專利名稱：試樣調(diào)制法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于基因分析技術(shù)的試樣調(diào)制法。更詳細地講，涉及用于1個細胞中包含的mRNA的數(shù)據(jù)分析或同時逐個分析多個標的分子 的方法的試樣調(diào)制法。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組序列譯解的完成，來到了深入地研究種種基因組 的信息并活用它們的時代?；蚪M信息被mRNA復(fù)制，翻譯成蛋白質(zhì)。 這樣進行的基因的表達輪廓分析，對詳細研究生命活動是不可缺少的。 到現(xiàn)在為止，成為主流的分析方法是從多個細胞取出mRNA,進行了熒 光標識之后讓DNA探針陣列(DNA芯片)起作用，在具有與mRNA互補序 列的捕獲在探針標識mRM的檢測方法。與此相對，也有從多個細胞取 出mRNA，制造該cDM,并對其進行電泳分離而測量的方法。這個方法 是模擬地測量種種的mRNA的量的方法，不過，從測量靈敏度問題考慮， 必須4吏用多個細胞取出mRNA進行測量。另外，生命活動被認為以多個細胞協(xié)調(diào)構(gòu)成一個系統(tǒng)而成立，組 織中的各個細胞有各自不同的作用。要理解真正的生命，監(jiān)視這樣的 各個細胞的作用是重要的，開始重視1個細胞中包含的mRNA或蛋白質(zhì) 的測量。而且把1個細胞中微量包含的mRNA的種類和量進行正確定量 分析是必要的。但這樣的方法尚沒有。發(fā)明者們?yōu)榱丝朔@個問題，把通過把1個細胞中包含的全部的 mRM或認為必需測量的多種類的mRNA進行數(shù)字計數(shù)進行定量分析作 為目標。所謂數(shù)字計數(shù)，是確定各自的mRM(或cDNA片斷)的序列而 確定種類，統(tǒng)計具有該序列的mRNA包含幾個的定量分析的方法。即，通過對在細胞這樣的小區(qū)域中包含的多個mRM或各DNA片斷進行序列分析進行數(shù)字計數(shù)，不過，為此必須能個別地擴增各個的mRNA(或cDNA片斷)進行序列分析。在這里重要的是無遺漏地獨立擴增 全部的mRNA(或c腿片斷)。上述的方法，并列 一分子的DNA或mRNA作為原材料進行多個PCR 擴增，不過，試樣以溶液狀在其中包含從數(shù)十到百萬級的mRNA或cDNA 片斷。當(dāng)把這些一起進行PCR擴增，在得到多個擴增產(chǎn)物的混合物情 況下，不能得到目的測量試樣。需要使各個mRNA獨立，沒有遺漏地擴 增，并將它們分別取出。為了獨立擴增各個的mRNA，以各自被分離了 的狀態(tài)個別進行PCR反應(yīng)，不過，為此每一反應(yīng)體積的反應(yīng)開始時的 DNA或RNA分子數(shù)的期望值到成為1以下，必須在進行了稀釋劃分試 樣溶液之后，對各個的區(qū)劃獨立進行PCR擴增反應(yīng)。譬如，估計某試 樣中的擴增對象分子數(shù)為10萬分子時，由于把試樣溶液稀釋劃分成數(shù) 十萬以上，通過各自個另寸進4亍PCR (polymerase chain reaction)等的擴增反應(yīng)獨立擴增試樣中的全部的分子，即能克隆擴增。用這樣的方法個別地擴增多個DNA的試驗近幾年嘗試了幾個。譬 如在平面板上設(shè)置非常多的微小反應(yīng)孔，使包含靶DNA片斷和擴增必 要的酶和反應(yīng)底物等的溶液流到板上，劃分成微小反應(yīng)孔。劃分的PCR 溶液因為被互相分離，能獨立擴增。通過調(diào)整為進入1個區(qū)劃的DNA 試樣的量成為平均1個以下而能個別地擴增。這個方法的一例，在分 析化學(xué)中被公開(非專利文獻1)。本例，在硅基板上構(gòu)筑1萬個孔實 現(xiàn)高集成化?？墒?，為了擴增IOO萬個DNA片斷需要更多個反應(yīng)孔。 另外，不可能把成為對象的試樣溶液全部不剩注入微小反應(yīng)孔，溶液 剩余或被反應(yīng)孔的內(nèi)壁等吸附，產(chǎn)生了在PCR擴增反應(yīng)中沒有使用的 DNA。另外，不是以來自l個分子的擴增作為目標的嘗試，不過，也有 不使用微小容量的滴定板而使用平面的凝膠點陣進行PCR的例(專利 文獻l)。以前，采用在低溫進行凝膠化的材料使PCR產(chǎn)物試樣溶液凝 膠化提高試樣的操作性的方法是公知的(專利文獻2)，但在該例中， 利用矩陣配置了凝膠化試樣的基因檢驗用芯片?？墒牵捎谠摲椒ú捎昧丝臻g固定的反應(yīng)孔，所以在反應(yīng)孔中也存在包含目的擴增產(chǎn)物的 東西，不過，也存在完全不包含的東西。為此，出現(xiàn)了沒有被擴增的目 標試樣，怎么區(qū)分目的擴增產(chǎn)物成為問題。進而，作為一個更有力的方法，有被稱作為乳劑PCR的方法。該 方法代替使用每試樣獨立的反應(yīng)容器，在油中形成多個的微小液滴內(nèi) 進行反應(yīng)。用該方法，由于液滴的微小化通過攪拌等容易進行，所以 在IOO微升左右的一個容器內(nèi)能形成數(shù)十萬個以上的相當(dāng)反應(yīng)容器的 微小液滴。但是，采用乳劑的方法，由于不容易從各個微小液滴中個別回收 試樣，所以在微小液滴中使DNA或RNA固定，通過放入帶探針的珠， 從溶液分離在生成反應(yīng)物之后捕獲了反應(yīng)物的珠(beads)，回收各微 小液滴中的DNA或RNA。這樣，在回收使用這樣的珠固相的試樣時， 為了回收由酶反應(yīng)等得到的DNA或RNA，必須分開回收得到生成物的 固相與沒能得到的固相。為此，使用準備把具有由PCR反應(yīng)得到的DNA 的一部分互補序列的探針固定化的磁珠，使探針與被擴增了的DNA片 斷雜交后，用磁鐵區(qū)分回收的方法?；钣眠@個方法擴增多個DNA片斷 決定基因組序列的使用例，在"自然，，等有刊載(專利文獻3及非專利 文獻2)?？墒?，把該技術(shù)用于全部的mRM擴增和測量其序列還存在 重大的問題。該系統(tǒng)必須在乳劑中的1反應(yīng)液滴中包含珠和靶DNA1 拷貝，在生成的液滴中包含2個以上的珠，重復(fù)l個mRM計數(shù)，不能 數(shù)字計數(shù)。為了解除這個問題，使珠的量和DNA同樣很少時產(chǎn)生了大 量包含DNA、但不包含珠的液滴，還是不合適。采用固體珠回收生成 的DNA是好的方法，對使用重復(fù)的DNA試樣決定基因組序列等目的是 可以充分地使用的方法，不過，其不適于數(shù)字計數(shù)。專利文獻1特開2004-337064號公報專利文獻2特開平10-004963號公報專利文獻3W02005/10145 (PCT/US2004/015587)非專利文獻1Anal. Chem. 2001， 73， pl043-104非專利文獻2Nature. 2005， 437， p376-380， SupplementaryInf ormat ion) 發(fā)明內(nèi)容如前所述，以前的方法全都存在問題。首先，使用了滴定板的技 術(shù)沒有考慮同時處理多個試樣取出擴增產(chǎn)物時的液體處理，為了識別 被擴增了的反應(yīng)產(chǎn)物，照流體狀態(tài)原樣個別回收多個試樣，存在必須 有對應(yīng)試樣數(shù)的大量的試樣容器和繁雜的處理工作的問題。在珠表面捕獲擴增產(chǎn)物回收的方法，在珠里需要預(yù)先固定對反應(yīng) 必要的引物等，不過，存在把固定在固相的引物作為擴增用的引物使 用，在固相表面打算得到擴增產(chǎn)物時擴增效率下降的問題。這是因為 由于通過成為酶反應(yīng)的底物的DNA或是RNA等的分子被固定化，分子 運動的自由度下降，比溶液系反應(yīng)效率更大地下降。進而，還存在對 固相表面的DM或RNA的非特異性吸附問題。即，成為最初的擴增的 模板的DNA片斷被吸附在固相上時，作為模板不能靈巧地活動，得不 到在乳劑中包含DNA模板1個拷貝的物質(zhì)的擴增產(chǎn)物。特別在把用于 克隆擴增的目的的每1反應(yīng)液1個分子的極低濃度的DNA或RM試樣 作為開始原材料使用時，由于非特異性吸附產(chǎn)生的影響變得相對地大 而嚴重。進而，如前述所示，在各個微小乳劑反應(yīng)液中均勻地放入珠 是困難的。特別，在通過攪拌操作乳劑調(diào)制時不可能在全部的液滴中 放入相同數(shù)目的珠等的固相，時而多個珠進入一個液滴，時而一個也 沒進入。當(dāng)不能控制每個液滴的珠等的固相的數(shù)時，以試樣中的全分 子為對象精度很好地進行一分子測量變得困難。這樣，以前的方法并不適用對于同時擴增構(gòu)成為全部試樣的DNA 片斷池(從1細胞得到的mRNA或cDNA片斷的集合)的全部的成分并回 收的目的。本發(fā)明，是為了克服這以前的技術(shù)的問題而提出的，取出包含在 l個細胞中的mRM，將其轉(zhuǎn)錄成cDNA上，對每1分子擴增回收，調(diào)制 DNA序列試樣來作為課題。即，以提供這種技術(shù)作為目的，即該技術(shù) 用簡便的方法把DNA片斷池中包含的全部的成分以每1分子進行擴增并個別回收。為了解決上述課題，發(fā)明者們通過專心討論，通過確實實現(xiàn)每1 分子的擴增，只取出被擴增了的反應(yīng)產(chǎn)物的這樣的辦法，成功地把1個細胞中包含的全部的mRNA(cDNA)在每1分子中擴增并將它們個別 回收。即，本發(fā)明，涉及一種個別地擴增并取出試樣中的多種核酸的方 法，其特征在于，對稀釋成在l個微小液滴內(nèi)中包含不超過l種核酸 的試樣，在疏水性溶劑中的微小液滴內(nèi)進行PCR反應(yīng)，在PCR反應(yīng)結(jié) 束后以固體或凝膠的狀態(tài)分離反應(yīng)液。上述方法，包括以下工序通過在PCR反應(yīng)液中預(yù)先添加與擴增 產(chǎn)物結(jié)合或插入的熒光試劑、只分別選取含擴增產(chǎn)物的液滴。作為這 樣的熒光試劑，能舉出嵌入劑、作了熒光標記的分子信標等。對于試樣中的多種核酸，以可預(yù)先由單一的PCR引物擴增的方式 導(dǎo)入接頭序列。在本發(fā)明，為了在每液滴獨立進行擴增，PCR反應(yīng)是在分散于疏 水性溶劑中的微小液滴乳劑中進行或是在序列有互相分離的微小反應(yīng) 孔的板的微小反應(yīng)孔內(nèi)進行。在PCR反應(yīng)液中，為了以固體或凝膠的狀態(tài)分離反應(yīng)后的液，預(yù) 先添加用于形成水凝膠的、瓊脂糖、明膠、淀粉、角叉菜膠、果膠、 瓊脂膠、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮等的水 溶性合成聚合物等的凝膠化劑。作為在本發(fā)明能使用的疏水性溶劑，以硅油或石蠟油作為主劑是 優(yōu)選的。另外，在PCR反應(yīng)液中，為了提高在疏水性媒體中的微小液滴的 穩(wěn)定性，把表面活性劑(兩親性物質(zhì)等)及/或覆膜形成劑預(yù)先添加到 PCR反應(yīng)液中是優(yōu)選的。本發(fā)明另外也提供一種核酸分析方法，其包括檢測或定量用上述 的方法個別地擴增并取出的多種核酸的工序。進而，本發(fā)明提供是用于上述方法的裝置，其具有l(wèi))由用于以溶液狀態(tài)保存凝膠化劑的調(diào)溫機構(gòu)、用于混合凝膠化劑和反應(yīng)液的液體處理機構(gòu)、和攪拌機構(gòu)構(gòu)成的試樣分注混合裝置，2)由振蕩或轉(zhuǎn)動 式的攪拌機、噴墨式及細微流路的任意一個構(gòu)成的微小液滴調(diào)制裝置， 3)用于PCR反應(yīng)的具有熱循環(huán)功能的調(diào)溫裝置，及4)具備圖像檢測 方式或流式細胞方式的檢測器的焚光檢測裝置。在上述裝置，在4)的流式細胞方式中，具備流式細胞通過流路 轉(zhuǎn)換的分配功能。另外，本發(fā)明提供一種核酸分析系統(tǒng)，其包括所述的裝置和DNA 測序4義及/或流式細胞儀。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，可以同時分別用PCR擴增象在1個細胞中包含的全 部的mRNA的多個微量試樣，用熒光確認得到的擴增產(chǎn)物，回收作為凝 膠的微小液滴。為了回收，不需要在反應(yīng)液中設(shè)置固相，由此引起的 成本和工夫可以被節(jié)省減少。同時，能防止由于使用固相而導(dǎo)致的試樣損失和反應(yīng)效率的降低。


圖l是本發(fā)明的方法的示意圖。圖2是把本發(fā)明的方法用于cDNA時的示意圖。圖3是本發(fā)明的方法的工序圖。圖4是本發(fā)明的實施例1的數(shù)據(jù)。圖5是本發(fā)明的實施例1的說明圖。圖6是本發(fā)明的實施例1的數(shù)據(jù)。圖7是本發(fā)明的實施例1的數(shù)據(jù)。圖8是本發(fā)明的實施例2的說明圖。圖9是本發(fā)明的實施例2的說明圖。圖IO是本發(fā)明的實施例2的說明圖。圖11是本發(fā)明的實施例3的說明圖。圖12是本發(fā)明的實施例4的說明圖。圖13是本發(fā)明的實施例5的說明圖。 符號說明l-3:DM分子，4， 5， 7: DNA進入了的孩t小液滴，6， 8: DNA沒進 入的微小液滴，9:反應(yīng)容器，10:油，ll:乳劑，12:熒光，13:有來自 DNA1-3的擴增產(chǎn)物的微小液滴，14:沒有擴增產(chǎn)物的微小液滴，21:1 個細胞，22:從1個細胞得到的mRNA， 23:磁珠，24:聚T低聚物， 25:互補鏈DNA， 26: c醒，27:切斷處，28:接頭序列，29:DNA片斷， 30:游離了的單鏈DNA，31:在珠上固定化了的單鏈DNA, 32， 33， 34: 引物，35:引導(dǎo)序列，41:在同樣反應(yīng)容器內(nèi)的疏水性溶劑中比擴增對象的模板分子數(shù)還多地調(diào)制多個含有凝膠化劑及熒光色素的擴增用反 應(yīng)液的微小液滴的工序，42:進行擴增反應(yīng)的工序，43:確認含有 擴增產(chǎn)物的凝膠化了的微小液滴的工序，44:分取含有擴增產(chǎn)物的凝 膠化了的微小液滴的工序，45,46,47:目的PCR產(chǎn)物的帶，48， 49:凝膠 化了的反應(yīng)液的微小液滴，50:油，51:乳劑，71:熒光檢測的液滴數(shù) 與模板分子數(shù)的關(guān)系(40循環(huán))，72:熒光檢測的液滴數(shù)與模板分子 數(shù)的關(guān)系(60循環(huán))，80， 85:板，81， 82， 88:微小液滴，83， 86:孔，84， 89: 疏水性溶劑，87:凸部，IOO:噴墨式單元，101:儲箱，102:噴嘴，103: 微小液滴，104:疏水性溶劑，105:容器，106:乳劑，110:試樣，111: 流式細胞流路，112:流液，113， 114:微小液滴，115:激發(fā)光源，116: 激發(fā)光，117:熒光檢測機構(gòu)，118:流路，119， 120:微小液滴，121:流 動的方向，122:液流，131:試樣分注混合裝置，132:微小液滴調(diào)制裝 置，133:熱循環(huán)裝置，134:熒光檢測裝置，135:分取裝置 序列表序列號1:引物 序列號2:引物具體實施方式
本發(fā)明，不在PCR反應(yīng)中添加成為擴增的阻礙主要原因的固體珠 或不使用由固體構(gòu)成的微小反應(yīng)孔，用乳劑反應(yīng)液在微小液滴內(nèi)同時進行多個PCR反應(yīng)，只回收進行了 DNA互補鏈合成的反應(yīng)溶液。在本發(fā)明中所謂"微小液滴"意味著1個液滴含有1種核酸的微 小的液滴，其大小不特別限定，不過，直徑1 jam~ 150jam左右是優(yōu)選 的。同時，所謂"微小孔"是容納上述1個微小液滴的孔，其大小不 特別限定，不過，直徑為3|um~ 250jam左右，能設(shè)置10萬個以上是優(yōu) 選的。另外，試樣充分稀釋使用，以使在上述的微小液滴內(nèi)包含的核酸 不超過1種。同時，在試樣中的核酸里預(yù)先導(dǎo)入接頭序列，以便用單 一引物就能擴增。接頭序列的引進，譬如，在從mRNA合成cDNA時， 使用包含接頭序列的引物來進行等，可以根據(jù)公知的方法實施。PCR反應(yīng)在使珠等固體相不共存的溶液狀態(tài)下進行，高效率地進 行PCR反應(yīng)。其次，包含擴增產(chǎn)物的乳劑，使溫度下降，以固體或凝 膠狀態(tài)下取出。因為PCR通常在50~ 96。C的高溫下進行，在室溫或其 以下的溫度能把乳劑作成固體或凝膠取出。即，可以實現(xiàn)在使高溫下 成液體，在低溫下成固體或凝膠的物質(zhì)共存。存在各種識別是否進行了互補鏈合成的方法，但本發(fā)明的實施例 展示了使用了進入雙鏈DM之間發(fā)出熒光的嵌入劑的熒光檢測的例。 作為嵌入劑可舉出SYBR綠色I， Pico綠色，溴化乙錠等。檢測不限于 嵌入劑，在進行了互補鏈合成時可以象分子信標一樣利用發(fā)生熒光的 探針。區(qū)分捕獲在取出的凝膠或反應(yīng)溶液珠(因為是固體狀態(tài)或凝膠狀 態(tài)，故這樣稱呼)上照射激光發(fā)出熒光之物。為此，除能使用流式細胞 儀等既存的裝置以外，可以利用采用了微流路的珠波段器(beads selector )等。在上述的方法中，作為用于使反應(yīng)物固化或凝膠化并取出的素材， 可以使用瓊脂糖，明膠，淀粉(直鏈淀粉)，聚丙烯酰胺等的親水性凝 膠化劑。由于這些凝膠化劑是熱溶解性的，故能在反應(yīng)效率好的溶液 系統(tǒng)中實現(xiàn)反應(yīng)。即，這些凝膠化劑的水溶液在作為一般的耐熱酶的 反應(yīng)溫度的5(TC以上的條件下是溶液狀態(tài)，在反應(yīng)產(chǎn)物取出時的室溫條件下凝膠化。當(dāng)需要在37。C左右成溶液狀態(tài)時，也能使用低熔點瓊 脂糖。當(dāng)然，除此之外也可以隨著DM互補鏈合成添加成為固體狀的 物質(zhì)。以下，根據(jù)實施例詳細說明本發(fā)明，不過，本發(fā)明不限于這些實施例。實施例1:本實施例表示在油中攪拌調(diào)制包含瓊脂糖的乳劑的例。 在圖1中表示了本方法的基本概念。通過把包含作為分析對象的 DNA分子1-3的試樣溶液區(qū)分成比DNA分子的總數(shù)N多的M個微小液 滴4-8,形成DM進入了的微小液滴4， 5， 7， DNA沒進入的微小液滴6， 8。 微小液滴4-8分散在反應(yīng)容器9的油10中形成乳劑11。包含該微小 液滴的乳劑進行了 PCR等的擴增反應(yīng)之后，根據(jù)使用嵌入劑等的熒光 檢測檢測出在各微小液滴中得到的擴增產(chǎn)物的有無(量)，分成有熒 光12檢測出的來自各DMl-3的擴增產(chǎn)物的微小液滴13和熒光檢測不 出的沒有擴增產(chǎn)物的微小液滴14。由于使微小液滴含有預(yù)先在常溫下 形成凝膠或固體的凝膠化劑，故能分取各個微小液滴。即根據(jù)只回收 照射激光發(fā)光的液滴(凝膠)，或溶化不發(fā)光的液滴(凝膠)并除去，可 以得到目的擴增產(chǎn)物。其次，用圖2說明以來自1個細胞的cDNA為對象的情況。把在磁 珠23等上固定從1個細胞21得到的mRNA22的聚T低聚物24作為探 針捕獲，用逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補鏈DNA25(第一鏈合成)。用RNaseH分解 mRNA22之后，用隨機引物形成cDM雙鏈26 (第二鏈合成)。接著用Mbol 等的限制酶切斷序列特異性的DNA雙鏈。在切斷處27通過連接結(jié)合序 列已知的接頭序列28，而作成PCR引發(fā)位點。使包含這樣得到的珠固 定的雙鏈MA片斷29的溶液升溫，溶離雙鏈，得到從在珠23中固定 化的單鏈31游離了的單鏈DNA30。該單鏈DNA兩端的序列在？末端是 接頭序列28的已知序列，在3'末端是聚A,故可以共用接頭序列28 和聚T引物來進行PCR擴增。加上游離的單鏈DNA30和二個引物32， 33 及互補鏈合成底物.酶，在如圖1所示的微小液滴中進行PCR擴增。這時，在上述的低溫下加凝膠化的瓊脂糖和嵌入劑。關(guān)于PCR反應(yīng)的 細節(jié)將在后面說明，不過，因為在50-96。C左右的熱循環(huán)中進行，所以 在該溫度下，瓊脂糖是液體狀。PCR結(jié)束后，使其在室溫，把包含瓊 脂糖的反應(yīng)液作成凝膠珠回收。另一方面，在計算具有特定的序列的 多個mRNA時，使用對這些序列具有特異性的序列的引物34，不過， 也可以固定具有沒有特異性的引導(dǎo)序列35的部分，把該部分用作PCR 擴增引物。
本實施例中，為了 了解加入的DNA模板數(shù)，而使用模型樣品進行 了實驗，不過，在實際的cDNA測量中也可以使用同樣的引物進行個別 地擴增。
以下根據(jù)圖3對擴增工序進行說明。本擴增工序由以下工序組成。 (1)在同 一反應(yīng)容器內(nèi)的疏水性溶劑中，調(diào)制比擴增對象的模板分子數(shù)
多的多個含有凝膠化劑及熒光色素的擴增用反應(yīng)液的微小液滴的工序 41， (2)進行擴增反應(yīng)的工序42， (3)確認包含擴增產(chǎn)物的凝膠化了 的微小液滴的工序43， (4)分取包含擴增產(chǎn)物的凝膠化了的微小液滴 的工序44。下面，詳述4個工序。
(1)在同 一反應(yīng)容器內(nèi)的疏水性溶劑中調(diào)制比擴增對象的模板分 工序' 化'、'''、、 、:'、一'、'
準備以下組成的pcr反應(yīng)液120mM Tris-S04 (pH8. 9) ， 36mM石危酸 銨，4mM MgS04, 0. 4mM dNTPs， F引物0. 4 m M (GTTTTCCCAGTCACGACGTTG: 序列號l)，R引物0. 4pM (ATGACCATGATTACGCCAAGC:序列號2)，擴增 用酶Plati謹Taq駆聚合酶High Fidelity(Invitrogen公 司)O. 04unit/jLiL (每一反應(yīng)的體積50 |u 1)。
在上述反應(yīng)液中可以使用作為模板DNA能估計拷貝數(shù)的市售的 pUC19質(zhì)粒DNA (2686堿基，寶生物)。實際上調(diào)制成該模板在每一反應(yīng) 包含104~ 108分子，確認了擴增效率等。質(zhì)粒DNA的分子數(shù)由產(chǎn)品的 附加資料的原液的濃度(0. 5 )i g/ Hi 1, 1. 7xl()U分子/ u 1)求出。在反應(yīng) 液中作為PCR產(chǎn)物的熒光檢測用色素添加了 SYBR綠色(SYBR Green) I溶液(Invitrogen公司，S7563)，以形成原液的2500倍的稀釋度。再 者，因為本品的摩爾濃度沒被公布，因此稀釋度不是絕對的數(shù)值。作為熒光色素，除SYBR綠色I之外，也可以使用通過Pico綠色， 溴化乙錠等與雙鏈DNA結(jié)合使熒光強度增強的嵌入劑。除此以外，可 以使用象分子信標一樣地在進行互補鏈合成時產(chǎn)生熒光的探針。作為凝膠化劑采用了瓊脂糖。在瓊脂糖中使用了凝膠強度為 1800g/平方厘米(1% (w/v)凝膠)以上的高凝膠強度的Seakem Gold Agarose (寶生物公司)。凝膠濃度若考慮反應(yīng)開始(七少卜7少-)時液體的容易處理和 在取出時的凝膠狀態(tài)下處理所必需的硬度雙方，則瓊脂糖的情況優(yōu)選 為1-1. 5% (w/v)。但，由于凝膠強度即使是同樣的凝膠材料，根據(jù)產(chǎn) 品的不同差異也很大，所以每種材料最佳的濃度不同。對于想確保在 取出后的凝膠的硬度，或是，除去凝膠的水分后的干燥狀態(tài)下的尺寸 的情況，也可以采用更高濃度的凝膠。對瓊脂糖到2. 5% (w/v),對明 膠到5. 0% (w/v)，對于PCR反應(yīng)沒有大的障礙。因為瓊脂糖很難從粉末溶化，故預(yù)先釆用高壓鍋加熱到121。C調(diào) 制2.5% (w/v)的均勻的水溶液，準備形成容易吸移的粘度的50。C以上 的溶液。使該2. 5%瓊脂糖水溶液與每50。C左右的上述PCR反應(yīng)液等 體積(每一反應(yīng)各50jli l)快速地混合，最終調(diào)制瓊脂糖濃度1.25% (w/v)的反應(yīng)液(每一反應(yīng)計100nl)。混合時的溫度是對耐熱性酶沒 有影響的9(TC以下。乳劑調(diào)制用的油使用了硅油系混合油。組成參考上述文獻 (Nature,2005，437， p376-380， (Supplementary Information)中的 記述，作成以下的組成(l)聚苯基曱基硅氧烷 (Polyphenylmethylsiloxane)(Fluka公司，商品名AR20)為25% (v/v) (2)10% (v/v) PEG/PPG-18/18 二甲基硅氧垸(Dimethicone )聚合物， 十曱基五環(huán)珪氧烷(Decamethylpentacyclosiloxane )溶液(東 麗.Dowcorning公司，商品名DC5225C)為50%(v/v) (3) 50%(v/v) 三甲基甲珪烷硅酸酯(Trimethylsiloxysilicate)，十甲基五環(huán)珪氧烷溶液(東麗.Dowcorning公司，商品名BY1H18)為25% (v/v)。各成分，聚苯基曱基硅氧烷是基油，十甲基五環(huán)硅氧烷是溶劑， PEG/PPG-18/18 二甲基硅氧烷聚合物是具有表面活性作用及增加粘性 的聚合物，三曱基甲硅烷硅酸酯是在和水的界面上形成硅酸的覆蓋膜 的成分。把該混合油與加入上述的凝膠化劑的反應(yīng)液同量(每一 反應(yīng)100 Ml)混合，調(diào)制乳劑(混合后，每一反應(yīng)200jj 1)。把混合液放入2ml 的樣品管中，通過在旋渦攪拌器(Titec公司，2500rpm)中攪拌2-5秒 左右，能得到直徑50-lOOium左右的微小液滴。液滴的尺寸，可以根據(jù)作為目的的擴增倍率及擴增對象的分子數(shù) 而變化，直徑20-200 ni m是優(yōu)選的，特別對于在把與一個細胞中存在的 基因數(shù)相當(dāng)?shù)?0萬左右的分子作為對象時，因為確保了直徑50-100 jam左右對擴增必要的充分的試劑成分量，且總反應(yīng)液量在操作容易 的lml以下，所以是優(yōu)選的。形成反應(yīng)液的微小液滴乳劑的方法沒有特別限制，除了使用上述 的攪拌機攪拌以外，可使用噴墨法，使用細微流路的方法(Angew. Chem. Int. Ed. 2005,44， p724-728)等。得到的乳劑在一般的塑料制反應(yīng)容器中進行擴增反應(yīng)就可以。在 一般的反應(yīng)容器之外，也可以根據(jù)容易進行反應(yīng)后的觀察的目的，在 序列了互相分離的微小反應(yīng)孔的板的微小反應(yīng)孔內(nèi)進行擴增反應(yīng)。油的各成分的混合比的變化對反應(yīng)液的微小液滴自身的形成沒 有大的影響，但對作為乳劑的穩(wěn)定性多少有些影響。在油是基油成分的 聚苯基曱基硅氧烷100%的情況，由于乳劑形成后油部分也不白濁而 透明，故對于光學(xué)的檢測特別適合，不過，反應(yīng)液的微小液滴彼此變得 容易緊貼在一起。但，因為凝膠化劑加入到反應(yīng)液中，微小液滴彼此 不會融合成一個。在基油成分的聚苯基甲基硅氧烷中，當(dāng)三甲基甲硅 烷硅酸酯以成分量超過5%左右(在50%溶液中1/10容量)添加時，微 小液滴彼此的緊貼被解除。以把該成分增加到成分量的25% (在50% 溶液中1/2容量)，效果也同樣。另外，在基油成分的聚苯基曱基硅氧烷中，若按成分量添加1%(v/v)(在10%溶液中1/10容量)以上的PEG/PPG-18/18，則乳劑形成 后整體白濁，不過，與乳劑中的微小液滴的油的分離被抑制，乳劑的穩(wěn) 定性提高。使PEG/PPG-18/18在成分量中增加到7% (v/v)(在10%溶 液中7/10容量)，效果也沒有大的變化。上述使用的表面活性劑成分，增加粘性成分，形成覆膜成分也可 以用類似的物質(zhì)代替。作為疏水性溶劑，除了上述的硅油(有機硅)系油以外，也能使用 礦物油等的石蠟系油等。由于硅油系油比重為0. 98左右，接近作為反 應(yīng)液的溶劑的水的比重1，由溫度產(chǎn)生的粘度的變化少，能形成反應(yīng) 液和穩(wěn)定的乳劑，故特別優(yōu)選。(2) 進行擴增反應(yīng)的工序調(diào)制成上述的乳劑狀態(tài)的反應(yīng)溶液，每次50jLil分注到0. 2ml的 管中，在94°C15秒，55。C30秒，70。C1分鐘的熱循環(huán)條件下進行通過 PCR的擴增反應(yīng)。循環(huán)數(shù)是40個循環(huán)。作為熱循環(huán)用裝置可以使用熱 循環(huán)爐9700 (Apuraido生物系統(tǒng)/〉司)。在熱循環(huán)裝置中，最好在PCR的熱循環(huán)的功能以外，還附加在反 應(yīng)進行時用于使凝膠化劑水溶液、反應(yīng)液、混合油保持在高溫狀態(tài)的 50。C以上的恒溫槽功能。(3) 確認包含擴增產(chǎn)物的凝膠化了的微小液滴的工序反應(yīng)后，對乳劑添加5倍容量的異丙醇，使乳劑一次液化，停止 旋轉(zhuǎn)，回收凝膠化了的微小液滴的珠。包含回收的擴增產(chǎn)物的凝膠化微小液滴珠，用凝膠電泳(安捷倫公 司生物分析器，DM5 0 0試劑盒，或2 %瓊脂糖凝膠)進行電泳，可以確認 擴增產(chǎn)物的尺寸及量。圖4是使用了模板以lxl(T分子添加時的擴增 產(chǎn)物的安捷倫公司生物分析器的電泳分析的結(jié)果。按同樣的反應(yīng)液組 成，還并行調(diào)制和比較了沒加凝膠化成分的試樣(試樣l)和沒有作成 微小液滴的乳劑狀態(tài)的試樣(試樣2)。在與上述回收的試樣(試樣3)的帶47，沒加凝膠化成分的試樣(試樣1)的帶4 5,在與有凝膠化成分沒作成乳劑狀態(tài)的試樣(試樣2)的帶 46同樣的lll堿基的位置泳動，可以確認生成與比較對象相同尺寸的 產(chǎn)物。反應(yīng)后的乳劑狀態(tài)的反應(yīng)溶液不用熒光顯微鏡(構(gòu)成例奧林巴斯 BX51，U1S-2光學(xué)系，物鏡UplanSApo，反射鏡單元WIB-UMWIB3)進行象 上述一樣的精制，可以直接觀察。在圖5中模式性地表示觀察的狀態(tài)。 圖6表示模板以lxl()s分子添加時用熒光觀察的結(jié)果的一例。在凝膠 化了的反應(yīng)液的微小液滴48,49中，有擴增產(chǎn)物的微小液滴48用SYBR 綠色I的熒光觀測明亮，沒有擴增產(chǎn)物的微小液滴49觀測暗黑。使每一反應(yīng)的模板數(shù)變化，按與上述圖5及以圖6同樣的要領(lǐng)進 行觀察，對熱循環(huán)數(shù)是40循環(huán)的場合71、熱循環(huán)數(shù)是60循環(huán)的場合 72將由擴增產(chǎn)物產(chǎn)生的焚光被觀測的微小液滴48數(shù)量的比例，分別 繪出的圖表示在圖7中。如圖7所示，顯示熱循環(huán)數(shù)是40循環(huán)的情況和60循環(huán)的情況的 變化小而效率高地被擴增并以4 0循環(huán)大體上達到平穩(wěn)。假定微小液滴的平均直徑為50um，每一個的平均體積是以65pl, 每1反應(yīng)(100p l)的微小液滴的個數(shù)是1. 5xl(^個，在反應(yīng)開始時模 板以105個添加時，在小于1成的微小液滴中包含一分子的模板，在 模板107個添加時，可以期待在幾乎全部的微小液滴中包含一分子以 上的模板，不過，圖7所示的擴增產(chǎn)物檢測出的微小液滴的比例的實測 結(jié)果，模板以105個添加時為幾％，以106個添加時為十幾％，以io7 個添加時幾乎接近100%的上述的期望值，表示在本實施例中的擴增 順利地進行。另外，對于擴增產(chǎn)物的量也進行了研究。由于上述圖4所示的回 收的擴增產(chǎn)物(試樣3)的電泳分析結(jié)果中的lll堿基產(chǎn)物的帶47的濃 度定量為約lng/ul (由安捷倫生物分析器2100測出的定量值)，所 以每1反應(yīng)100 u 1會回收約100ng的擴增產(chǎn)物。111堿基的雙鏈DM 的100ng相當(dāng)于1.4pM, 8xl()H分子。對擴增率也進行了考察。根據(jù)圖7所示的結(jié)果，因為在反應(yīng)開始時模板以l(T個添加的情況由約10%的微小液滴確認擴增產(chǎn)物，若把 每1反應(yīng)100 in 1的微小液滴的個數(shù)根據(jù)上述的假定作成1. 5xl()6個， 則得到擴增產(chǎn)物的微小液滴是其10%的1.5xl()5個，每一個得到擴增 產(chǎn)物的微小液滴的PCR產(chǎn)物約為5xl(^分子，這表示擴增率為5xl06 倍，是良好的。擴增產(chǎn)物的觀察除了上述以外也可以用后述的流式細 胞儀。(4)分取包含擴增產(chǎn)物的凝膠化了的微小液滴的工序 本實施例，含擴增產(chǎn)物的凝膠化了的微小液滴在顯微鏡觀察下采用安裝了毛細管的移液管(德朗蒙德公司制測序移液管等)進行了回收?；厥盏纳鲜龅奈⑿∫旱文軐崟r地用PCR確定其中包含的擴增產(chǎn)物 的量。另外，對擴增產(chǎn)物，也可以供給加上再次擴增過程的Sanger 法或Pyrosequencing法來進行堿基序歹'J確定。在回收方法中，除了上述以外也可以使用后述的流式細胞儀。根 據(jù)本實施例，可以同時個別地用PCR擴增106個的多個微量試樣到 5xl()6倍，用熒光確認得到的擴增產(chǎn)物，作為凝膠的微小液滴回收。為 了個別回收，不需要在反應(yīng)液中設(shè)置固相，節(jié)省了為此的成本和工費。 另外，能防止由于使用固相產(chǎn)生的反應(yīng)效率的降低。實施例2:反應(yīng)容器的形狀本實施例在互相分離的微小反應(yīng)孔序列的板上構(gòu)成反應(yīng)容器的形 狀。用圖8-10說明本實施例。象圖8—樣，在板80上設(shè)置多個收集 各個微小液滴81， 82的孔83?？?3如圖9所示，2維序列構(gòu)成板80。 微小液滴直接進入孔83，可以用疏水性溶劑84等為蓋，也可以進入 孔83中的疏水性溶劑84中。這個情況的疏水性溶劑84，除形成乳劑的目的以外，也能實現(xiàn) 防止反應(yīng)液中的水分蒸發(fā)的功能，保持微小液滴的形狀為球狀的功能， 在凝膠取出時防止凝膠和容器表面的粘接的功能。微小液滴81或82需要被互相分離，不過，不一定需要使孔83本 身被互相分離，象圖10的板85 —樣，也可以用在孔86間具有的凸部87來限制微小液滴88移動，用充滿各孔的疏水性溶劑89使多個微小 液滴88間分離。各孔的直徑由于多個試樣從5 jjm至150 iam同時擴增是優(yōu)選的。 對孔的數(shù)量沒有特別限制，但在把來自 一個細胞的全表達基因的擴增 作為目的時，10萬以上最好。板的材質(zhì)，聚碳酸酯等耐熱性、透明的塑料或玻璃對熱循環(huán)及光 學(xué)測量最優(yōu)選的。根據(jù)本實施例，由于反應(yīng)后的微小液滴在板平面上被展開，擴增 反應(yīng)后的觀察容易。另外，由于平面上的各微小液滴的位置固定，故 可以根據(jù)其位置識別各微,J 、液滴。實施例3:本實施例表示微小液滴的制法的另 一例。用圖11對本實施例進行說明。本實施例為了形成^U、液滴使用噴 墨式單元100。噴墨式單元100，由用于貯存為調(diào)制微小液滴103的溶 液的儲箱101和使微小液滴化而噴出的噴嘴102構(gòu)成。通過在噴嘴內(nèi) 瞬間加熱反應(yīng)液，噴出一定量的反應(yīng)液。微小液滴103對著容器105 配置，使其直接向疏水性溶劑104中噴出或落下。微小液滴103通過 向疏水性溶劑104中噴出或落下，調(diào)制乳劑106。本實施例適合微小液滴的尺寸和數(shù)量的控制，特別適合調(diào)制從 0. 5pl到10pl左右(直徑lOjum-30ym左右)的液滴。在向疏水性溶 劑中直接噴出微小液滴時，對防止試樣的互相混合有效。實施例4:本實施例涉及使用了得到擴增產(chǎn)物的微小液滴的檢測 分取的流 式細胞的構(gòu)成。用圖12對本實施例進行說明。使包含擴增反應(yīng)后的微小液滴 113， 114的試樣110隨著液流112流動的方向121向形成光學(xué)單元的 流式細胞流路lll流動。液流除自然落下流動外，也可以采用泵。使 來自激發(fā)光源115的激發(fā)光116照射在微小液滴上，用由光檢測器、 透鏡、過濾器等構(gòu)成的熒光檢測機構(gòu)117檢測得到的熒光。根據(jù)得到的熒光強度判定擴增產(chǎn)物的量(或有無)。在流路中流動的液流112在 上述實施例1的乳劑組成的情況，硅油系的油(例聚苯基曱基硅氧烷) 是優(yōu)選的。通過在另外的流路118上產(chǎn)生液流122，把熒光強度一定水平以 上的微小液滴119與焚光強度一定水平以下的微小液滴120分離，進 行回收。對熒光強度一定水平以下的微小液滴也可以進行同樣的分離 回收。在另外的流路118上進行回收時，也可以用激光等局部性地加 熱微小液滴119，溶化凝膠進行回收。根據(jù)本實施例，可以根據(jù)包含的擴增產(chǎn)物的量連續(xù)、自動地進行 分離回收擴增反應(yīng)后的微小液滴的操作。實施例5:本實施例對用于實施本發(fā)明的方法的裝置進行說明。在圖13中表示裝置的方塊圖。本實施例的裝置，具有試樣分注混合裝置131、微小液滴調(diào)制裝置132、熱循環(huán)裝置133、熒光檢測裝置134和分取裝置135。試樣分注混合裝置131，具有用于以溶液狀態(tài)保存凝膠化劑的調(diào)溫機構(gòu)、用于使凝膠化劑與反應(yīng)液混合的液體處理機構(gòu)、及攪拌機構(gòu)。調(diào)溫機構(gòu)的調(diào)溫范圍是0-12(TC，對應(yīng)與凝膠化劑迅速溶解所必需的溫度。微小液滴調(diào)制裝置132由任意一個方式的攪拌機構(gòu)構(gòu)成。即，由 振動或轉(zhuǎn)動式的攪拌機、實施例3中所述的噴墨式、使用了細微流路 的方法的任意一個構(gòu)成。熱循環(huán)裝置133是具有與普通的PCR用熱循環(huán)爐同樣的調(diào)溫機構(gòu) 的裝置。也可以與上述131的調(diào)溫機構(gòu)兼用。焚光檢測裝置134,由熒光顯微鏡的圖像檢測方式，或流式細胞 方式的檢測器構(gòu)成。分取裝置135，具有如在實施例4中所述的附隨流式細胞設(shè)置的 流路轉(zhuǎn)換機構(gòu)。根椐本實施例，可以同時個別地用PCR擴增多個微量試樣，用熒光確認得到擴增產(chǎn)物，作為凝膠的微小液滴進行回收的工序省力。 產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明，是對1個細胞中包含的全部的mRNA或認為有必要測量的 多種mRNA進行數(shù)字計數(shù)的定量分析所必要的要件技術(shù)。因此，包括生 物領(lǐng)域、醫(yī)療領(lǐng)域、化學(xué)領(lǐng)域，對有必要進行單分子分析的所有領(lǐng)域 是有用的。序列表<110> HITACHI, LTD. <120〉試樣調(diào)制法及裝置 <130> H750051 <160> 2<170> Patentln version 3. 4〈210〉 1 <211> 20 <212〉 DNA 〈213〉人工序列<220〉<223>發(fā)明人Murakawa， Katsuji; Takiguchi, Sumiyo; Kanbara， Hideki<220><223〉 引物 <400〉 1gUUcccag tcacgacgtt g〈210〉 2 <211> 20 〈212〉 DNA <213〉人工序列<220〉<223〉 引物 <400> 2atgaccatga ttacgccaag c
權(quán)利要求
1.一種方法，該方法是進行個別地擴增并取出試樣中的多種核酸的方法，其特征在于，對稀釋成在1個微小液滴內(nèi)包含的不超過1種核酸的試樣，在疏水性溶劑中的微小液滴內(nèi)進行PCR反應(yīng)，在PCR反應(yīng)結(jié)束后以固體或凝膠的狀態(tài)分離反應(yīng)液。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，包括以下工序通過 在PCR反應(yīng)液中預(yù)先添加與擴增產(chǎn)物結(jié)合或插入的焚光試劑、只分別 選取含擴增產(chǎn)物的液滴。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)在分散 于疏水性溶劑中的微小液滴乳劑中進行。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)在排列 有互相分離的微小反應(yīng)孔的板的微小反應(yīng)孔內(nèi)進行。
5. 如權(quán)利要求1~4中任一項所述的方法，其特征在于，試樣中 的多種核酸，以能預(yù)先由單一的PCR引物擴增的方式導(dǎo)入接頭序列。
6. 如權(quán)利要求1~5中任一項所述的方法，其特征在于，為了以 固體或凝膠的狀態(tài)分離反應(yīng)液，在PCR反應(yīng)液中，預(yù)先添加從瓊脂糖、 明膠、淀粉、角叉菜膠、果膠、瓊脂膠、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚 乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮中選出的任一種凝膠化劑。
7. 如權(quán)利要求1~6中任一項所述的方法，其特征在于，上述疏 水性溶劑以硅油或石蠟油作為主劑，
8. 如權(quán)利要求1~7中任一項所述的方法，其特征在于，還把表 面活性劑及/或覆膜形成劑預(yù)先添加到PCR反應(yīng)液中。
9. 一種核酸分析方法，其包括檢測或定量用權(quán)利要求1~8的方 法個別地擴增并取出的多種核酸的工序。
10. —種用于個別地擴增并取出多種核酸的裝置，其具有1)由 用于以溶液狀態(tài)保存凝膠化劑的調(diào)溫機構(gòu)、用于混合凝膠化劑與反應(yīng) 液的液體處理機構(gòu)、和攪拌機構(gòu)構(gòu)成的試樣分注混合裝置，2)由振蕩 或轉(zhuǎn)動式的攪拌機、噴墨式及細微流路的任一個構(gòu)成的微小液滴調(diào)制裝置，3)用于PCR反應(yīng)的具有熱循環(huán)功能的調(diào)溫裝置，及4)具備圖 像檢測方式或流式細胞方式的檢測器的熒光檢測裝置。
11. 如權(quán)利要求10所述的裝置，在上述4)的流式細胞方式中，具備流式細胞通過流路轉(zhuǎn)換的分配功能。
12. —種核酸分析系統(tǒng)，其包括權(quán)利要求10所述的裝置和DNA 測序儀及/或流式細胞儀。
全文摘要
本發(fā)明提供試樣調(diào)制法及裝置，具體方法是把作為分析對象的含有DNA分子1的試樣溶液劃分成比DNA分子總數(shù)N還多的M個微小液滴，使含有微小液滴的乳劑進行PCR等的擴增反應(yīng)以后，通過使用嵌入劑等的熒光檢測來檢測出各微小液滴中得到的擴增產(chǎn)物的有無(量)。
文檔編號C12Q1/68GK101275164SQ200710186088
公開日2008年10月1日 申請日期2007年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者村川克二, 瀧口純代, 神原秀記 申請人:株式會社日立制作所