噴霧干燥或冷凍干燥法濃縮或干燥培養(yǎng)基濾液。
為了更有效地用極性溶劑萃取，可向培養(yǎng)基濾液中加入螯合劑如EDTA，檸檬酸等。螯合劑降低了與默諾霉素形成在極性溶劑中低溶解度的鹽的多電荷離子濃度。
濃縮默諾霉素或默諾霉素A的優(yōu)選方法描述在實施例1和2中。
在改性甲基丙烯酸酯共聚物DEAE載體上預純化和分離組分形成含鹽默諾霉素A溶液，其可被少量其它成分污染，尤其是默諾霉素A12。根據(jù)分離組分柱中洗脫的組成，默諾霉素A的純度為90-大于99％。為了最終純化，降低殘余其它組分濃度并除去鹽，再除去中性吸附樹脂如優(yōu)選的Mcl Gel CHP 20 P，或DIAIONHP 20SS或AmberliteXAD 16或XAD 1180S是有利的。用含水緩沖液/有機溶劑混合物如磷酸鹽緩沖液/異丙醇混合物在這類樹脂上分餾可實現(xiàn)默諾霉素A的基本純化。這樣，僅不完全濃縮的默諾霉素A即可純化到大于99％的純度。足以在PH4和10之間，優(yōu)選PH7和9之間緩沖的許多緩沖物質(zhì)是合適的。
適合的有機溶劑為水混溶的溶劑如低級醇、丙酮、乙腈等。
用所述中性吸附樹脂可從含鹽默諾霉素A溶液中除去鹽。在PH值為7和9之間負載后，通過不斷增加與水混溶有機溶劑中有機溶劑比例的水進行洗脫。收集具有足夠純組分的含默諾霉素A的柱洗脫物，然后超過濾或蒸餾，優(yōu)選真空下濃縮，干燥。按這種方式得到的默諾霉素A純度大于97％。存在的主要雜質(zhì)為默諾霉素組分A12。
如果希望制備較高百分比含量的默諾霉素A，可以重復離子交換色譜的純化步驟和在吸附樹脂上的組分純化步驟。所得默諾霉素純度為＞99％。根據(jù)為分離所選的鹽和緩沖劑，可得到的抗生素鹽為鈉鹽、鉀鹽、銨鹽或為其它鹽。優(yōu)選的反離子(陽離子)可自由選擇，取決于藥物要求。
下面實施例和權(quán)利要求書的內(nèi)容詳細解釋本發(fā)明。
實施例1用固相萃取濃縮培養(yǎng)基濾液中的默諾霉素用基于K.H.Wallhauser等人、抗微生物藥與化學治療，1965，734-736頁中的方法發(fā)酵加納鏈霉菌的變異體(ATCC 146 72)，用Simex壓濾器過濾，用去離子水洗，并通過KS 80多層濾器澄清過濾，得到1100升含默諾霉素的培養(yǎng)基濾液。固體含量-20克/升，有2.8克默諾霉素A。導電率14mS/cm，pH7.5。含3千克固體和420克默諾霉素A的150升裝到容量為58升(寬×高＝33.3厘米×66厘米)且填充MClGel CHP 20P吸附樹脂的柱上。流速2.5升/分鐘。吸附后，用水中含0-40％異丙醇的梯度洗脫劑以10升/分鐘的流速洗脫。合并主要含默諾霉素A的餾分，超過濾濃縮，干燥。得到0.7千克默諾霉素復合物。
實施例2用選擇性溶解來濃縮培養(yǎng)基濾液里的默諾霉素用“UF-36-9工業(yè)控制裝置”(DOS)通過超過濾將實施例1制備的1000升培養(yǎng)基濾液濃縮至140升。所用膜為9m2Nadir PA 20H層。超濾率(流速率)為28升/m2/小時。當保留物容物達到140升時，用總共140升去離子水連續(xù)洗濃縮物。在這期間濃縮積導電率降至1.8mS/cm。在保留物(140升)中默諾霉素復合物的最終濃度為32.9克/升，pH為6.9。噴霧干燥保留物。超過濾液(滲透液)含24mg默諾霉素/升，共24克，相當于實際量的0.52％。終產(chǎn)物(干燥的保留物)為灰棕色粉末，重15千克，含2.8千克默諾霉素A(所用A組分的99％)。
用50升丙酮攪拌3千克噴霧干燥的產(chǎn)物，離心。有機萃取液含1.02千克酯類。用20升甲醇攪拌不溶殘余物3次，每次1小時，然后濾出。默諾霉素A(0.54千克)存在于甲醇相。除去甲醇的該物質(zhì)(1.1千克)1％濃度溶液導電率為1mS/cm。真空濃縮及用水稀釋后，甲醇萃取液可直接用于分離組分。
實施例3用離子交換法分離默諾霉素組分A和C
1千克默諾霉素復合物溶于20升水(pH7.4)中，然后裝到填充20升在pH7.4平衡的FractogelTSK DEAE-60陰離子交換劑的柱上。首先用緩沖液A(20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，2.5mS+20％2-丙醇)洗，然后使用從緩沖液A到緩沖液B(＝緩沖液A中的1M NaCl)的線性梯度洗。在該試驗中流速為7升/分鐘，相當于每小時21個柱容積，餾分體積為20升(-1個柱容積)。通過超過濾和干燥從主要含默諾霉素A的餾分中除去鹽后，分離得到480克組分A，純度為95％。默諾霉素組分的回收率為90％以上。
實施例4在吸附樹脂上除去用陰離子交換劑分離的默諾霉素A的鹽溶于7升緩沖劑水溶液pH7.9，10.5mg/cm的81克95％純度的默諾霉素A，在DEAE純化和超過濾后，裝到容量為2.7升(寬×高＝10厘米×35厘米)且填充MCl-GelCHP 20P的柱上。用水中含0-35％異丙醇的梯度進行洗脫。合并含97％默諾霉素A的餾分，超濾濃縮，冷凍干燥、除24克88％純材料外，得到55克98.5％純度的默諾霉素A。
實施例5在MCl Gel CHP 20P吸附樹脂上再純化默諾霉素A溶于7升pH7.9，導電率10.5mS/cm緩沖水溶液中的81克95％純度默諾霉素A，在DEAE純化和超過濾后，裝到容量為2.7升(寬×高＝10厘米×35厘米)且填充MCl GelCHP 20P的柱上。用緩沖液A(m/15磷酸鹽緩沖液，pH7.8)到緩沖液B(m/15磷酸鹽緩沖液，pH7.8，含33％2-丙醇)的線性梯度進行洗脫。分餾并分析柱流量。收集含至少98.8％純度默諾霉素A的餾分，按實施例4中所述除去鹽后，干燥，得到71克99.3％純度的默諾霉素A，含0.4％污染物默諾霉素A12。
權(quán)利要求
1.一種通過發(fā)酵產(chǎn)生默諾霉素的微生物及隨后用色譜法將培養(yǎng)基濾液的其它組分與默諾霉素A分離來制備默諾霉素A的方法，其中陰離子交換劑用作色譜材料。
2.權(quán)利要求1中所要求的方法，其中陰離子交換材料為改性的二乙基氨基乙基作為功能基的甲基丙烯酸酯共聚物。
3.權(quán)利要求1或2中所要求的方法，其中使用從0到4摩爾不斷增大鹽含量的鹽溶液作為洗脫劑。
4.權(quán)利要求1-3中一個或多個所要求的方法，其中使用PH從9到3的溶劑作為洗脫劑。
5.權(quán)利要求1-4中一個或多個所要求的方法，其中在陰離子交換色譜前，先在中性吸附樹脂上用色譜法純化培養(yǎng)基濾液。
6.權(quán)利要求1-5中一個或多個所要求的方法，其中在陰離子交換色譜前，先通過用非極性溶劑萃取預純化培養(yǎng)基濾液。
7.權(quán)利要求1-6中一個或多個所要求的方法，其中在中性吸附樹脂上至少用另一步色譜法再次純化所得的默諾霉素A。
全文摘要
默諾霉素A可通過發(fā)酵產(chǎn)生默諾霉素的微生物及隨后用色譜法將培養(yǎng)基濾液其它組分與默諾霉素A分離而得到制備,其中使用陰離子交換劑作為色譜材料。
文檔編號C12P19/44GK1196356SQ98106948
公開日1998年10月21日 申請日期1998年4月16日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月17日
發(fā)明者L·沃特希, A·斯塔克, E·艾勒斯 申請人:赫徹斯特股份公司