專利名稱：：臺(tái)勾霉素的制備的制作方法Youe-KongShue，Ming-HsiChiou，Yuan-TingChen，Mei-ChiaoWu，F(xiàn)rankDu，JonathanDuffield，F(xiàn)ranklinOkumu發(fā)明背景臺(tái)勾霉素(tiacumicins)是一族結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物，其包含如下所示的18元大環(huán)內(nèi)酯環(huán)。目前，已經(jīng)鑒別出幾種不同的臺(tái)勾霉素，根據(jù)它們的取代基R1、R2和R3的具體結(jié)構(gòu)定義了這些臺(tái)勾霉素中的6種(臺(tái)勾霉素A-F)(美國(guó)專利第4,918,174號(hào)；J.Antibiotics，1987，575-588)。閏年霉素(lipiarmycins)是一族與臺(tái)勾霉素非常相關(guān)的天然產(chǎn)物。閏年霉素族中的兩個(gè)成員(A3和B3)分別與臺(tái)勾霉素B和C相同(J.Antibiotics，1988，308-315；J.Chem.Soc.PerkinTransI，1987，1353-1359)。已經(jīng)利用多種物理方法來(lái)表征臺(tái)勾霉素和閏年霉素。已報(bào)道的這些化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)都是基于光譜學(xué)的(紫外線可見光譜測(cè)量(UV-vis)，紅外線(IR)以及1H和13C核磁共振(NMR))、質(zhì)譜和元素分析(例如參見J.Antibiotics，1987，575-588；J.Antibiotics，1983，1312-1322)。臺(tái)勾霉素是通過(guò)細(xì)菌制備的，包括桔橙指孢囊菌hamdenensis亞種(dactylosporangiumaurantiacumsubspeciehamdenensis)，該細(xì)菌可從如下機(jī)構(gòu)獲得theARSPatentCollectionoftheNorthernRegionalResearchCenter，UnitedStatesDepartmentofAgriculture，1815NorthUniversityStreet，Peoria，IL61604，保藏號(hào)為NRRL18085。菌株AB718C-41的特征在J.Antibiotics，1987，567-574和美國(guó)專利第4,918,174號(hào)中有所公開。閏年霉素是通過(guò)細(xì)菌制備的，包括德干高原游動(dòng)放線菌(Actinoplanesdeccanensis)(美國(guó)專利第3,978,211號(hào))在內(nèi)。J.Antibiotics，1975，247-25中論述了菌株A/10655型的分類學(xué)研究，該菌株保存于ATCC，保存號(hào)為21983。臺(tái)勾霉素，特別是臺(tái)勾霉素B，表現(xiàn)出抗各種細(xì)菌性病原體，特別是艱難梭菌(Clostridiumdifficile)的活性，一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(Antimicrob.AgentsChemother.1991，1108-1111))。艱難梭菌是一種引起腸道感染的厭氧性的產(chǎn)孢子細(xì)菌。痢疾是最常見的癥狀，但是也可能產(chǎn)生腹痛和發(fā)燒。艱難梭菌是在攝入抗生素之后發(fā)生的大腸炎(結(jié)腸發(fā)炎)和痢疾的主要病原體。這種細(xì)菌主要在醫(yī)院和長(zhǎng)期護(hù)理設(shè)施中獲得。由于臺(tái)勾霉素B表現(xiàn)出有希望對(duì)抗艱難梭菌(C.difficile)的活性，它被期望用于哺乳動(dòng)物的細(xì)菌感染治療，特別是胃腸道的細(xì)菌感染治療。這類治療的例子包括但不限于治療結(jié)腸炎以及治療過(guò)敏性腸道綜合癥。也發(fā)現(xiàn)臺(tái)勾霉素可用于治療胃腸癌。采用發(fā)酵方法以獲得抗生素，包括臺(tái)勾霉素。通過(guò)在深層需氧發(fā)酵(submergedaerobicfermentation)條件下，于含有易于吸收的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，直到過(guò)程中的分析推斷產(chǎn)生了大量的抗生素活性，從而制備得到抗生素。由于全世界對(duì)抗生素的需求增長(zhǎng)，因此正需要制備抗生素的改進(jìn)方法。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1示出了按照實(shí)施例1制備的粗發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC色譜；臺(tái)勾霉素B的保留時(shí)間約為12.6分鐘。圖2示出了按照實(shí)施例2制備的粗發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC色譜；臺(tái)勾霉素B的保留時(shí)間約為11.8分鐘。圖3示出了按照實(shí)施例2的方法發(fā)酵制備的純化臺(tái)勾霉素B(通過(guò)HPLC純化)的HPLC色譜；臺(tái)勾霉素B的保留時(shí)間約為12.0分鐘。圖4示出了由發(fā)酵，采用反相介質(zhì)壓力液相色譜純化，然后按照實(shí)施例3的方法進(jìn)行研磨而制備的臺(tái)勾霉素B的HPLC色譜；臺(tái)勾霉素B的保留時(shí)間約為10.1分鐘。發(fā)明概述本發(fā)明提出了制備臺(tái)勾霉素的方法、工藝和材料。本發(fā)明還提出了采用本發(fā)明的發(fā)酵方法、工藝和材料所制備的臺(tái)勾霉素。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括制備臺(tái)勾霉素的方法，包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(nutrientmedium)中培養(yǎng)微生物，屬于物種桔橙指孢囊菌的hamdenensis亞種(dactylosporangiumaurantiacumsubspeciehamdenensis)，具有能產(chǎn)生臺(tái)勾霉素的能力；以及在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中積累至少一種臺(tái)勾霉素，其中至少一種臺(tái)勾霉素的收率大于約50mg/L培養(yǎng)基(broth)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，描述了用于發(fā)酵制備臺(tái)勾霉素B的改進(jìn)培養(yǎng)基和條件。因此，本發(fā)明的一種實(shí)施方式是用于制備臺(tái)勾霉素的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，包括碳源、氮源、痕量元素如無(wú)機(jī)鹽，以及吸附劑，其中所述的氮源包括魚粉(fishpowder)，所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基用于以大于約50mg/L培養(yǎng)液(broth)的收率制備一種或多種臺(tái)勾霉素。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，描述了一種改進(jìn)的回收方法，即臺(tái)勾霉素B的樹脂吸附法。本發(fā)明的另外一種實(shí)施方式涉及采用與桔橙指孢囊菌hamdenensis亞種有關(guān)的菌株作為制備臺(tái)勾霉素的微生物。因此，本發(fā)明包括臺(tái)勾霉素，其由在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于物種桔橙指孢囊菌hamdenensis亞種微生物，其具有產(chǎn)生臺(tái)勾霉素的能力；以及在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中積累一種或多種臺(tái)勾霉素而制備，該營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括碳源、氮源、痕量元素如無(wú)機(jī)鹽，以及吸附劑，其中所述的氮源包括魚粉，所述的臺(tái)勾霉素的收率大于約50mg/L肉湯(broth)。本發(fā)明的另一種實(shí)施方式涉及采用反相介質(zhì)壓力液相色譜、和/或液/液分配、和/或研磨從粗發(fā)酵產(chǎn)物中純化臺(tái)勾霉素。這些改進(jìn)，或者是單獨(dú)的或者是聯(lián)合的，使得臺(tái)勾霉素B以較大提高的收率(＞50mg/L培養(yǎng)液(broth))進(jìn)行發(fā)酵制備和回收。發(fā)明詳述將本文所引用的所有專利、公開文獻(xiàn)和專利申請(qǐng)全文并入以作參考。除非另外指出，本文中所采用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的意義。下文中描述了示例性的方法和材料。然而，類似于或相當(dāng)于本文公開的方法和材料也可用于獲得本發(fā)明的變體。這些材料、方法和實(shí)施例僅為闡釋性的，而并非限制性的。含有本發(fā)明臺(tái)勾霉素的組合物可用于預(yù)防和/或治療目的的給藥。在治療應(yīng)用中，如上所述，以組合物向已經(jīng)受到感染的病人給藥，組合物的量足以治愈或至少部分抑制感染的癥狀。足以達(dá)到這一效果的量被定義為“治療有效量或劑量(therapeuticallyeffectiveamountordose)”。對(duì)這一用途有效的量將取決于感染的嚴(yán)重程度和進(jìn)程、以前的治療、病人的健康狀態(tài)和對(duì)藥物的反應(yīng)，以及治療醫(yī)師的判斷。在預(yù)防應(yīng)用中，以含有本發(fā)明臺(tái)勾霉素的組合物向易于感染或者存在某一特殊感染危險(xiǎn)的病人給藥。這樣的量被定義為“預(yù)防有效量或劑量(prophylacticallyeffectiveamountordose)”。在這一用途中，精確的量還是取決于病人的健康狀況、體重和類似因素。一旦病人的狀況有所改善，在必要的情況下，以維持劑量(maintenancedose)進(jìn)行給藥。后來(lái)，給藥的劑量劑量或給藥頻率，或兩者，可作為癥狀的函數(shù)，而減少至保持狀況改善的水平。當(dāng)癥狀已經(jīng)被減輕到預(yù)期的水平時(shí)，可以終止治療。然而病人可要求長(zhǎng)期對(duì)疾病癥狀的復(fù)發(fā)進(jìn)行間歇性的治療。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)本發(fā)明臺(tái)勾霉素合適的有效劑量的范圍是對(duì)每位接受者每日為0.1到1000毫克(mg)，優(yōu)選為1到500mg/日。所需的劑量?jī)?yōu)選為在一天中以合適的間隔進(jìn)行1，2，3，4或4次或更多次分劑量給藥。給藥的分劑量可為單位劑型，例如每一單位劑型含有5到1000mg，優(yōu)選10到200mg的活性成分。優(yōu)選地，本發(fā)明化合物的給藥量為約1.0mg/kg到250mg/kg病人體重，每日1到4次?！八幬锝M合物(pharmacologicalcomposition)”是指本文所述的一種或多種臺(tái)勾霉素或其生理學(xué)上可接受的鹽，與諸如生理學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑的其它化學(xué)成分所構(gòu)成的混合物。藥物組合物的目的在于促進(jìn)化合物向生物體給藥。本發(fā)明化合物的“藥學(xué)上可接受的鹽(pharmaceuticallyacceptablesalts)”包括從藥學(xué)上可接受的有機(jī)和無(wú)機(jī)酸和堿衍生得到的鹽。合適的酸的例子有鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、馬來(lái)酸、磷酸、羥基乙酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、間苯-對(duì)-磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、1，2-乙基磺酸(乙磺酸)、半乳糖基-D-葡糖酸，和類似酸。其它酸，例如草酸，盡管它們本身并不是藥學(xué)上可接受的，也可用于制備獲得本發(fā)明化合物和其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽的有用中間體的鹽。從合適的堿衍生的鹽包括堿金屬(如鈉)鹽、堿土金屬(如鎂)鹽、銨鹽和N(C1-C4烷基)4+鹽，和類似物?！吧韺W(xué)上可接受的載體(physiologicallyacceptablecarrier)”是指不對(duì)生物體造成明顯刺激，且并不消除給藥化合物的生物活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。“賦形劑(excipient)”是指加入到藥物組合物中以進(jìn)一步促進(jìn)化合物給藥的惰性物質(zhì)(inertsubstance)。賦形劑的例子包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各種淀粉類型、纖維素衍生物、白明膠、植物油和聚乙二醇。本文中所采用的術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(nutrientmedium)”是指合成的或天然存在的成分的混合物。通常地，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括碳源、氮源、例如無(wú)機(jī)鹽的痕量元素，任選的維生素或其它生長(zhǎng)因子，以及吸附劑。本文中所采用的術(shù)語(yǔ)“肉湯(broth)”是指在發(fā)酵期間或發(fā)酵之后獲得的流體培養(yǎng)液(基)。肉湯包括水、需要的抗生素、存活的或死亡的生物體、代謝產(chǎn)物，以及附有或缺乏吸收產(chǎn)物的吸附劑所構(gòu)成的混合物。本文中所采用的術(shù)語(yǔ)“臺(tái)勾霉素(Tiacumicin)”是指包括如下所示的18-元大環(huán)內(nèi)酯環(huán)(18-memberedmacrolidering)的一族化合物術(shù)語(yǔ)“臺(tái)勾霉素B(TiacumicinB)”是指據(jù)具有下列結(jié)構(gòu)的分子本文中所采用的術(shù)語(yǔ)“收率(yield)”是指在體積與原始發(fā)酵肉湯相同的甲醇中再生的粗臺(tái)勾霉素的量。采用標(biāo)準(zhǔn)的HPLC技術(shù)確定收率。收率以單位mg/L報(bào)導(dǎo)。本發(fā)明的一種實(shí)施方式包括制備抗生素試劑如臺(tái)勾霉素的方法，采用微生物的深層需氧發(fā)酵(submergedaerobicfermentation)。這類生物體的一個(gè)例子是桔橙指孢囊菌的hamdenens亞種(Dactylosporangiumaurantiacumsubspecieshamdenens)。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式，臺(tái)勾霉素，例如臺(tái)勾霉素B，是通過(guò)樹脂吸附從發(fā)酵肉湯中以異常好的收率(＞100mg/L培養(yǎng)液)回收，和采用各種極性的溶劑洗滌而從樹脂和菌絲體中洗脫出的?？刹捎萌軇┹腿。?或色譜分離如塞法戴克斯(Sephadex)、硅凝膠、高效液相色譜法(HPLC)或反相介質(zhì)壓力液相色譜法(reversephasemediumpressureliquidchromatography)，和/或采用一種或多種溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，和/或采用一種或多種溶劑進(jìn)行研磨而進(jìn)行純化。鑒定出本發(fā)明所采用的一種微生物屬于游動(dòng)放線菌科(Actinoplanaceae)，指孢囊菌屬(Dactylosporangium)(JournalofAntibiotics，1987，p.567-574和美國(guó)專利4,918,174)。已經(jīng)命名為桔橙指孢囊菌(Dactylasporangiumaurantiacum)的亞種hamdenensis718C-41。傳代培養(yǎng)物從美國(guó)農(nóng)業(yè)部的北方區(qū)域研究中心的ASR專利菌種保藏中心(ARSPatentCollectionoftheNorthernRegionalResearchCenter，UnitedStatesDepartmentofAgriculture).1815NorthUniversityStreet，Peoria，IL61604，U.S.A.獲得，在該保藏處的保藏號(hào)為NRRL18085。菌株AB718C-41的特征在JournalofAntibiotics，1987，p.567-574和US專利4,918,174中有所描述。能產(chǎn)生臺(tái)勾霉素的其它微生物包括突變種，它與現(xiàn)有技術(shù)中已知的品種相比具有有利的性質(zhì)。這類菌株可由母體菌株通過(guò)誘發(fā)突變而生成。誘發(fā)突變的策略和方法，篩選和分離發(fā)生突變的菌株的方法，用于產(chǎn)生本發(fā)明突變菌株的培養(yǎng)基組合物都是本領(lǐng)域中已知的。被命名為菌株的微生物可以體現(xiàn)出如下優(yōu)點(diǎn)，例如所需大環(huán)內(nèi)酯的產(chǎn)量增加，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的利用更有效，或?qū)τ醒跎L(zhǎng)所需的氧的需求下降。在優(yōu)選實(shí)施方式中，為制備臺(tái)勾霉素而進(jìn)行的桔橙指孢囊菌亞種hamdenensisAB718C-41NRRL18085的培養(yǎng)，是在培養(yǎng)基中進(jìn)行，該培養(yǎng)基包括在合適的有氧條件下的易于同化的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和其它有機(jī)成分以及一種或多種吸附劑，是在無(wú)菌環(huán)境中混合的。用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗生素的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基組合物將在實(shí)施例中詳述。能支持微生物生長(zhǎng)的碳源(carbonsources)包括但不限于葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、淀粉、糖蜜、麥芽提取物、糊精、乳清、甘油、脂類、玉米面和類似物，以及它們的混合物。根據(jù)本發(fā)明的一種方式，所存在的碳源的量以重量計(jì)為0.2-10％。本發(fā)明的一種方式中，碳源的量如表2所示。能支持微生物生長(zhǎng)的氮源(nitrogensources)包括但不限于牛肉提取物、大豆餅、棉籽仁、全部酵母、酵母提取物、大豆粉、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、魚粉、玉米漿、銨鹽、酪蛋白、氨基酸和類似物，及其組合物(combinations)。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括作為氮源的魚粉(999Primequalityfishmeal(999上等質(zhì)量的魚粉)，TripelNineFishProtein，a.m.b.a.Fiskerihavnsgade35,6700Esbjerg，Demark)。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式，氮源的存在量以重量計(jì)為0.1-5.0％。生物體的生長(zhǎng)和成長(zhǎng)必須的基本痕量元素(essentialtraceelements)可存在為培養(yǎng)基中其它成分的雜質(zhì)，其量足以滿足生物體的生物合成需要。然而，在培養(yǎng)介質(zhì)中加入有助于微生物生長(zhǎng)的其它可溶性營(yíng)養(yǎng)無(wú)機(jī)鹽可能是有益的。能支持微生物生長(zhǎng)的無(wú)機(jī)鹽包括但不限于K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、CaCO3等?；竞哿吭氐拇嬖诹糠秶灾亓坑?jì)為0.02-2.0％。根據(jù)本發(fā)明一種實(shí)施方式的各個(gè)基本元素的用量列于表2中。商業(yè)途徑可以得到的吸附劑樹脂被發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵中能提高臺(tái)勾霉素的產(chǎn)率和回收效率。這樣的吸附劑包括但不限于AmberliteXAD16，XAD16HP，XAD2，XAD7HP，XAD1180，XAD1600和IRC5(所有是Rohm&HaasCo.，USA的產(chǎn)品)，DuoliteXAD761(Rohm&HaasCo.，USA)和類似物。以重量計(jì)，吸附劑的優(yōu)選存在量在0.5-15％的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的吸附劑的量在表2中給出。正如在需氧深層培養(yǎng)工藝中通常采用的一樣，無(wú)菌的空氣分散于整個(gè)培養(yǎng)介質(zhì)中。氧濃度保持高于3％(InPro6000seriesO2sensors(InPro6000系列O2傳感器)，MettlerToledo)。在這樣的條件下，細(xì)胞的生長(zhǎng)保持在防止生長(zhǎng)條件變?yōu)閰捬醯乃较?。在一些?shí)施方式中，限制成分從碳源、氮源或細(xì)胞所要求的其它成分進(jìn)行選擇(如在流加培養(yǎng)(feedmedium)中)。細(xì)菌在合適的生長(zhǎng)條件下進(jìn)行生長(zhǎng)。這類合適的生長(zhǎng)條件的特征是以保持所述細(xì)菌生長(zhǎng)的有氧條件這一方式，是通過(guò)限制生長(zhǎng)培養(yǎng)基成分的可利用度和/或流加培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)。這類條件的特征還在于，例如保持溶解的氧的濃度為約2％到30％。溶解的氧的濃度水平可依據(jù)用于生長(zhǎng)細(xì)菌和測(cè)定溶解的氧濃度的特殊設(shè)備而有所不同。采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，可在范圍為從搖瓶到大型“分批”發(fā)酵罐的容器中，使產(chǎn)生臺(tái)勾霉素的細(xì)菌生長(zhǎng)。為制備大量的臺(tái)勾霉素，采用在罐中進(jìn)行深層需氧發(fā)酵。然而，可通過(guò)搖瓶培養(yǎng)而獲得少量臺(tái)勾霉素。在罐發(fā)酵中，優(yōu)選采用營(yíng)養(yǎng)體接種物(vegetativeinoculum)。通過(guò)將少量體積的培養(yǎng)基用孢子形式，菌絲體片段，或生物體的凍干沉淀物接種，得到生物體的新鮮的、積極生長(zhǎng)的培養(yǎng)物，制備出營(yíng)養(yǎng)體接種物。然后將營(yíng)養(yǎng)體接種物轉(zhuǎn)移到更大的罐中，經(jīng)過(guò)合適的孵育時(shí)間之后，在該較大的罐中產(chǎn)生了收率有所提高的臺(tái)勾霉素抗生素。如果生成的泡沫成為問(wèn)題的話，可能會(huì)有必要向大規(guī)模的發(fā)酵介質(zhì)中加入少量的消泡劑。在帶有其它添加劑/成分的對(duì)照介質(zhì)中進(jìn)行制備，以提高產(chǎn)量。采用液面下的、攪拌培養(yǎng)方法以產(chǎn)生臺(tái)勾霉素。發(fā)酵在25到37℃的溫度范圍下進(jìn)行。仔細(xì)監(jiān)測(cè)碳源的消耗，按照需要加入額外量的碳源。發(fā)酵的pH值優(yōu)選保持在約6.0到約8.0之間。產(chǎn)生了臺(tái)勾霉素B，且臺(tái)勾霉素在發(fā)酵接種之后的3到15天之間積累起來(lái)。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照培養(yǎng)基由下列量的下列成分構(gòu)成魚粉0.1％到5％葡萄糖0.2％到10％K2HPO40.02到0.5％MgSO4.7H2O0.02％到0.5％KCl0.01％到0.3％CaCO30.1％到2％其它的添加劑/成分由下列物質(zhì)組成酪蛋白氨基酸0.05％到2％，酵母提取物0.05％到2％XAD-16樹脂0.5％到15％發(fā)酵完全后，通過(guò)篩分從肉湯中分離出固體物質(zhì)(包括吸附劑樹脂)。用有機(jī)溶劑，如乙酸乙酯、甲醇、乙腈或兩種或兩種以上有機(jī)溶劑的混合物，從樹脂中洗脫出臺(tái)勾霉素。然后在減壓條件下濃縮提取物。采用低極性的溶劑，如己烷、庚烷、甲基環(huán)己烷進(jìn)行研磨；或在諸如乙酸乙酯/水、乙酸乙酯/氯化鈉水溶液、甲醇/己烷、乙腈/己烷、或兩種或兩種以上不同比例的溶劑、或其組合的兩相溶劑系統(tǒng)之間進(jìn)行分配；或采用以合適有機(jī)溶劑體系進(jìn)行洗脫的塞法戴克斯柱色譜法進(jìn)一步純化殘留物。如果需要，臺(tái)勾霉素可通過(guò)結(jié)晶、和/或色譜分離、和/或高效液相色譜法(HPLC)、和/或液/液分配、和/或研磨進(jìn)一步純化。實(shí)施例從以上公開內(nèi)容所能理解的是，本發(fā)明具有多種應(yīng)用。因此，以下所提供的實(shí)施例意在闡釋而并非是限制。實(shí)施例1將桔橙指孢囊菌亞種hamdenensisAB718C-41NRRL18085(-20℃存放)保持于1mL第104號(hào)培養(yǎng)基中(表1)。將裝有第104號(hào)培養(yǎng)基(50mL)的種子瓶(250mL)，經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的滅菌條件(30分鐘，121℃，1.05kg/cm2)之后，用AB718C-41NRRL18085進(jìn)行接種，在30℃下在搖床(設(shè)置在250rpm(轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘))上放置72hr(小時(shí))。然后，在無(wú)菌條件下，將5％營(yíng)養(yǎng)體接種物從第一傳代的種子瓶中轉(zhuǎn)移到裝有表1所列的相同成分的發(fā)酵瓶中。表1第104號(hào)培養(yǎng)基的成分在旋轉(zhuǎn)的搖床上，將發(fā)酵瓶于30℃下孵育3到12天。過(guò)濾整個(gè)培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基的樣品。用MeOH洗滌濾餅，在減壓下除去溶劑。殘留物在與原始的發(fā)酵肉湯體積相同的甲醇中再生。采用帶有Waters24872-通道UV/Vis監(jiān)測(cè)器的WatersBREEZEHPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析。在50×4.6μmI.D.，5μmYMCODS-A柱(YMC編號(hào)CCAAS05-0546WT)上分析臺(tái)勾霉素，該柱采用溶于含有0.1％磷酸的水中的45％乙腈為流動(dòng)相，流速為1.5mL/分鐘。在266nm下檢測(cè)臺(tái)勾霉素。粗產(chǎn)物的HPLC色譜圖見圖1所示(臺(tái)勾霉素B的保留時(shí)間為12.6分鐘)。在這一實(shí)施例中，7天后臺(tái)勾霉素B的粗收率為約250mg/mL。采用HPLC純化之后，臺(tái)勾霉素B的收率為約100mg/mL。實(shí)施例2在裝有第104號(hào)培養(yǎng)基(50mL)的種子瓶(250mL)經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的滅菌條件(30分鐘，121℃，1.05kg/cm2)之后，用AB718C-41NRRL18085進(jìn)行接種，在30℃下在搖床(設(shè)置為250rpm)上培養(yǎng)72hr。然后，在無(wú)菌條件下，將5％營(yíng)養(yǎng)體接種物從第一傳代的種子瓶中轉(zhuǎn)移到裝有表1所列的同樣成分的發(fā)酵瓶中，并在旋轉(zhuǎn)的搖床上于30℃下培養(yǎng)72hr。然后，采用第二傳代的種子瓶中的5％接種物，對(duì)裝有第104號(hào)培養(yǎng)基(2.5L)的5L發(fā)酵罐進(jìn)行AB718C-41NRRL18085接種。加入消泡劑(SigmaA-6426)控制過(guò)量的泡沫形成。該產(chǎn)品是一種存在于多元醇分散系中的非硅酮類有機(jī)消泡劑的混合物。監(jiān)測(cè)作為生長(zhǎng)參數(shù)的葡萄糖消耗量。通過(guò)加入流加培養(yǎng)基而控制葡萄糖的水平。實(shí)施例2的流加培養(yǎng)基和條件如下流加培養(yǎng)基(feedingmedium)發(fā)酵罐培養(yǎng)基第104號(hào)發(fā)酵罐體積4L滅菌40分鐘，121℃，1.05kg/cm2培養(yǎng)溫度30℃通氣比率0.5-1.5體積的空氣/培養(yǎng)物體積和分鐘發(fā)酵罐攪拌速率300-500rpm發(fā)酵進(jìn)行8天，通過(guò)篩分從培養(yǎng)肉湯中分離出XAD-16樹脂。用水洗滌之后，用甲醇(XAD-16的5-10倍體積)洗脫XAD-16樹脂。蒸發(fā)除去甲醇，用乙酸乙酯萃取油狀殘留物三次。合并提取物，在減壓下進(jìn)行濃縮，得到油狀殘留物。油狀殘留物干燥后用己烷進(jìn)行洗滌，得到粗產(chǎn)物，為淺棕色的粉末，該產(chǎn)物的HPLC色譜圖如圖2所示(臺(tái)勾霉素B的保留時(shí)間為11.8分鐘)。采用硅膠柱(以乙酸乙酯和己烷作為洗脫液)純化粗產(chǎn)物，得到臺(tái)勾霉素B，其為白色固體。用HPLC色譜法測(cè)定的純度＞95％，色譜圖如圖3所示(臺(tái)勾霉素B的保留時(shí)間為12.0分鐘)。分析分離出的臺(tái)勾霉素B，得到1H和13CNMR數(shù)據(jù)與J.Antibiotics，1987，575-588中所報(bào)道的相同，將這些數(shù)據(jù)總結(jié)如下。臺(tái)勾霉素Bmp129-140℃(由RP-HPLC得到的白色粉末)；mp166-169℃(由異丙醇中得到的白色針狀物)；[α]D20-6.9(c2.0，MeOH)；MSm/z(ESI)1079.7(M+Na)+；1HNMR(400MHz，CD3OD)δ7.21(d，1H)，6.59(dd，1H)，5.95(ddd，1H)，5.83(brs，1H)，5.57(t，1H)，5.13(brd，1H)，5.09(t，1H)，5.02(d，1H)，4.71(m，1H)，4.71(brs，1H)，4.64(brs，1H)，4.61(d，1H)，4.42(d，1H)，4.23(m，1H)，4.02(pentet，1H)，3.92(dd，1H)，3.73(m，2H)，3.70(d，1H)，3.56(s，3H)，3.52-3.56(m，2H)，2.92(m，2H)，2.64-2.76(m，3H)，2.59(heptet，1H)，2.49(ddd，1H)，2.42(ddd，1H)，2.01(dq，1H)，1.81(s，3H)，1.76(s，3H)，1.65(s，3H)，1.35(d，3H)，1.29(m，1H)，1.20(T，3H)，1.19(d，3H)，1.17(d，3H)，1.16(d，3H)，1.14(s，3H)，1.12(s，3H)，0.87(t，3H)；13CNMR(100MHz，CD3OD)δ178.4，169.7，169.1，154.6，153.9，146.2，143.7，141.9，137.1，137.0，136.4，134.6，128.5，126.9，125.6，124.6，114.8，112.8，108.8，102.3，97.2，94.3，82.5，78.6，76.9，75.9，74.5，73.5，73.2，72.8，71.6，70.5，68.3，63.9，62.2，42.5，37.3，35.4，28.7，28.3，26.9，26.4，20.3，19.6，19.2，18.7，18.2，17.6，15.5，14.6，14.0，11.4。實(shí)施例3按照實(shí)施例2所述的方法，通過(guò)發(fā)酵得到臺(tái)勾霉素B(15g)，從樹脂釋放出來(lái)后為油狀的殘留物。在35℃下將油狀殘留物溶解于乙酸乙酯(300mL)，使溶液在分液漏斗中與水(300mL)一起搖動(dòng)，并靜置1分鐘。加入氯化鈉飽和水溶液(100mL)后，混合物再靜置1分鐘。丟棄下面的相和界面處的任何固體，在35℃的減壓條件下濃縮上面的相，得到棕色固體。使得到的泡沫狀物質(zhì)經(jīng)過(guò)反相介質(zhì)壓力液相色譜，采用與LscoUA-vis檢測(cè)器連接的Biotage75L裝置，具有下列參數(shù)柱1.2kg，BiotageKP-C18-HS二氧化硅平衡體系50∶50∶1，MeCN/H2O/AcOH(6L)裝載方式在甲醇(20mL)中，通過(guò)含有25gBiotageKP-C18-HS二氧化硅的樣品注射模塊洗脫液50∶50∶1，MeCN/H2O/AcOH流速230mL/min壓力溶劑-90psi徑向(radial)-100psi檢測(cè)器波長(zhǎng)-254nm路徑長(zhǎng)度-0.1cm靈敏度-2制圖速度-60cm/hr噪音過(guò)濾-5sec級(jí)分收集人工-在主峰和前面的峰之間的拐折處之后立即開始收集，在組分高度的20％處終止收集。柱的調(diào)節(jié)100％MeCN(4L)向收集的級(jí)分中加入氯化鈉的飽和水溶液(為級(jí)分體積的25％)。搖動(dòng)混合物，使其分離為兩相。除去上面的相并在30℃的減壓條件下濃縮至干燥。將得到的固體溶解于乙酸乙酯(75mL)中，并用水(2×75mL)洗滌，除去氯化鈉。在30℃的減壓條件下濃縮有機(jī)相，得到黃色泡沫狀物質(zhì)(回收4.56g，30％；純度～93％)。與其它幾批的物質(zhì)合并(總共156.0g，純度90.8％)，并向其中加入異丙醇(1000mL)?；旌衔锝?jīng)聲波處理，同時(shí)在室溫下攪拌20分鐘以獲得米色的懸浮液。此時(shí)進(jìn)行過(guò)濾，用異丙醇(300mL)洗滌濾餅。在高度的真空下干燥固體，得到米色的粉末(回收146.2g，94％；純度91.1％)(圖4)。Mp156-160℃；[α]D20-8.4(c2.0，MeOH)；MS7m/z(ESI)1079.7(M+Na)+；C52H74C12O18的計(jì)算值C，59.03；H，7.05；Cl，6.70。實(shí)測(cè)值C，58.75；H，7.04；Cl，6.91。本文中闡釋性描述的發(fā)明可在缺乏本文中未特別公開的任一要素或任何一些要素，任一限定或任意一些限定的情況下實(shí)施。因此，例如術(shù)語(yǔ)“包括(comprising)”，“包含(including)”，“含有(containing)”等應(yīng)該理解為可擴(kuò)展式，而并非限制性的。此外，本文中采用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)已經(jīng)被用作說(shuō)明性術(shù)語(yǔ)而不具有限制意義，而且并無(wú)意使用將未來(lái)示出和描述的等價(jià)物或其一部分排除在外的那些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到多種修飾是在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。因此，應(yīng)該理解盡管本發(fā)明已經(jīng)以優(yōu)選的實(shí)施方式和可選擇的特征進(jìn)行了詳述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可對(duì)本文中公開的發(fā)明進(jìn)行修飾和變化，這類修飾和變化被認(rèn)為是落入本文中所公開的發(fā)明的范圍之內(nèi)。本文中已經(jīng)對(duì)發(fā)明進(jìn)行了廣泛性和一般性的描述。落入該種類型公開內(nèi)容的范圍之中的較窄情形和次級(jí)類別分組也構(gòu)成這些發(fā)明的一部分。這包括采用條件限定或否定性限制從該類別中去除任何主題而對(duì)每個(gè)發(fā)明進(jìn)行一般性描述，而不管被除去的物質(zhì)是否特別地存在于其中。此外，在本發(fā)明的特征或方面以馬庫(kù)什組的方式描述時(shí)，受到本領(lǐng)域教育的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明也以該馬庫(kù)什組成員中的任何單獨(dú)成員或亞組成員的方式進(jìn)行了描述。應(yīng)該理解，以上的說(shuō)明書意在闡釋性而并非是約束性的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀以上的說(shuō)明書之后，許多實(shí)施方式將是明顯的。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)該不是參照以上的說(shuō)明書而確定，但卻是應(yīng)該參照所附的權(quán)利要求書以及這些權(quán)利要求應(yīng)該賦予的等價(jià)物的全部范圍而確定。將所有文章和參考文獻(xiàn)，包括專利公開文獻(xiàn)的內(nèi)容并入本文中作為參考。權(quán)利要求1.一種制備臺(tái)勾霉素的方法，該方法包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠產(chǎn)生臺(tái)勾霉素的微生物，和，在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中積累至少一種臺(tái)勾霉素，其中至少一種臺(tái)勾霉素的收率大于約50mg/L全部發(fā)酵肉湯。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的收率大于約100mg/L肉湯。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的收率大于約200mg/L肉湯。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的收率為從約50mg/L肉湯到約500mg/L肉湯。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的收率為約100mg/L肉湯到約500mg/L肉湯。6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的微生物是桔橙指孢囊菌NRRL18085(DactylasporangiumaurantiacumNRRL18085)。7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的臺(tái)勾霉素是臺(tái)勾霉素B。8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中從所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中分離出所述的臺(tái)勾霉素是采用選自下列的技術(shù)用至少一種溶劑或溶劑混合物進(jìn)行洗提，通過(guò)篩分和除去不需要的物質(zhì)；用至少一種溶劑或溶劑混合物進(jìn)行萃?。唤Y(jié)晶；色譜分離；高效液相色譜(HPLC)；中壓液相色譜(MPLC)；研磨；以及用飽和鹽水和至少一種溶劑或溶劑混合物進(jìn)行萃取。9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的微生物在約25℃到約35℃的溫度，和在約6.0到約8.0的pH值下進(jìn)行培養(yǎng)。10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括一種或多種碳源，選自葡萄糖、蔗糖、淀粉、糖蜜、糊精、乳清、甘油、脂類和玉米面。11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，按照需要，在所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中加入額外的碳源。12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括能支持微生物生長(zhǎng)的一種或多種氮源/有機(jī)源，所述的氮源/有機(jī)源選自牛肉提取物、豆餅、全酵母、酵母提取物、豆粉、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、魚粉、玉米漿、銨鹽、酪蛋白和氨基酸。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括魚粉。14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括能支持微生物生長(zhǎng)的一種或多種無(wú)機(jī)鹽，所述的無(wú)機(jī)鹽選自K2HPO4、MgSO4·7H2O和CaCO3。15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括至少一種能在所述的培養(yǎng)期間吸附一種或多種臺(tái)勾霉素的吸附劑，所述的吸附劑選自AmberliteXAD16、XAD16HP、XAD2、XAD7HP、XAD1180、XAD1600、IRC50，DuoliteXAD761和反相硅凝膠。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述的反相硅凝膠選自KP-C18、KP-C18-WP和KP-C18HS。17.一種用于由微生物制備臺(tái)勾霉素的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括碳源、氮源、痕量元素和吸附劑，其中所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基用于以大于約50mg/mL的收率產(chǎn)生一種或多種臺(tái)勾霉素。18.根據(jù)權(quán)利要求17的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其中所述的臺(tái)勾霉素的收率大于約100mg/mL肉湯。19.根據(jù)權(quán)利要求18的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其中所述的臺(tái)勾霉素的收率大于約200mg/mL肉湯。20.根據(jù)權(quán)利要求17的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其中所述的臺(tái)勾霉素的收率為約50mg/L肉湯到約500mg/L肉湯。21.根據(jù)權(quán)利要求20的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其中所述的臺(tái)勾霉素的收率為約100mg/L肉湯到約500mg/L肉湯。22.根據(jù)權(quán)利要求17的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其中所述的氮源是魚粉。23.根據(jù)權(quán)利要求17的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其中所述的微生物是桔橙指孢囊菌NRRL18085。24.根據(jù)權(quán)利要求17的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其中所述的臺(tái)勾霉素是臺(tái)勾霉素B。25.根據(jù)權(quán)利要求17的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其中所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括至少一種能在所述的培養(yǎng)期間吸收一種或多種臺(tái)勾霉素的吸附劑。26.臺(tái)勾霉素，由在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于物種桔橙指孢囊菌的亞種hamdenensis的微生物，其能夠產(chǎn)生臺(tái)勾霉素；以及在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中積累一種或多種臺(tái)勾霉素而制備，所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括碳源、氮源、痕量元素如無(wú)機(jī)鹽，以及吸附劑，其中所述氮源包括魚粉，所述臺(tái)勾霉素的收率大于約50mg/L肉湯。全文摘要用于制備和回收臺(tái)勾霉素的方法、工藝和材料，其中臺(tái)勾霉素是通過(guò)在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于物種桔橙指孢囊菌的hamdenensis亞種微生物而產(chǎn)生，所述微生物具有產(chǎn)生和積累一種或多種臺(tái)勾霉素的能力，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括碳源、氮源、諸如無(wú)機(jī)鹽之類的痕量元素、和吸附劑，其中所述氮源包括魚粉，且其中所述臺(tái)勾霉素的收率大于約50mg/L培養(yǎng)基。文檔編號(hào)C12N1/20GK1688707SQ03818016公開日2005年10月26日申請(qǐng)日期2003年7月15日優(yōu)先權(quán)日2002年7月29日發(fā)明者Y-K·舒埃,C-J·F·杜,M-H·邱,M-C·吳,Y-T·陳,F·W·奧庫(kù)穆,J·J·達(dá)菲爾德申請(qǐng)人:浩鼎生技公司