專利名稱：人cdr－移植抗體及其抗體片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人CDR-移植抗體及其抗體片段，這種抗體與人CC趨化因子受體4(以下稱為“CCR4”)的胞外區(qū)特異反應(yīng)，但不與血小板反應(yīng)。而且，本發(fā)明涉及一種人CDR-移植抗體及其抗體片段，這種抗體與人CCR4的細(xì)胞外區(qū)特異反應(yīng)，但不具有CCR4配體，如與CCR4結(jié)合的TARC或MDC的抑制活性。此外，本發(fā)明涉及一種人CDR-移植抗體及其抗體片段，這種抗體與CCR4的胞外區(qū)特異反應(yīng)，具有細(xì)胞毒活性和抑制Th2細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的活性，并含有特異的互補(bǔ)決定簇(以下稱為“CDR”)。本發(fā)明也涉及編碼抗體或其抗體片段的DNA。而且，本發(fā)明涉及含有此DNA的載體，和用該載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。此外，本發(fā)明涉及了采用轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗體或其抗體片段的方法，和一種藥物，例如治療制劑、診斷制劑及其類似物，其中包括使用此抗體或其抗體片段，用于Th2介導(dǎo)的免疫疾病如異位性疾病和類似疾病。另外，本發(fā)明涉及一種藥物如治療制劑，診斷試劑及其類似物，其中包括使用此抗體或其抗體片段，用于癌癥如血癌，如白血病，和淋巴瘤形成。
背景技術(shù)：
多種因素如嗜酸性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞，IgE在異位性疾病如支氣管哮喘中起作用。嗜酸性粒細(xì)胞浸潤至炎癥部位，通過脫粒釋放細(xì)胞毒堿性蛋白質(zhì)如MBP(主要堿性蛋白質(zhì))或其類似物，周圍組織被這些細(xì)胞毒堿性蛋白質(zhì)損害。肥大細(xì)胞與B細(xì)胞產(chǎn)生的IgE結(jié)合成抗原免疫復(fù)合體，并釋放組織胺，因此誘導(dǎo)速發(fā)性變態(tài)反應(yīng)。變態(tài)反應(yīng)由生物功能分子如細(xì)胞因子，趨化因子及其類似物控制，它們參與細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。IL-5誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞的分化，存活和脫粒。IL-4誘導(dǎo)B細(xì)胞的活化和IgE的產(chǎn)生。產(chǎn)生的IgE與抗原形成免疫復(fù)合體，導(dǎo)致肥大細(xì)胞的脫粒。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IL-4，IL-13及其類似物也可由肥大細(xì)胞產(chǎn)生，并促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE(Am.J.Respir.Crit.Care Med.，152.2059(1995)，Immunol.Toddy，15，19(1994))。因此，在炎癥細(xì)胞中存在一種錯綜復(fù)雜的細(xì)胞因子-趨化因子網(wǎng)絡(luò)，并保持很復(fù)雜的平衡關(guān)系。
細(xì)胞因子和趨化因子是由在細(xì)胞表面上表達(dá)CD4的輔助性T細(xì)胞(以下稱為“CD4+Th細(xì)胞”)產(chǎn)生的。實際上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)輔助性T細(xì)胞的浸潤可見于支氣管哮喘病人的呼吸道炎癥部位，在外周血中活化的T細(xì)胞也是增加的，呼吸道炎癥部位中相當(dāng)大量的T細(xì)胞是活化的，哮喘病人的嚴(yán)重性和呼吸道高敏感性與活化的T細(xì)胞數(shù)目是相關(guān)的(Am.Rev.Respir.Dis.，145.S22(1992))。
因此根據(jù)產(chǎn)生的細(xì)胞因子的類型，輔助性T細(xì)胞被分為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞(Annu.Rev.Immunol.，7，145(1989))。Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，IL-5，IL-13等。Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子是Th2細(xì)胞因子。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)從異位性疾病病人中分離的抗原特異性T細(xì)胞克隆在體外被刺激時，可釋放Th2細(xì)胞因子(Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，88，4538(1991))，Th2細(xì)胞存在于哮喘病人的支氣管肺泡灌洗液(以下稱為“BAL”)和呼吸道粘膜中(N.Engl.J.Med.，326.298(1992)，Eur.J.Immunol.，23，1445(1993))。當(dāng)采用異位性炎癥動物模型檢測到在BAL中的細(xì)胞有多種細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)時，Th2的細(xì)胞因子IL-4和IL-5的mRNA的表達(dá)水平增加(Clin.Immunol.Immunopathol.，75，75(1995))。當(dāng)Th2細(xì)胞經(jīng)靜脈或鼻內(nèi)給予小鼠時，也可以抗原特異的方式在肺中誘導(dǎo)哮喘性炎癥(J.Exp.Med.，186.1737(1997)，J.Immunol.，160，1378(1998))并觀察到嗜酸性粒細(xì)胞增多(J.Immunol.，161，3128(1998))。在哮喘病人的呼吸道粘膜和異位性皮炎病人的皮膚病變中觀察到IL-5的表達(dá)(J.Clin.Invest.，87，1541(1991)，J.Exp.Med.，173.775(1991))，在慢性過敏性鼻炎的粘膜中IL-5的表達(dá)水平與IL-13的表達(dá)水平，血清總IgE的量和抗原特異性IgE的量相關(guān)(Therapeutics，32，19(1998))。
趨化因子是堿性肝素結(jié)合蛋白的總稱，它可誘導(dǎo)白細(xì)胞的化學(xué)趨化性和活化，根據(jù)在一級結(jié)構(gòu)中半胱氨酸殘基的位置可分為CXC，CC，C和CX3C亞類。至今已經(jīng)確定了趨化因子受體中的16個(Curr.Opl.Immunol.，11，626(1999))，已經(jīng)顯示在白細(xì)胞如Th1細(xì)胞，Th2細(xì)胞及類似細(xì)胞中每種趨化因子受體的表達(dá)都是不同的(Cell Engineering，17，1022(1998))。
人CCR4是7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，從人未成熟嗜堿性細(xì)胞系KU-812中克隆命名為K5-5。CCR4的跨膜區(qū)在氨基酸序列中的是40至67位，78至97位，113至133位，151至175位，207至226位，243至270位和285至308位，細(xì)胞外區(qū)認(rèn)為在氨基酸序列中的是1至39位，98至112位，176至206位，和271至284位，細(xì)胞內(nèi)區(qū)在氨基酸序列中的是68至77位，134至150位，227至242位和309至360位(J.Biol.Chem.，270.19495(1995))。最初，報道CCR4的配體是MIP-1α(巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α)，RANTES(激活時可調(diào)節(jié)的正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子)或MCP-1(單核細(xì)胞趨化蛋白)(Biochem.Biophys.Res.Commun.，218.337(1996)，WO96/23068)。但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)從被刺激的人外周血單核細(xì)胞(以下稱為“PBMC”)和胸腺細(xì)胞(J.Biol.Chem.，271.21514(1996))中產(chǎn)生的TARC(胸腺和活化-調(diào)節(jié)的趨化因子)與CCR4特異性結(jié)合(J.Biol.Chem.，272.15036(1997))。也有報道，從巨噬細(xì)胞中分離的MDC(巨噬細(xì)胞衍生的趨化因子)(J.Exp.Med.，185.1595(1997))，也稱為STCP-1(被刺激的T細(xì)胞趨化蛋白-1)(J.Biol.Chem.，272.25229(1997))，與CCR4的結(jié)合比TARC更強(qiáng)(J.Biol.Chem.，273.1764(1998))。
已經(jīng)顯示CCR4在產(chǎn)生細(xì)胞因子和/或趨化因子的CD4+Th細(xì)胞中表達(dá)(J.Biol.Chem.，272.15036(1997))，有報道CCR4可在CD4+Th細(xì)胞中的Th2細(xì)胞中選擇性地表達(dá)(J.Exp.Med.，187.129(1998)，J.Immunol.，161，5111(1998))。另外，CCR4+細(xì)胞已經(jīng)在效應(yīng)器/記憶T細(xì)胞(CD4+/CD45RO+)中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CCR4+細(xì)胞被刺激時，可產(chǎn)生IL-4和IL-5，但不產(chǎn)生IFN-γ(Int.Immunol.，11，81(1999))。也有報道，CCR4+細(xì)胞屬于記憶T細(xì)胞中的CLA(皮膚淋巴細(xì)胞抗原)陽性和α4β8整合素陰性群，CCR4在記憶T細(xì)胞上表達(dá)，不僅涉及腸道免疫，還涉及皮膚及類似部位的系統(tǒng)免疫(Nature，400.776(1999))。這些結(jié)果強(qiáng)烈的表明當(dāng)炎癥被誘導(dǎo)時，記憶T細(xì)胞被活化，表達(dá)CCR4，通過CCR4的配體MDC和TARC遷移至炎癥部位中，并加速其他炎癥細(xì)胞的活化。
最近已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CCR4也可在人的自然殺傷細(xì)胞(Journal ofImmunology，164.4048-4054(200)，Blood，97，367-375(2001))和血小板(Thrombosis Research，101.279-289(2001)，Blood，96.4046-4054(2000)，Blood，97，937-945(2001))中表達(dá)。
已知作為CCR4的配體TARC或MDC的拮抗劑，稱為CCR4拮抗劑，可抑制血小板的凝集(WO99/15666)。也知道這種調(diào)節(jié)CCR4功能的劑也可影響血小板的功能。
在血小板中發(fā)現(xiàn)了CCR4的表達(dá)。例如，Adrian等人(Blood，97，937-945(2001))和Abi-Younes等人(Thrombosis Research，101，279-289(2001)，WO00/42074，WO00/41724)采用抗CCR4抗體已經(jīng)在人血小板中檢測到CCR4的表達(dá)。至今仍不知道有與CCR4具有反應(yīng)性，但不能結(jié)合人血小板的抗體。
也已經(jīng)知道當(dāng)產(chǎn)生能夠與血小板結(jié)合的自身抗體時，可誘導(dǎo)產(chǎn)生自體免疫性血小板減少(Blood，70，428-431(1987)，Transfusion Science，19，245-251(1998))。能夠影響血小板減少癥和血小板功能的制劑一般不適于用作藥物，因為它們經(jīng)常導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用如出血和血栓形成。特別因為抗體具有很長的血液半衰期，影響血小板功能的抗體很難被開發(fā)為藥物。例如，已經(jīng)被開發(fā)作為治療自體免疫性疾病的制劑的抗CD40配體抗體的開發(fā)已經(jīng)被暫停，因為產(chǎn)生了被認(rèn)為是由于識別活化的血小板上表達(dá)的抗原所致的副作用(Nature Medicine，6,114(2000)，BioCentury，A8 of 18(2002.06.20))。
已知翻譯后蛋白質(zhì)要經(jīng)受多種修飾反應(yīng)。已知的修飾反應(yīng)之一是酪氨酸殘基的硫酸化反應(yīng)。據(jù)報道，許多蛋白質(zhì)在酪氨酸殘基上是硫酸化的(Chemistry and Biology，7，R57-R61(2000))。硫酸化的酪氨酸殘基的特征是在其附近存在許多酸性氨基酸殘基，有硫酸化可能性的蛋白質(zhì)及其區(qū)域已經(jīng)被提出(Cell，96，667-676(1999))。就CCR4而言，緊靠N末端存在4個酪氨酸殘基，但沒有報道顯示這些酪氨酸殘基是硫酸化的。
就目前治療Th2介導(dǎo)的免疫疾病而言，已經(jīng)發(fā)展了下列方法(1)細(xì)胞因子和趨化因子的拮抗劑如人源化抗IL-5抗體(SB-240563SmithKline Beecham，Sch-55700(CDP-835)Shehling Plough/Celltech)，人源化IL-4抗體(美國專利5,914,110)，可溶性趨化因子受體(J.Immunol.，160，624(1998))，等；(2)細(xì)胞因子/趨化因子生成抑制劑如IL-5生成抑制劑(日本已公開的未審查專利申請53355/96號)，視黃醛類似物拮抗劑(WO99/24024)，splatast對甲苯磺酸鹽(splatast tosilate)(IPD-1151T，由Taiho Pharmaceutical生產(chǎn))等；(3)作用于作為最終炎癥細(xì)胞的嗜酸性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞和類似細(xì)胞的制劑，如人源化IL-5受體抗體(WO97/10354)，CC趨化因子受體3(CCR3)拮抗劑(日本已公開的未審查專利申請第147872/99)等；(4)炎性分子抑制劑如人源化抗IgE抗體(Am.J.Respir.Crit.Care Med.，157.1429(1998))等；和類似物質(zhì)。但它們僅抑制細(xì)胞因子，趨化因子和炎性細(xì)胞之間復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的一部分。Th2介導(dǎo)的免疫疾病不會被這些制劑治愈?？笴D4抗體具有調(diào)控T細(xì)胞的活性，對類固醇依賴的嚴(yán)重哮喘有作用。但因為CD4分子在多種免疫細(xì)胞中廣泛地表達(dá)，它們?nèi)狈μ禺愋?，伴隨強(qiáng)烈的免疫抑制效應(yīng)是其不利之處(Int.Arch.Aller.Immunol.，118.133(1999))。
因此，為了避免所有這些問題，需要特異性的控制產(chǎn)生問題的過敏反應(yīng)的上游，主要是Th2細(xì)胞。
現(xiàn)行普遍使用的治療嚴(yán)重的Th2介導(dǎo)的免疫疾病患者的方法是給予類固醇，但類固醇產(chǎn)生的副作用不能避免。而且，其缺點是當(dāng)暫停類固醇的給藥時，每個患者的病情會返回原來的狀態(tài)，當(dāng)長時間使用類固醇會產(chǎn)生耐藥性。
至今，沒有構(gòu)建出能夠檢測CCR4表達(dá)細(xì)胞和對CCR4表達(dá)細(xì)胞也有細(xì)胞毒性的人CDR-移植抗體或其抗體片段。另外，至今也不知道有能夠抑制Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生的治療性制劑。
雖然已經(jīng)有報道，在白血病患者的癌細(xì)胞上也有CCR4的表達(dá)(Blood，96，685(2000))，消滅白血病細(xì)胞的治療性制劑仍不知道。
一般認(rèn)為，當(dāng)來自一種非人動物的抗體，如鼠抗體用于人體時，它被識別為一種外源性物質(zhì)，在人體中誘導(dǎo)對抗鼠抗體的人抗體(人抗鼠抗體；以下稱為“HAMA”)。已知HAMA與給予的鼠抗體發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生副作用(J.Clin.Oncol.，2，881(1984)，Blood，65，1349(1985)，J.Natl.Cancer Inst.，80，932(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82，1242(1985))，加速給予的鼠抗體從機(jī)體的消失(J.Nucl.Med.，26，1011(1985)，Blood，65，1349(1985)，J.Natl.Cancer Inst.，80，937(1988))，降低鼠抗體的治療效果(J.Immunol.，135，1530(1985)，Cancer Res.，46，6489(1986))。
為了解決這些問題，人們已經(jīng)嘗試使用遺傳工程技術(shù)將來自非人動物的抗體轉(zhuǎn)變?yōu)槿薈DR移植抗體。
人CDR移植抗體是一種抗體，其中來自非人動物的抗體可變區(qū)(以下稱為“V區(qū)”)的CDR氨基酸序列被移植到人抗體的合適位置(Nature，321.522(1986))。與來自非人動物的抗體如鼠抗體等比較，這些人CDR移植抗體在對人的臨床應(yīng)用中具有很多優(yōu)勢。例如，據(jù)報道，使用猴，與鼠抗體相比，其免疫原性降低，血液半衰期延長(Cancer Res.，56，1118(1996)，Immunol.，85，668(1995))。因此，可以預(yù)測與來自非人動物的抗體相比，人CDR移植抗體在人體中的副作用較小，治療效應(yīng)可延續(xù)更長的時間。
而且，因為人CDR移植抗體使用遺傳工程技術(shù)制備，可制備許多形式的分子。例如，當(dāng)γ1亞類被用作人抗體的重鏈(以下稱為“H鏈”)恒定區(qū)(以下稱為“C區(qū)”)(H鏈C區(qū)被稱為“CH”)，可制備具有高效應(yīng)器功能，如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用活性(以下稱為“ADCC”)的人源化抗體(Cancer Res.，56，1118(1996))，可預(yù)測與鼠抗體相比，具有延長的血液半衰期(Immunol.，85，668(1995))。同樣，特別是在減少CCR4表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目的治療中，通過抗體的Fc區(qū)(在抗體重鏈內(nèi)，鉸鏈區(qū)之后的區(qū)域)發(fā)揮更高的細(xì)胞毒作用，如補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(以下稱為“CDC活性”)和ADCC活性對于治療效果是很重要的。因此，這些結(jié)果清楚的顯示了人CDR移植抗體優(yōu)選來自非人動物如鼠的抗體。
而且，根據(jù)最近在蛋白質(zhì)工程和遺傳工程方面的進(jìn)展，具有較小分子量的抗體片段如Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，單鏈抗體(以下稱為“scFv”)(Science，242.423(1988))，二聚化V區(qū)片段(以下稱為“微型雙功能抗體(Diabody)”)(Nature Biotechnol.，15，629(1997))，二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)片段(以下稱為”dsFv”)(Molecular Immunol.，32，249(1995))，含有CDR的肽(J.Biol.Chem.，271.2966(1996))及其類似物，可作為人CDR移植抗體被制備。與完整抗體分子相比，抗體片段向靶組織的轉(zhuǎn)移性很好(CancerRes.，52，3402(1992))。
認(rèn)為當(dāng)用于人體臨床應(yīng)用時，這些來自人CDR移植抗體或其抗體片段的片段較那些來自非人動物的抗體如鼠抗體是更期待的。
如上所述，單獨使用人CDR移植抗體或其抗體片段時，可預(yù)測的診斷和治療效應(yīng)，但已經(jīng)嘗試通過聯(lián)合其他分子，以進(jìn)一步提高效果。例如，細(xì)胞因子可用作這種分子之一。細(xì)胞因子是在免疫反應(yīng)中可調(diào)控細(xì)胞間相互作用的多種可溶性因子的總稱。例如，CDC活性和ADCC活性已知是抗體的細(xì)胞毒活性，ADCC活性是由細(xì)胞表面上具有Fc受體的效應(yīng)細(xì)胞如單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，NK細(xì)胞等控制的(J.Immunol.，138.1992(1987))。由于許多細(xì)胞因子可活化這些效應(yīng)細(xì)胞，它們可與抗體聯(lián)合使用以提高抗體的ADCC活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及下面(1)至(59)的內(nèi)容。
(1)一種人CDR移植抗體或其抗體片段，其與人CC趨化因子受體4(CCR4)的胞外區(qū)特異反應(yīng)，但不與人血小板反應(yīng)。
(2)一種人CDR移植抗體或其抗體片段，其與人CC趨化因子受體4(CCR4)的胞外區(qū)特異反應(yīng)，并對CCR4表達(dá)細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性。
(3)根據(jù)(1)的人CDR移植抗體或其抗體片段，其對CCR4表達(dá)細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性。
(4)根據(jù)(1)至(3)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其中所述胞外區(qū)選自SEQ ID NO48所示的氨基酸序列中的1至39，98至112，176至206和271至284位。
(5)根據(jù)(1)至(4)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其中所述胞外區(qū)是SEQ ID NO48所示的氨基酸序列中的2至39位中存在的抗原決定簇。
(6)根據(jù)(1)至(5)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其中所述的細(xì)胞外區(qū)是SEQ ID NO48所示的氨基酸序列中的13至29位點中存在的抗原決定簇。
(7)根據(jù)(1)至(6)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其中所述胞外區(qū)是SEQ ID NO48所示的氨基酸序列中的13至25位中存在的抗原決定簇。
(8)根據(jù)(1)至(7)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其可與CCR4表達(dá)細(xì)胞特異反應(yīng)。
(9)根據(jù)(1)至(8)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其與非人動物雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體相比，對CCR4表達(dá)細(xì)胞具有更高的的細(xì)胞毒活性。
(10)根據(jù)(2)至(9)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其中所述細(xì)胞毒活性是抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)活性。
(11)根據(jù)(10)的人CDR移植抗體或其抗體片段，其中所述ADCC活性是誘導(dǎo)CCR4表達(dá)細(xì)胞凋亡的活性。
(12)根據(jù)(1)至(11)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，具有消滅CCR4表達(dá)細(xì)胞的活性。
(13)根據(jù)(8)至(12)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其中所述CCR4表達(dá)細(xì)胞是Th2細(xì)胞。
(14)根據(jù)(1)至(13)的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其具有抑制Th2細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的活性。
(15)根據(jù)(14)的人CDR移植抗體或其抗體片段，其中所述細(xì)胞因子是IL-4，IL-5或IL-13。
(16)根據(jù)(1)至(15)中任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其屬于人IgG抗體。
(17)根據(jù)(1)至(16)的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗CCR4的單克隆抗體的重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))和輕鏈(L鏈)V區(qū)的互補(bǔ)決定簇(CDR)。
(18)根據(jù)(1)至(17)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗CCR4的單克隆抗體的重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))和輕鏈(L鏈)V區(qū)的互補(bǔ)決定簇(CDR)，以及人抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的框架區(qū)(FR)。
(19)根據(jù)(1)至(18)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗CCR4的單克隆抗體的重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))和輕鏈(L鏈)V區(qū)的互補(bǔ)決定簇(CDRs)，以及人抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的框架區(qū)(FRs)，和人抗體的H鏈恒定區(qū)(C區(qū))和L鏈C區(qū)。
(20)根據(jù)(1)至(19)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其包含具有SEQ ID NOs1，2和3分別所示的氨基酸序列的抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))的互補(bǔ)決定簇(CDR)1，CDR2和CDR3。
(21)根據(jù)(1)至(20)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，包含具有SEQ ID NOs5，6和7分別所示的氨基酸序列的抗體輕鏈(L鏈)可變區(qū)(V區(qū))的互補(bǔ)決定簇(CDR)1，CDR2和CDR3。
(22)根據(jù)(1)至(21)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，包含具有SEQ ID NOs1，2和3分別所示的氨基酸序列的抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))的互補(bǔ)決定簇(CDR)1，CDR2和CDR3和分別具有SEQ ID NO5，6和7所示的氨基酸序列的抗體輕鏈(L鏈)可變區(qū)(V區(qū))的互補(bǔ)決定簇(CDR)1，CDR2和CDR3。
(23)根據(jù)(1)至(22)中任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其包含抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有的氨基酸序列中至少有一個選自SEQ ID NO4所示氨基酸序列中的40位上的Ala，42位上的Gly，43位上的Lys，44位上的Gly，76位上的Lys和97位上的Ala的氨基酸殘基被另一個氨基酸取代。
(24)根據(jù)(1)至(22)中任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其包含抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有的氨基酸序列中，至少一個選自SEQ ID NO38所示氨基酸序列中28位的Thr，和97位的Ala的氨基酸殘基被另一個氨基酸取代。。
(25)根據(jù)(1)至(24)中任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗體輕鏈(L鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有的氨基酸序列中，至少一個選自SEQ ID NO8所示氨基酸序列中2位的Ile，3位的Val，50位的Gln，和88位的Val的氨基酸殘基被另一個氨基酸取代。
(26)根據(jù)(1)至(23)和(25)中任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有的氨基酸序列中，至少一個選自SEQ ID NO4所示氨基酸序列中40位的Ala，42位的Gly，43位的Lys，44位的Gly，76位的Lys和97位的Ala的氨基酸殘基被另一個氨基酸取代；和抗體輕鏈(L鏈)V區(qū)，該區(qū)含有的氨基酸序列中，至少一個選自SEQ ID NO8所示氨基酸序列中2位的Ile，3位的Val，50位的Gln，和88位的Val的氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代。
(27)根據(jù)(1)至(22)，(24)和(25)中任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有的氨基酸序列中，至少一個選自SEQ ID NO38所示氨基酸序列中28位的Thr，和97位的Ala的氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代；和抗體輕鏈(L鏈)V區(qū)，該區(qū)含有的氨基酸序列中，至少一個選自SEQ ID NO8所示氨基酸序列中2位的Ile，3位的Val，50位的Gln，和88位的Val的氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代。
(28)根據(jù)(1)至(22)和(25)中任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，包含抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))，含有SEQ ID NO4，9，10，11，38，39，40或41所示的氨基酸序列。
(29)根據(jù)(1)至(24)和(28)中任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其包含抗體輕鏈(L鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有SEQ ID NO8，12，13或14所示的氨基酸序列。
(30)根據(jù)(1)至(22)中任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其包含抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有SEQ ID NO4，9，10，11，38，39，40或41所示的氨基酸序列；和抗體輕鏈(L鏈)可變區(qū)(V區(qū))，含有SEQ ID NO8，12，13或14所示的氨基酸序列。
(31)根據(jù)(1)至(22)中任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其包含抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有SEQ ID NO9或10所示的氨基酸序列；和抗體輕鏈(L鏈)可變區(qū)(V區(qū))，含有SEQ ID NO14所示的氨基酸序列。
(32)根據(jù)(1)至(31)中任何一項的抗體片段，其中所述抗體片段是選自Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，單鏈抗體(scFv)，二聚化可變區(qū)(V區(qū))片段(微型雙功能抗體)，二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)片段(dsFv)和含有互補(bǔ)決定簇(CDR)的肽的抗體片斷。
(33)一種由轉(zhuǎn)化體KM8759(FERM BP-8129)或KM8760(FERMBP-8130)產(chǎn)生的人CDR移植抗體或其抗體片段。
(34)產(chǎn)生根據(jù)(1)至(33)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段的轉(zhuǎn)化體。
(35)根據(jù)(34)中的轉(zhuǎn)化體，其中轉(zhuǎn)所述化體是KM8759(FERMBP-8129)或KM8760(FERM BP-8130)。
(36)一種用于產(chǎn)生能夠產(chǎn)生根據(jù)(1)至(33)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段的轉(zhuǎn)化體的的轉(zhuǎn)化體方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)(34)或(35)的轉(zhuǎn)化體，以在培養(yǎng)物中形成和累積人CDR移植抗體或其抗體片段；從培養(yǎng)物中回收抗體或抗體片段。
(37)一種人CDR移植抗體或其抗體片段，其中根據(jù)(1)至(33)中的任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段與放射性同位素，蛋白質(zhì)或制劑化學(xué)的或遺傳性的連接在一起。
(38)一種編碼(1)至(33)中任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段的DNA。
(39)一種含有(38)中DNA的重組載體。
(40)一種將(39)的重組載體導(dǎo)入進(jìn)宿主細(xì)胞而獲得的轉(zhuǎn)化體。
(41)一種藥物，含有選自(1)至(33)和(37)中任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段中的至少一種作為活性成分。
(42)治療CCR4相關(guān)疾病的治療劑，其含有選自(1)至(33)和(37)中任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段中的至少一種作為活性成分。
(43)根據(jù)(42)的治療劑，其中所述CCR4相關(guān)的疾病是癌癥或炎性疾病。
(44)根據(jù)(43)的治療劑，其中所述的癌癥是血癌。
(45)根據(jù)(44)的治療劑，其中所述的血癌是白血病或淋巴瘤病。
(46)根據(jù)(43)的治療劑，其中所述的炎性疾病是急性或慢性呼吸道超敏性或支氣管哮喘，異位性皮膚病，過敏性鼻炎或花粉病。
(47)一種CCR4相關(guān)疾病的診斷試劑，含有選自(1)至(33)和(37)中任何一項的人CDR移植抗體及其抗體片段中的至少一種作為活性成分。
(48)根據(jù)(47)中的診斷試劑，其中所述的CCR4相關(guān)疾病是癌癥或炎性疾病。
(49)根據(jù)(48)中的診斷試劑，其中所述的癌癥是血癌。
(50)根據(jù)(48)中的診斷試劑，其中所述的血癌是白血病或淋巴瘤病。
(51)根據(jù)(48)中的診斷試劑，其中所述的炎性疾病是慢性呼吸道超敏性哮喘、支氣管哮喘、異位性皮膚病、過敏性鼻炎或花粉病。
(52)一種治療Th2介導(dǎo)的免疫疾病的治療性制劑，含有選自(1)至(33)和(37)中任何一項的人CDR移植抗體及其抗體片段中的至少一種作為活性成分。
(53)根據(jù)(52)中的治療性制劑，其中所述的Th2介導(dǎo)的免疫疾病是慢性呼吸道超敏性哮喘，異位性皮膚病，過敏性鼻炎或花粉病。
(54)一種Th2介導(dǎo)的免疫疾病的診斷試劑，含有選自(1)至(33)和(37)中任何一項的人CDR移植抗體及其抗體片段中的至少一種作為活性成分。
(55)根據(jù)(54)中的診斷試劑，其中所述Th2介導(dǎo)的免疫疾病是慢性呼吸道超敏性哮喘、異位性皮膚病、過敏性鼻炎或花粉病。
(56)一種免疫學(xué)檢測CCR4的方法，該方法使用(1)至(33)和(37)任何一項的人CDR移植抗體及其抗體片段。
(57)一種免疫學(xué)檢測細(xì)胞表面CCR4表達(dá)細(xì)胞的方法，其包括使用(1)至(33)和(37)任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段。
(58)一種減少或除去細(xì)胞表面CCR4表達(dá)細(xì)胞的方法，其包括使用使用(1)至(33)和(37)任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段。
(59)一種抑制Th2細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的方法，該方法包括使用(1)至(33)和(37)中任何一項的人CDR移植抗體或其抗體片段。
在本發(fā)明中，CCR4相關(guān)疾病包括癌癥，炎性疾病和類似疾病。
在本發(fā)明中，癌癥包括血癌，特別是白血病，淋巴瘤病和類似疾病。
在本發(fā)明中，炎性疾病包括急性或慢性呼吸道超敏性或支氣管哮喘，異位性皮膚病如異位性皮炎；過敏性鼻炎；花粉?。缓皖愃萍膊?。
在本發(fā)明中，Th2介導(dǎo)的免疫疾病可以是與Th2細(xì)胞相關(guān)的免疫疾病，包括急性或慢性呼吸道超敏性或支氣管哮喘；異位性皮膚病如異位性皮炎；過敏性鼻炎；花粉?。婚g質(zhì)性肺炎；肺纖維化；自體免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡；和類似疾病。
本發(fā)明的與CCR4特異反應(yīng)的人CDR移植抗體(抗CCR4 CDR移植抗體)及其抗體片段(以下，在某些情況中兩者一般都是指本發(fā)明的抗體)是沒有限制的，只要它是能與人CCR4的胞外區(qū)特異反應(yīng)，但不與人血小板反應(yīng)的人CDR移植抗體或其抗體片段。術(shù)語“不能與人血小板反應(yīng)”的含義是抗體顯示與人血小板基本上沒有結(jié)合作用。具體的是，它意味著當(dāng)通過流式細(xì)胞儀檢測時，不顯示結(jié)合活性。
同樣，本發(fā)明的抗體能特異的與人CCR4的胞外區(qū)反應(yīng)，并對CCR4表達(dá)細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性。
細(xì)胞毒活性包括CDC活性和ADCC活性。
本發(fā)明的抗體也包括優(yōu)選與下述區(qū)域特異反應(yīng)的抗體，該區(qū)域包括SEQ ID NO48所示的氨基酸序列中1至39位，98至112位，176至206位或271至284位，更優(yōu)選的區(qū)域是SEQ ID NO48(SEQ ID NO36)所示的氨基酸序列中2至29位的區(qū)域，更優(yōu)選的是SEQ ID NO48(SEQ IDNO37)所示的氨基酸序列中的12至29位的區(qū)域，最優(yōu)選的是SEQ IDNO48所示的氨基酸序列中12至25位的區(qū)域。
人CDR移植抗體代表的抗體中，來源于非人動物的抗體中VH和VL的CDR氨基酸序列被移植至人抗體的VH和VL的合適位置。
本發(fā)明的人CDR移植抗體的產(chǎn)生可通過構(gòu)建編碼V區(qū)的cDNA，其中與CCR4特異反應(yīng)，來源于非人動物的抗體中的VH和VL的CDR氨基酸序列被移植至人抗體的VH和VL的FR上，將它們分別插入到動物細(xì)胞的表達(dá)載體中以構(gòu)建人CDR移植抗體的表達(dá)載體，然后將其導(dǎo)入至動物細(xì)胞中以表達(dá)人CDR移植抗體，所述動物的表達(dá)載體含有編碼人抗體的CH和H鏈C區(qū)(以下稱為“CL”)的DNA。
作為選擇人抗體的VH和VL的FR氨基酸序列的方法，可以使用任何方法，只要它們來自人抗體。實例包括在數(shù)據(jù)庫如蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和類似數(shù)據(jù)庫中登記的人抗體中VH和VL的FR氨基酸序列，或人抗體中VH和VL的每個亞組FR中通用的氨基酸序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Dep.Health and Human Services，1991)。
在本發(fā)明的抗體中的任何CH可用，只要它屬于人免疫球蛋白(以下稱為″hIg″)。優(yōu)選地，可以使用hIgG類，和屬于hIgG類的γ1，γ2，γ3和γ4亞類中的任何一種。也可使用人CDR移植抗體中的任何CL，只要它屬于hIg，可使用κ類或λ類。
本發(fā)明的抗體包括的人CDR移植抗體或其抗體片段，包含分別含有SEQ ID NOs1，2和3表示的氨基酸序列的人抗體的HV CDR1，CDR2和CDR3，和/或分別含有SEQ ID NOs5，6和7表示的氨基酸序列的VL的CDR1，CDR2和CDR3。
優(yōu)選的實例包括人CDR移植抗體，其中所述抗體中的VH包括SEQID NO4或38所示的氨基酸序列，和/或VL包括SEQ ID NO8所示的氨基酸序列。
更優(yōu)選的實例包括一種人CDR移植抗體，包含抗體的VH，所述抗體包含氨基酸序列，其中至少有一個氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代，該殘基選自SEQ ID NO4所示氨基酸序列中40位的Ala，42位的Gly，43位的Lys，44位的Gly，76位的Lys和97位的Ala，一種人CDR移植抗體，包含抗體的VH，所述抗體包含氨基酸序列，其中至少有一個氨基酸殘基被另一氨基酸殘基取代，該殘基選自SEQID NO38所示氨基酸序列中28位的Thr和位點97位中的Ala，一種人CDR移植抗體，包含抗體的VL，所述抗體包含氨基酸序列，其中至少有一個氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代，該殘基選自SEQ ID NO8所示氨基酸序列中位2的Ile，3位的Val，50位的Gln和88位的Val，一種人CDR移植抗體，包含抗體的VH和抗體的VL，所述抗體的VH包含氨基酸序列，其中至少有一個氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代，該殘基選自SEQ ID NO4所示氨基酸序列中40位的Ala，42位的Gly，43位的Lys，44位的Gly，76位的Lys和97位的Ala；所述抗體的VL包含氨基酸序列，其中至少有一個氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代，該殘基選自SEQ ID NO8所示氨基酸序列中2位的Ile，3位的Val，50位的Gln和88位的Val，一種人CDR移植抗體，包含抗體的VH和抗體的VL，所述抗體的VH包含氨基酸序列，其中至少有一個氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代，該殘基選自SEQ ID NO38所示氨基酸序列中28位的Thr和97位的Ala；所述抗體的VL包含氨基酸序列，其中至少有一個氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代，該殘基選自SEQ ID NO8所示氨基酸序列中2位的Ile，3位的Val，50位的Gln和88位的Val及其類似物。
本發(fā)明包括抗體及其抗體片段，該抗體所包含的氨基酸序列中，一個或多個氨基酸被刪除，取代，插入或添加，并如上所述特異的與CCR4反應(yīng)。
在本發(fā)明中，氨基酸序列中的缺失，取代，插入或添加一個或多個氨基酸的含義是在氨基酸序列中的一個或多個位點上，一個或多個氨基酸被缺失，取代，插入和/或添加。在同一個氨基酸序列中可同時發(fā)生缺失，取代，插入和/或添加。同樣，氨基酸殘基的取代，插入或添加可以是天然的或非天然的。天然的氨基酸殘基包括L-丙氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-谷氨酰胺，L-谷氨酸，甘氨酸，L-組氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-賴氨酸，L-蛋氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-纈氨酸，L-半胱氨酸及其類似物。
以下顯示了相互取代的氨基酸殘基的優(yōu)選實例。同組內(nèi)的氨基酸殘基可相互取代。
A組亮氨酸，異亮氨酸，正亮氨酸，纈氨酸，正纈氨酸，丙氨酸，2-氨基丁酸，蛋氨酸，O-甲基絲氨酸，叔-丁基甘氨酸，叔-丁基丙氨酸，環(huán)己基丙氨酸；B組天冬氨酸，谷氨酸，異天冬氨酸，異谷氨酸，2-氨基己二酸，2-氨基辛二酸；
C組天冬酰胺，谷氨酰胺；D組賴氨酸，精氨酸，鳥氨酸，2，4-二氨基丁酸，2，3-二氨基丙酸；E組脯氨酸，3-羥脯氨酸，4-羥脯氨酸；F組絲氨酸，蘇氨酸，高絲氨酸；G組苯丙氨酸，酪氨酸。
本發(fā)明的抗體片段包括Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，scFv，微型雙功能抗體，dsFv，含有CDR的肽及其類似物。
Fab是具有大約50,000分子量和抗原結(jié)合活性的抗體片段，其中用蛋白酶，即木瓜蛋白酶(在H鏈的224位上的氨基酸殘基切開)處理IgG獲得的片段中的H鏈N-端側(cè)鏈的大約一半和整個L鏈通過二硫鍵結(jié)合在一起。
本發(fā)明的Fab可通過用蛋白酶，即木瓜蛋白酶處理能與CCR4特異反應(yīng)的本發(fā)明的人CDR移植抗體獲得。Fab的產(chǎn)生也可通過將編碼抗體Fab的DNA插入進(jìn)一個原核細(xì)胞表達(dá)載體或真核細(xì)胞表達(dá)載體中，并將該載體導(dǎo)入原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)Fab。
F(ab′)2是具有大約100,000分子量和抗原結(jié)合活性的抗體片段，其稍大于在用蛋白酶，即木瓜蛋白酶處理IgG獲得的片段通過鉸鏈區(qū)的二硫鍵結(jié)合的Fab。
本發(fā)明的F(ab′)2可通過用蛋白酶，即木瓜蛋白酶處理能與CCR4特異反應(yīng)的本發(fā)明的人CDR移植抗體獲得。F(ab′)2也可通過一個硫醚鍵或二硫鍵通過結(jié)合如下所述的Fab′而產(chǎn)生。
Fab′是具有大約50,000分子量和抗原結(jié)合活性的抗體片段，其可通過切開F(ab′)2鉸鏈區(qū)的二硫鍵而獲得。
本發(fā)明的Fab′可通過用一種還原劑，二硫蘇糖醇處理能與本發(fā)明的CCR4特異反應(yīng)的F(ab′)2而獲得。Fab′的產(chǎn)生也可通過將編碼與CCR4特異反應(yīng)的本發(fā)明的人CDR移植抗體的Fab′的DNA插入原核細(xì)胞表達(dá)載體或真核細(xì)胞表達(dá)載體中，并將該載體導(dǎo)入原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中以表達(dá)Fab′。
scFv是一種VH-P-VL或VL-P-VH多肽，其中一個鏈VH和一個鏈VL采用12個或更多個殘基的合適肽連接子(P)來連接，并具有抗原結(jié)合活性。
本發(fā)明的scFv的產(chǎn)生可通過獲取編碼本發(fā)明的能與CCR4特異反應(yīng)的人CDR移植抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA，將此DNA插入進(jìn)原核細(xì)胞表達(dá)載體或真核細(xì)胞表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體導(dǎo)入原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)scFv。
微型雙功能抗體是一種抗體片段，其中具有相同或不同抗原結(jié)合特異性的scFv形成二聚體，對相同的抗原具有二價的抗原結(jié)合活性或?qū)Σ煌目乖哂袃煞N特異的抗原結(jié)合活性。
本發(fā)明的微型雙功能抗體，例如可與CCR4特異反應(yīng)的二價微型雙功能抗體的產(chǎn)生可通過獲取編碼與CCR4特異反應(yīng)的抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼具有3至10個殘基的肽連接子的scFv的DNA，將DNA插入進(jìn)一個原核細(xì)胞表達(dá)載體或真核細(xì)胞表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體導(dǎo)入進(jìn)一種原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中以表達(dá)微型雙功能抗體。
dsFV通過半胱氨酸殘基之間的二硫鍵結(jié)合多肽獲得，其中每個VH和VL中的一個氨基酸殘基被一個半胱氨酸取代。被半胱氨酸殘基取代的氨基酸殘基可按照Reiter等人所提出的方法，根據(jù)抗體的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測來選擇(Protein Engineering，7，697(1994))。
本發(fā)明的dsFv的產(chǎn)生可通過獲取編碼本發(fā)明的與CCR4特異反應(yīng)的人CDR移植抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼dsFv的DNA，將DNA插入進(jìn)原核細(xì)胞表達(dá)載體或真核細(xì)胞表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體導(dǎo)入原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中以表達(dá)dsFv。
含有CDR的肽由包含H鏈的至少一個區(qū)和L鏈CDR構(gòu)建。多個CDR可直接結(jié)合或通過合適的肽連接子結(jié)合。
本發(fā)明的含有CDR的肽可通過下述方法產(chǎn)生獲取編碼與CCR4特異反應(yīng)的人CDR移植抗體的VH和VL的CDR的cDNA，構(gòu)建編碼CDR的DNA，將DNA插入原核細(xì)胞表達(dá)載體或真核細(xì)胞表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體導(dǎo)入原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中以表達(dá)肽。含有CDR的肽也可通過化學(xué)合成的方法如Fmoc法(芴醇甲氧羰基法)，tBoc法(叔-丁氧基羰基法)或類似方法產(chǎn)生。
本發(fā)明的抗體包括抗體衍生物，其中放射性同位素、蛋白質(zhì)、制劑及其類似物與本發(fā)明的抗體化學(xué)性連接或遺傳性連接在一起。
本發(fā)明的抗體衍生物的產(chǎn)生可通過將放射性同位素、蛋白質(zhì)或試劑化學(xué)性連接至能與CCR4特異反應(yīng)的抗體或抗體片段的H鏈或L鏈的N末端側(cè)鏈或C末端側(cè)鏈，抗體或抗體片段的一個適合的取代基團(tuán)或側(cè)鏈，或抗體或抗體片段中的糖鏈上(抗體工程手冊(Antibody EngineeringHandbook)，Osamu Kanemitsu主編，Chijin Shokan出版(1994))。
也可通過遺傳工程產(chǎn)生，通過將編碼本發(fā)明的能與CCR4特異反應(yīng)的抗體或抗體片段的DNA與編碼待結(jié)合的蛋白質(zhì)的其他DNA連接起來，將DNA插入至表達(dá)載體中，并將表達(dá)載體導(dǎo)入進(jìn)宿主細(xì)胞中。
放射性同位素包括131I，125I及其類似物，它可通過如氯胺T法與抗體連接。
制劑優(yōu)選是低分子量的化合物。實例包括抗癌制劑如烷化劑(如，氮芥，環(huán)磷酰胺)，代謝拮抗劑(如，5-氟尿嘧啶，氨甲喋呤)，抗生素(如，道諾霉素，博來霉素，絲裂霉素C，道諾紅霉素，阿霉素)，植物生物堿(如，長春花新堿，長春花堿，長春地辛)，激素藥物(如，三苯氧胺，地塞米松)等(臨床腫瘤學(xué)(Clinical Oncology)，日本臨床腫瘤學(xué)會主編，Cancer and Chemotherapy出版(1996))；抗炎劑如類固醇制劑(如，氫化可的松，強(qiáng)的松)，非類固醇藥物(如，阿司匹林，吲哚美辛)，免疫調(diào)節(jié)劑(如，硫代蘋果酸亞金，青霉胺)，免疫抑制劑(如，環(huán)磷酰胺，硫唑嘌呤)和抗組胺劑(如，氯苯吡胺馬來酸鹽，氯馬斯丁)(炎癥和抗炎治療(Inflammation and Antiinflammatory)，Ishiyaku Shuppan(1982))；和類似藥物。將道諾霉素與抗體結(jié)合的方法包括道諾霉素和抗體的氨基通過戊二醛連接(conjugate)的方法，道諾霉素的氨基與抗體的羧基通過水溶性碳化二亞胺連接的方法等。
蛋白質(zhì)優(yōu)選是可活化免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子。實例包括人白介素2(以后稱為″hIL-2″)，人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(以后稱為″hGM-CSF″)，人巨噬細(xì)胞集落刺激因子(此后稱為″hM-CSF″)，人白介素12(此后稱為″hIL-12″)等。為了直接抑制癌細(xì)胞，也可使用如蓖麻蛋白，白喉毒素等毒素。例如，產(chǎn)生與蛋白質(zhì)融合的抗體，可通過將編碼抗體或抗體片段的cDNA與編碼蛋白質(zhì)的其他cDNA連接在一起，構(gòu)建編碼融合抗體的DNA，將DNA插入原核細(xì)胞的表達(dá)載體或真核細(xì)胞的表達(dá)載體，然后將其導(dǎo)入原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中以表達(dá)此融合抗體。
產(chǎn)生人CDR移植抗體及其與CCR4特異反應(yīng)的抗體片段的方法，評價其活性的方法和應(yīng)用它們的方法解釋如下。
1.制備人CDR移植抗體(1)構(gòu)建人源化抗體表達(dá)載體人源化抗體表達(dá)載體是動物細(xì)胞的表達(dá)載體，其中編碼人抗體的CH和CL的基因已經(jīng)被插入，通過將人抗體的每一個CH和CL克隆進(jìn)動物細(xì)胞的表達(dá)載體中而構(gòu)建。
人抗體的C區(qū)是任何人抗體的CH和CL。實例包括人抗體γ亞類的CH和κ類的CL及其類似物。也可使用cDNA。作為動物細(xì)胞的表達(dá)載體，可使用任何表達(dá)載體，只要能插入和表達(dá)人抗體的C區(qū)。實例包括pAGE107(Cytotechnology，3，133(1990))，pAGE103(J.Biochem.，101.1307(1987))，pHSG274(Gene，27，223(1984))，pKCR(Proc.Natl.AcadSci.USA，78，1527(1981))，pSGIβd2-4(Cytofechnology，4，173(1990))，pSE1UK1Sed1-3(Cytotechnol，13，79 1993))等。用于動物細(xì)胞表達(dá)載體的啟動子和增強(qiáng)子包括SV40早期啟動子和增強(qiáng)子(J.Biochem.，101.1307(1987))，莫洛尼鼠白血病病毒LTR啟動子和增強(qiáng)子(Biochem.Biophys.Res.Comun.，149，960(1987))，免疫球蛋白H鏈啟動子(Cell，41，479(1985))和增強(qiáng)子(Cell，33，717(1983))等。
人源化抗體表達(dá)載體可以是編碼抗體的H鏈的基因和編碼抗體的L鏈的基因存在于不同的載體上，或是兩個基因存在于同一個載體(串聯(lián)式)的類型。考慮到構(gòu)建人源化抗體表達(dá)載體的易行性，導(dǎo)入動物細(xì)胞的易行性，和抗體的H和L鏈在動物細(xì)胞中表達(dá)量之間的平衡，更優(yōu)選串聯(lián)式的人源化抗體表達(dá)載體(J.Immunol.Methods，167.271(1994))。串聯(lián)式的人源化抗體表達(dá)載體包括pKANTEX93(WO97/10354)，pEE18(HYBRIDOMA.17，559(1998))等。
構(gòu)建的人源化抗體表達(dá)載體可用于在動物細(xì)胞中表達(dá)人CDR移植抗體。
(2)構(gòu)建編碼人CDR移植抗體V區(qū)的cDNA編碼人CDR移植抗體的VH和VL的cDNA可如下獲得。首先，選擇將來自非人動物的抗體的VH和VL中CDR的氨基酸序列移植到人抗體的VH和VL中FR的氨基酸序列。可使用人抗體的VH和VL中FR的任何氨基酸序列，只要它們來自人體。實例包括在數(shù)據(jù)庫如蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫及其類似數(shù)據(jù)庫中登記的人抗體的VH和VL中FR的氨基酸序列，以及人抗體的VH和VL中FR的亞類通用的氨基酸序列(，US Dept.Health andHuman Services(1991))等。為了產(chǎn)生具有有效活性的人CDR移植抗體，優(yōu)選選擇與來自非人動物的靶抗體的VH和VL中FR的氨基酸序列具有高度同源性(至少60％或更高)的氨基酸序列。
然后，來自非人動物的抗體的VH和VL中CDR的氨基酸序列被移植至選擇的人抗體的VH和VL中FR的氨基酸序列上，來設(shè)計人CDR移植抗體的VH和VL的氨基酸序列?？紤]到在抗體基因的核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)的密碼子使用的頻率，將設(shè)計的氨基酸序列轉(zhuǎn)換為DNA序列(Sequenceof Proteins of Immunological Interest，US Dept.Health and HumanServices(1991))，設(shè)計編碼人CDR移植抗體的VH和VL的氨基酸序列的DNA序列。合成幾個具有大約100至200個核苷酸長度的合成DNA，使用它們來進(jìn)行PCR。在這種情況下，根據(jù)PCR的反應(yīng)效率和可以被合成的DNA的長度，優(yōu)選每個VH和VL中設(shè)計4或6個合成DNA。而且，它們很容易通過在合成DNA的兩個末端上的5’末端引入適當(dāng)?shù)南拗菩悦傅淖R別序列，克隆到第1(1)中構(gòu)建的人源化抗體表達(dá)載體中。PCR后，擴(kuò)增產(chǎn)物被克隆進(jìn)質(zhì)粒中，如pBluescript SK(-)(Stratagene制造)等，確定核苷酸序列，獲得具有編碼設(shè)計的人CDR移植抗體的VH和VL的DNA序列的質(zhì)粒。
(3)修飾人CDR移植抗體V區(qū)氨基酸序列已知當(dāng)簡單的僅僅將來自非人動物的抗體的VH和VL的CDR移植至人抗體的VH和VL中的FR中，產(chǎn)生人CDR移植抗體時，其抗原結(jié)合活性低于來自非人動物的原始抗體(BIO/TECHNOLOGY，9，266(1991))。正是這個原因，要考慮不但在CDR，而且在FR中的幾個氨基酸殘基直接或間接涉及來自非人動物原始抗體的VH和VL的抗原結(jié)合活性，且它們變成在人抗體的VH和VL中不同的FR中的不同的氨基酸殘基。為了解決這個問題，在人CDR移植抗體中，在人抗體的VH和VL中FR的氨基酸序列中，通過與CDR中的氨基酸殘基相互作用，或通過維持抗體的三維結(jié)構(gòu)直接涉及與抗原結(jié)合的氨基酸殘基，或間接涉及與抗原結(jié)合的氨基酸殘基被鑒定和修飾為在原始的非人動物抗體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基，以便增加被降低的抗原結(jié)合活性(BIG/TECHNOLOGY，9，266(1991))。在人CDR移植抗體的產(chǎn)生過程中，如何有效的鑒定與FR中抗原結(jié)合活性有關(guān)的氨基酸殘基是最重要的，所以通過X-線結(jié)晶學(xué)(J.Mol.Biol.，112，535(1977))，計算機(jī)建模(Protein Engineering，7，1501(1994))或類似方法構(gòu)建和分析抗體的三維結(jié)構(gòu)。盡管抗體的三維結(jié)構(gòu)在產(chǎn)生人CDR移植抗體時是有用的，但仍然沒有建立產(chǎn)生可應(yīng)用于任何抗體的人CDR移植抗體的方法。因此，現(xiàn)在必須進(jìn)行多種嘗試，例如產(chǎn)生每種抗體的幾個修飾抗體，檢測每個修飾抗體之間的關(guān)系和其抗體結(jié)合活性。
根據(jù)PCR，采用多種用于修飾的合成DNA可完成對人抗體的VH和VL中FR的選定的氨基酸序列的修飾。關(guān)于通過PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，依照在第1(2)項中描述的方法確定核苷酸序列，以便證實是否已經(jīng)進(jìn)行了目的性修飾。
(4)構(gòu)建人CDR移植抗體的表達(dá)載體人CDR移植抗體的表達(dá)載體的構(gòu)建可通過將編碼第1(2)項和1(3)項中構(gòu)建的人CDR移植抗體的VH和VL的cDNA克隆到編碼第1(1)項中所述的人源化抗體表達(dá)載體中人抗體的VH和VL的基因上游。例如，當(dāng)適當(dāng)?shù)南拗菩悦傅淖R別位點被導(dǎo)入合成DNA兩端的5’末端時(此合成DNA用于第1(2)項和(3)項中構(gòu)建的人CDR移植抗體的VH和VL)，可進(jìn)行克隆，因此它們在人抗體的CH和CL的基因上游，在如第1(1)項中所述的人源化抗體表達(dá)載體中以合適的形式表達(dá)。
(5)人CDR移植抗體的瞬時表達(dá)為了有效的評價產(chǎn)生的多種人CDR移植抗體的抗原結(jié)合活性，用第1(4)中所述的人CDR移植抗體的表達(dá)載體或其修飾的表達(dá)載體瞬時表達(dá)人CDR移植抗體。任何細(xì)胞可用作宿主細(xì)胞，只要宿主細(xì)胞可表達(dá)人CDR移植抗體。通常，考慮到其高表達(dá)量可使用COS-7細(xì)胞(ATCCCRL1651)(Methods in Nucleic Acids Res.，CRC Press，p.283(1991))。將表達(dá)載體導(dǎo)入進(jìn)COS-7細(xì)胞中的方法包括DEAE-葡聚糖法(Methods inNucleic Acids Res.，CRC印刷，p.283(1991))，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987))及其類似方法。
導(dǎo)入表達(dá)載體后，在培養(yǎng)上清液中人CDR移植抗體的表達(dá)量和抗原結(jié)合活性可通過酶免疫試驗(ELISA)來確定；抗體(Antibody)實驗室手冊(A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，第14章(1988)，單克隆抗體(Monoclonal Antibodies)理論和實踐(Principlesand Practice)，Academic Press Limited(1996))等。
(6)穩(wěn)定的表達(dá)人CDR移植抗體穩(wěn)定地產(chǎn)生人CDR移植抗體的轉(zhuǎn)化體可通過將在第1(4)項中所述的人CDR移植抗體的表達(dá)載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中而獲得。
將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的方法包括電穿孔(Cytotechnology，3，133(1990))等。
任何細(xì)胞可用作宿主細(xì)胞，導(dǎo)入人CDR移植抗體的表達(dá)載體，只要它表達(dá)人CDR移植抗體。實例包括鼠SP2/0-Agl4細(xì)胞(ATCCCRL1581)，鼠P3X63-Ag8.653細(xì)胞(ATCC CRL1580)，可檢測到二氫葉酸還原酶(defr)基因的CHO細(xì)胞(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77，4216(1980))，大鼠YB2/3HL.P2.G11.16 Ag.20細(xì)胞(YB2/0細(xì)胞；ATCCCRL1662)等。
導(dǎo)入表達(dá)載體后，通過在含有制劑如G418硫酸鹽(G418；Sigma生產(chǎn))或類似物(J.Immuol.Methods，167.271(1994))的動物細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選擇穩(wěn)定表達(dá)人CDR移植抗體的轉(zhuǎn)化體。動物細(xì)胞培養(yǎng)基包括PRMI1640培養(yǎng)基(Nissui Pharmaceutical生產(chǎn))，GIT培養(yǎng)基(NissuiPharmaceutical生產(chǎn))，EX-CELL302培養(yǎng)基(JRH生產(chǎn))，IMDM培養(yǎng)基(GEBCO BRL生產(chǎn))，雜交瘤-SFM培養(yǎng)基(GIBCO BRL生產(chǎn))，通過添加多種添加物如FBS至這些培養(yǎng)基中獲得的培養(yǎng)基及其類似培養(yǎng)基。通過將選擇出的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在培養(yǎng)基中可在培養(yǎng)基中，產(chǎn)生或累積人CDR移植抗體。在培養(yǎng)上清液中人源化抗體的表達(dá)量和抗原結(jié)合活性可通過ELISA或類似方法測定。同樣，在轉(zhuǎn)化體中，人CDR移植抗體的表達(dá)量可通過使用dhfr擴(kuò)增系統(tǒng)等來增加(J.Immuol.Methods，167.271(1994))。
人CDR移植抗體可通過蛋白A柱從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清液中純化(抗體(Antibody)實驗室手冊(A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory，第8章(1988)，單克隆抗體(Monoclonal Antibodies)原理和實踐(Principles and Practice)，Academic Press Limited(1996))?？墒褂萌魏纬Ｒ?guī)的蛋白質(zhì)純化方法。例如，可通過凝膠過濾，離子交換層析，超濾等的組合純化人源化抗體。純化的人源化抗體或抗體分子的H鏈或L鏈的或整個抗體分子分子量可通過聚丙烯凝膠電泳等來確定(SDS-PAGE；Nature，227，680(1970))，Western印跡(抗體(Antibody)實驗室手冊(A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，第12章(1988)，單克隆抗體(Monoclonal Antibodies)原理和實踐(Principlesand Practice)，Academic Press Limited(1996))。
2.制備抗體片段根據(jù)在第1項中所述的人源化抗體，采用遺傳工程或蛋白質(zhì)工程制備抗體片段?？贵w片段包括Fab，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)ab′，sdFv，微型雙功能抗體，dsFv，含有CDR的肽及其類似物。
(1)制備FabFab可通過用蛋白水解酶木瓜蛋白酶處理IgG而制備。在木瓜蛋白酶處理后，當(dāng)原始抗體是具有蛋白A結(jié)合活性的IgG亞型時，通過經(jīng)過蛋白A柱，從IgG分子和Fc片段中分離Fab，回收均一的Fab(單克隆抗體(Monoclonal Antibodies)原理和實踐(Principles and Practice)，第三版(1995))。當(dāng)原始抗體是沒有蛋白A活性的IgG亞型時，F(xiàn)ab可通過在離子交換層析，低鹽濃度下分布洗脫回收(單克隆抗體(MonoclonalAntibodies)原理和實踐(Principles and Practice)第三版(1995))。另外，F(xiàn)ab也可通過遺傳工程技術(shù)使用大腸桿菌來制備。例如，F(xiàn)ab表達(dá)載體可通過將在第1(2)和1(3)項中所述的編碼抗體V區(qū)的DNA克隆進(jìn)Fab表達(dá)載體中而制備。作為Fab表達(dá)載體，可使用任何載體，只要Fab的DNA能被插入和表達(dá)。實例包括pITl06(Science，240，1041(1988))及其類似物。通過將Fab表達(dá)載體導(dǎo)入合適的大腸桿菌中，F(xiàn)ab可在包涵體或胞質(zhì)間隙中形成和積累。通過常用于蛋白質(zhì)的重折疊方法從包涵體中獲得有活性的Fab，當(dāng)它在胞質(zhì)間隙中表達(dá)時，活性的Fab漏入培養(yǎng)上清液中。均一的Fab可在重折疊后純化或從培養(yǎng)上清液中采用抗體接合柱純化(抗體工程(Antibody Engineering)，實踐指南(A Practical Guide)，W.H.Freeman和Company(1992))。
(2)制備F(ab′)2F(ab′)2可通過用蛋白水解酶木瓜蛋白酶處理IgG而制備。在木瓜蛋白酶處理后，通過類似于Fab情形的純化方法回收均一的F(ab′)2(單克隆抗體(Monoclonal Antibodies)原理和實踐(Principles and Practice)，第三版，Academic Press(1995))。另外，也可通過第2(3)中所述的方法來制備，其中用馬來酰亞胺如o-PDM，雙馬來酰亞胺己烷或其類似物處理Fab′，形成硫醚鍵，或用DTNB處理，形成S-S鍵的方法(抗體工程(Antibody Engineering)，實踐指南(A Practical Guide)，IRL PRESS(1996))。
(3)制備Fab′Fab′可通過遺傳工程技術(shù)采用大腸桿菌來制備。例如，F(xiàn)ab′表達(dá)載體可通過克隆第1(2)和(3)中所述的編碼抗體V區(qū)的DNA進(jìn)Fab’表達(dá)載體中而制備。對于Fab’表達(dá)的載體，可使用任何載體，只要Fab’的DNA可被插入和表達(dá)。實例包括pAK19(Bio/Technology，10，163(1992))及其類似物。通過將Fab′表達(dá)載體導(dǎo)入進(jìn)合適的大腸桿菌中，F(xiàn)ab’可在包涵體或胞質(zhì)間隙中形成和積累。通過通常用于蛋白質(zhì)重折疊的方法從包涵體中獲得有活性的Fab’，當(dāng)它在胞質(zhì)間隙中表達(dá)時，通過用如溶菌酶部分消化，滲透壓沖擊，超聲處理或及其類似處理破裂細(xì)胞，它可在細(xì)胞外部分被回收。均一的Fab’可重折疊后純化或從破裂的細(xì)胞懸液中采用蛋白G柱或類似物純化(抗體工程(Antibody Engineering)，實踐指南(A Practical Guide)，IRL PRESS(1996))。
(4)制備scFvscFv可采用噬菌體或大腸桿菌通過遺傳工程技術(shù)來制備。例如，通過編碼含有12個或更多殘基的氨基酸序列的多肽連接子的DNA連接第1(2)和(3)項中所述的編碼抗體的VH和VL的DNA，產(chǎn)生編碼scFv的DNA。通過將得到的DNA克隆到scFv表達(dá)載體中可構(gòu)建scFv表達(dá)載體。作為scFv表達(dá)載體，可以使用任何載體，只要scFv的DNA能被插入和表達(dá)。實例包括pCANTAB5E(由Pharmacia生產(chǎn))，Phfa(Hum.AntibodyHybridoma，5，48(1994))及其類似物。scFv表達(dá)載體被導(dǎo)入合適的大腸桿菌中，被一個輔助噬菌體感染，為獲得噬菌體可在噬菌體表面表達(dá)與噬菌體表面蛋白質(zhì)融合的形式的scFv。scFv也可在包涵體或大腸桿菌的胞質(zhì)間隙中形成和積累，此大腸桿菌已經(jīng)被導(dǎo)入scFv表達(dá)載體。通過通常用于蛋白質(zhì)重折疊的方法，從包涵體中獲得有活性的scFv，當(dāng)它在胞質(zhì)間隙中表達(dá)時，通過用如溶菌酶部分消化，滲透壓沖擊，超聲處理及其類似方法處理破裂細(xì)胞，它可在細(xì)胞外被回收。均一的scFv可在重折疊后純化或從破裂的細(xì)胞懸液中采用陽離子交換層析或類似物純化(抗體工程(Antibody Engineering)，實踐指南(A Practical Guide)，IRL PRESS(1996))。
(5)制備微型雙功能抗體通過改變制備scFv的多肽連接子的大小至大約3至10個殘基，制備微型雙功能抗體。當(dāng)使用一種抗體類型的VH和VL時，可制備二價的微型雙功能抗體，當(dāng)使用兩種抗體類型的VH和VL時，制備具有兩種不同特異性的微型雙功能抗體(FEBS Letters，453，164(1999)，Int.J.Cancer，77，763(1998))。
(6)制備dsFvdsFv可采用大腸桿菌通過遺傳工程技術(shù)制備。首先，通過將突變導(dǎo)入編碼第1(2)和1(3)項中所述的抗體的VH和VL的DNA的合適位置上，產(chǎn)生其中編碼的一個氨基酸殘基被半胱氨酸殘基取代的DNA。VH和VL表達(dá)載體可通過將每一個得到的DNA導(dǎo)入進(jìn)dsFv表達(dá)載體中而產(chǎn)生。作為dsFv表達(dá)載體，可使用任何載體，只要dsFv的DNA能被插入和表達(dá)。實例包括pULI9(蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering)，7，697(1994))及其類似物。VH和VL表達(dá)載體被導(dǎo)入合適的大腸桿菌中，從而在包涵體或胞質(zhì)間隙中形成和積累VH和VL。VH和VL從包涵體或胞質(zhì)間隙中獲得，并混合，通過通常用于蛋白質(zhì)的重折疊法可獲得活性dsFv。重折疊后，可進(jìn)一步通過離子交換層析和凝膠過濾或其類似方法來純化(蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering)，7，697(1994))。
(7)制備含有CDR的肽含有CDR的肽可通過化學(xué)合成法，如Fmoc，tBoc或類似方法來制備。同樣，制備編碼含有CDR的肽的DNA，得到的DNA被克隆到合適的表達(dá)載體中，以制備含有CDR的肽。作為表達(dá)載體，可以使用任何載體，只要編碼含有CDR的肽的DNA被插入和表達(dá)。實例包括pLEX(Invitrogen生產(chǎn))，pAX4a+(Invitrogen生產(chǎn))及其類似物。表達(dá)載體被導(dǎo)入合適的大腸桿菌，因此在包涵體或胞質(zhì)間隙中形成和積累含有CDR的肽。含有CDR的肽可從包涵體或胞質(zhì)間隙中獲得，可通過離子交換層析和凝膠過濾或類似方法純化(蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering)，7，697(1994))。
3.評價本發(fā)明的抗體的活性和特性(1)評價抗原結(jié)合活性本發(fā)明的抗體對抗原的結(jié)合活性可通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，熒光抗體技術(shù)(Cancer Immnnol.Immunother.，36，373(1993)，使用如BIAcoreTM的表面胞質(zhì)共振等方法來測定。特別是，產(chǎn)生含有CCR4部分序列的合成肽，通過將其化學(xué)性連接于一個載體蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白或類似物來制備結(jié)合物。本發(fā)明的抗體的CCR4結(jié)合活性的測定可通過將結(jié)合物固定在ELISA板上，使其與本發(fā)明的抗體反應(yīng)，進(jìn)一步使其與標(biāo)記的抗體或結(jié)合片段如過氧化物酶或生物素標(biāo)記的抗體或結(jié)合片段反應(yīng)，然后使用吸收光度計測定有色染料。
(2)表達(dá)CCR4細(xì)胞的反應(yīng)性為了測定CCR4表達(dá)細(xì)胞的反應(yīng)性，優(yōu)選使用可有效檢測細(xì)胞表面上表達(dá)的CCR4的方法。方法包括使用熒光抗體技術(shù)的流式細(xì)胞儀和類似方法。另外，當(dāng)檢測與活體細(xì)胞如血小板和類似細(xì)胞的反應(yīng)性時，優(yōu)選在與活細(xì)胞盡可能相近的條件下進(jìn)行檢測。由于這些原因，當(dāng)檢測本發(fā)明的抗CCR4抗體的反應(yīng)性時，最希望的是采用熒光抗體技術(shù)的流式細(xì)胞儀來進(jìn)行檢測。
熒光抗體技術(shù)中的抗體可以是用熒光材料如FITC，生物素或類似物標(biāo)記的抗體，或是未標(biāo)記的抗體。根據(jù)所使用的抗體是否有標(biāo)記和其類型，可使用熒光素標(biāo)記的抗生物素蛋白，熒光標(biāo)記的抗人免疫球蛋白抗體。可通過向被測樣品中加入足夠量的抗CCR4抗體(終濃度一般從0.1至10μg/ml)進(jìn)行反應(yīng)，將其反應(yīng)性與陰性對照抗體和陽性對照抗體進(jìn)行比較來評價反應(yīng)性。
(3)細(xì)胞毒活性CCR4表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性可通過測定CDC活性，ADCC活性及其類似方法來評價(Cancer Immunol.Immunother.，36，373(1993))。所產(chǎn)生的細(xì)胞因子量的變化可通過ELISA法，熒光抗體技術(shù)和采用細(xì)胞因子抗體的類似方法來測定。
(4)抑制配體結(jié)合的活性抑制本發(fā)明抗CCR4抗體結(jié)合配體的活性可通過TARC或MDC的標(biāo)記來測定，它們可作為與CCR4，CCR4表達(dá)細(xì)胞或其細(xì)胞膜片段具有結(jié)合活性的配體。TARC或MDC可被任何可被探測的技術(shù)所標(biāo)記，實例包括熒光標(biāo)記，酶標(biāo)記，放射標(biāo)記和類似方法。具體的實例包括通過采用WO00/42074中所述的放射標(biāo)記來測定結(jié)合抑制活性的方法。
抑制本發(fā)明的抗CCR4抗體的配體結(jié)合活性也可通過使用配體與CCR4結(jié)合誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)作為指標(biāo)來檢測。細(xì)胞反應(yīng)可以是任何類型，只要可以通過配體與CCR4表達(dá)細(xì)胞的接觸而被誘導(dǎo)，實例包括細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，細(xì)胞遷移和類似反應(yīng)。具體的實例包括通過在WO00/42074中所述的監(jiān)測CCR4配體誘導(dǎo)的CCR4表達(dá)細(xì)胞的遷移抑制的方法。
(5)檢測識別序列有本發(fā)明抗體識別的氨基酸序列可通過使用合成肽來檢測，該肽是根據(jù)其相應(yīng)抗原蛋白質(zhì)的一級序列來設(shè)計的。
合成肽的一級序列是根據(jù)抗原蛋白質(zhì)的一級序列來設(shè)計的。為了制備一種蛋白質(zhì)，其中合成肽與載體蛋白質(zhì)是結(jié)合的，半胱氨酸殘基被加入至合成肽的羧基末端或氨基末端。得到的蛋白質(zhì)可被用于ELISA中，ELISA將在后面描述。如果需要，合成肽的N末端或C末端也可分別被乙?；王０坊?。
可通過普通的液相或固相肽合成方法，其任何組合法或其修飾的方法來合成肽(International Journal of Peptide Protein Research，35，161-214(1990)，“固相肽合成”，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)，289卷，Gregg B.Fields主編，Academic Press(1997)，“肽合成方法”，分子生物學(xué)方法(Methods in Molecular Biology)，35卷，Michael W.Pennington和Ben M.Dunn主編，Humana Press(1994))。
另外，也可使用自動肽合成儀。通過肽合成儀合成的肽可采用市售的肽合成儀如由Shimadzu Corp.生產(chǎn)的肽合成儀，AdvancedChem Tech Inc，USA(此后稱為″ACT″)生產(chǎn)的肽合成儀或類似儀器來進(jìn)行，使用Nα-Fmoc-氨基酸，Nα-Boc-氨基酸或類似物，它們的側(cè)鏈被適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)，并根據(jù)各自的合成程序。被保護(hù)的氨基酸被用作原料，載體樹脂可從ABI Inc.，Shimadzu Corp.，Kokusan Kagaku K.K.，NovaBiochem，Watanabe Kagaku K.K.，ACT，AnaSpec Inc.，PeptideResearch Institute和類似公司購買。
作為檢測氨基酸序列的方法，可使用任何技術(shù)，只要它是可檢測合成肽與抗體結(jié)合的方法，所述的氨基酸序列可采用合成肽被本發(fā)明的抗體識別。例如，可由抗體識別的氨基酸序列，通過用熒光材料，放射形材料或類似物標(biāo)記合成肽檢測，并檢測得到的標(biāo)記肽與抗體的結(jié)合活性。也可通過將合成肽與蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白(BSA)或類似物結(jié)合，并通過ELISA或類似方法評價得到的蛋白質(zhì)與抗體的反應(yīng)性。另外，可被本發(fā)明抗體識別的氨基酸序列也可通過使用一種物質(zhì)來測定，該物質(zhì)已經(jīng)被證實有抗體結(jié)合在其上，如抗體蛋白質(zhì)，并檢測能抑制抗體與該物質(zhì)結(jié)合的合成肽。
4.用抗CCR4抗體檢測和定量CCR4的方法本發(fā)明涉及一種使用本發(fā)明的抗體的免疫學(xué)檢測和測定CCR4或其表面表達(dá)CCR4的細(xì)胞的方法。
采用本發(fā)明的抗體的免疫學(xué)檢測和測定CCR4或其表面表達(dá)CCR4的細(xì)胞的方法包括免疫熒光法，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，放射性材料標(biāo)記的免疫試驗(RIA)，免疫組織化學(xué)染色方法例如免疫細(xì)胞染色法，免疫組織染色法等(ABC法，CSA法，等)，上述的酶免疫測定，夾心ELISA(單克隆抗體試驗手冊(Monoclonal Antibody ExperimentManual)(Kodansha Scientific出版，1987)，生物化學(xué)試驗教程第二系列從書(Second Series Biochemical Experiment Course)，第5卷，免疫生物化學(xué)研究方法(Immunobiochemistry Research Method)，Tokyo KagakuDojin出版(1986))。
免疫熒光法包括將分離的細(xì)胞，組織或類似物與本發(fā)明的抗體反應(yīng)，將反應(yīng)物與標(biāo)記有熒光物質(zhì)的抗免疫球蛋白抗體或結(jié)合片段反應(yīng)，熒光物質(zhì)如異硫氰酸熒光素(FITC)或類似物，然后用流式細(xì)胞儀測定熒光物質(zhì)。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)包括用分離的細(xì)胞或其細(xì)胞裂解物，組織或其組織裂解物，細(xì)胞培養(yǎng)上清液，血清，preural液，腹水，眼液等與本發(fā)明的抗體反應(yīng)，將反應(yīng)物與標(biāo)記有酶如過氧化物酶、生物素等的抗免疫球蛋白抗體或結(jié)合片段反應(yīng)，然后用吸收光度計測定產(chǎn)生的顏色(resultant developed dye)。
放射性材料標(biāo)記的免疫試驗(RIA)包括將分離的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物，組織或組織裂解物，細(xì)胞培養(yǎng)上清液，血清，preural液，腹水，眼液或類似物與本發(fā)明的抗體反應(yīng)，進(jìn)一步將反應(yīng)物與標(biāo)記有放射性同位素的抗免疫球蛋白抗體或結(jié)合片段反應(yīng)，然后用閃爍掃描計數(shù)器或類似儀器測定放射性。
免疫細(xì)胞染色和免疫組織染色法包括將分離的細(xì)胞，組織等與本發(fā)明的抗體反應(yīng)，將反應(yīng)物與標(biāo)記有熒光物質(zhì)的抗免疫球蛋白抗體或結(jié)合片段反應(yīng)，熒光物質(zhì)如異硫氰酸熒光素(FITC)或類似物，或酶如過氧化物酶，生物素等，然后用顯微鏡觀察細(xì)胞，組織等。
夾心ELISA是一種方法，包括在板上吸附具有本發(fā)明抗體中不同的抗原決定簇的兩種抗體中的一種，用熒光物質(zhì)如FITC或類似物，或酶如過氧化物酶，生物素等標(biāo)記另一個抗體，將分離的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物，組織或組織裂解物，細(xì)胞培養(yǎng)上清液，血清，preural液，腹水，眼液或類似物與抗體吸附板反應(yīng)；然后根據(jù)標(biāo)記物質(zhì)，將其與標(biāo)記的抗體進(jìn)行反應(yīng)。
5.使用人CDR移植抗體或其抗體片段的方法由于本發(fā)明的抗體能與在培養(yǎng)細(xì)胞系上表達(dá)的CCR4特異結(jié)合，，顯示如CDC活性，ADCC活性等細(xì)胞毒活性，可用于診斷和治療CCR4相關(guān)的疾病，如Th2介導(dǎo)的疾病等。同樣，因為來自人抗體的氨基酸序列部分的比例高于非人動物的抗體，可以預(yù)測它在人體內(nèi)可顯示強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，不顯示免疫原性，效應(yīng)可持續(xù)很長的時間。
另外，可由細(xì)胞產(chǎn)生的Th2細(xì)胞因子如IL-4，IL-5，IL-13和類似物，通過將本發(fā)明的抗體給于實驗受試者的細(xì)胞或組織中而被抑制。
作為與本發(fā)明相關(guān)的CCR4表達(dá)細(xì)胞，Th2細(xì)胞和類似細(xì)胞可作為例證。用于本發(fā)明的Th2細(xì)胞優(yōu)選是活化的Th2細(xì)胞或記憶Th2細(xì)胞。實例包括具有CD45RA-或CD45RO+和CD4+特性的細(xì)胞。
本發(fā)明的抗體的細(xì)胞毒活性是例如當(dāng)本發(fā)明的抗體與CCR4表達(dá)細(xì)胞，如Th2細(xì)胞結(jié)合，然后誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡時產(chǎn)生的。細(xì)胞也可通過誘導(dǎo)凋亡被減少和除去。
診斷Th2介導(dǎo)的免疫疾病或癌癥的方法也包括如上所述免疫檢測實驗受試者細(xì)胞或組織中存在的人CCR4陽性細(xì)胞。
而且，本發(fā)明的抗體可用作CCR4相關(guān)疾病的診斷試劑，所述疾病如Th2介導(dǎo)免疫疾病或癌癥，或由于Th2細(xì)胞的異常增加或減少引起病情進(jìn)展的疾病。
而且，因為本發(fā)明的抗體可通過其細(xì)胞毒活性減少或除去CCR4表達(dá)細(xì)胞，它對CCR4相關(guān)疾病如Th2介導(dǎo)的免疫疾病或癌癥可提供一種診斷或治療的方法，該法使用本發(fā)明的抗體，和CCR4相關(guān)疾病如Th2介導(dǎo)的免疫疾病或癌癥的治療和預(yù)防制劑，其中含有本發(fā)明的抗體作為活性成分的。
Th2介導(dǎo)的免疫疾病包括，無論輕微或嚴(yán)重的炎性疾病如急性或慢性呼吸道高敏性或支氣管哮喘，異位性皮膚疾病包括異位性皮炎，過敏性鼻炎，花粉病和類似疾病，由炎癥敏感細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞和類似細(xì)胞引起的疾病，這些細(xì)胞可被Th2細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子和趨化因子，由Th2細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子和趨化因子等產(chǎn)生的生物學(xué)功能性分子如IgE等增殖或活化；以及由于Th2細(xì)胞異常改變引起病情進(jìn)展的免疫疾病。
本發(fā)明的抗體可單獨使用，但通常優(yōu)選以一種藥學(xué)制劑的形式提供，根據(jù)制藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域中已知的方法，該制劑是將抗體與至少一種制藥學(xué)可接受的載體混合而產(chǎn)生的。
優(yōu)選的給藥途徑，在進(jìn)行所需要的治療中是最有效的，如口服給藥或胃腸外給藥，如口內(nèi)給藥，氣管給藥，直腸給藥，皮下注射，肌肉注射，靜脈注射和類似途徑?？贵w或肽制劑優(yōu)選以靜脈給藥。
藥物劑型包括噴霧劑，膠囊，片劑，顆粒，糖漿，乳劑，栓劑，注射劑，膏劑，帶劑等。
適合口服的劑型包括乳劑，噴霧劑，糖漿，膠囊，片劑，粉劑，顆粒和類似劑型。
液體制劑如乳劑和糖漿的產(chǎn)生，可使用添加劑如水；糖類，如蔗糖，山梨醇，果糖；二元醇，如聚乙二醇，丙二醇；油類，如芝麻油，橄欖油，豆油；防腐劑，如p-對羥基苯甲酸鹽；和香料，如草莓香料，薄荷油。
膠囊，片劑，粉劑，顆粒和類似劑型的產(chǎn)生可使用添加劑如填料，如乳糖，葡萄糖，蔗糖，甘露醇；分解劑，如淀粉，藻酸鈉；潤滑劑，如硬脂酸鎂；滑石；粘合劑，如聚乙烯醇，羥丙纖維素，明膠；表面活性劑，如脂肪酸酯類；和增塑劑，如甘油。
適合胃腸外給藥的制劑包括注射劑，栓劑，噴霧劑和類似制劑。
注射劑的制備可使用載體如鹽溶液，葡萄糖溶液或其混合物，或類似物質(zhì)。
栓劑的制備可使用載體，如可可脂，氫化脂，羧酸或類似物質(zhì)。
噴霧劑也可從抗體本身來制備，或使用載體，或使用不刺激患者的口腔和呼吸道粘膜的類似物質(zhì)，可通過將其分散為微小顆粒來促進(jìn)抗體或其抗體片段的吸收。
載體包括如乳糖，甘油和類似物。根據(jù)抗體或肽的特性和使用的載體，可產(chǎn)生氣溶膠、干粉等?？诜苿┲欣e的添加劑也可加入至胃腸外制劑中。
給藥的劑量和頻率可根據(jù)所需的治療效應(yīng)，給藥方法，治療周期，年齡，體重和類似因素而變化，但劑量的通常范圍是從每個成人每天0.01mg/kg至20mg/kg。
本發(fā)明根據(jù)下面的實例進(jìn)行描述，但本發(fā)明并不受此限制。
附圖簡述

圖1顯示了質(zhì)粒pKM2160Gal0的構(gòu)建步驟。
圖2顯示了質(zhì)粒pKM2160Gal1的構(gòu)建步驟。符號*表示修飾氨基酸殘基的突變遺傳代碼的位點。
圖3顯示了質(zhì)粒pKM2160Gal3的構(gòu)建步驟。符號*顯示了修飾氨基酸殘基的突變遺傳代碼的位點。
圖4顯示了質(zhì)粒pKM2160LV0的構(gòu)建步驟。
圖5顯示了質(zhì)粒pKM2160LV1的構(gòu)建步驟。符號*顯示了修飾氨基酸殘基的突變遺傳代碼的位點。
圖6顯示了質(zhì)粒pKANTEX2160LV0和質(zhì)粒pKANTEX2160Gal0LV0的構(gòu)建步驟。
圖7顯示了根據(jù)ELISA，在COS-7細(xì)胞中瞬時表達(dá)每種抗CCR4CDR移植抗體的表達(dá)載體獲得的培養(yǎng)上清液，與CCR4部分肽的反應(yīng)性。
圖8顯示了根據(jù)ELISA，在COS-7細(xì)胞中瞬時表達(dá)每種抗CCR4CDR移植抗體的表達(dá)載體獲得的培養(yǎng)上清液，與CCR4部分肽的反應(yīng)性，其中的抗CCR4 CDR移植抗體是使用其他FR來制備的。
圖9顯示了純化的抗CCR4 CDR移植抗體與CCR4部分肽的反應(yīng)性。
圖10顯示了純化的抗CCR4 CDR移植抗體與CCR4高表達(dá)細(xì)胞(CCR4/EL-4)的反應(yīng)性。
圖11顯示了純化的抗CCR4 CDR移植抗體與CCR4部分肽的親和性，使用表面胞質(zhì)共振傳感器來測定。
圖12顯示了根據(jù)ADCC活性對CCR4/EL-4細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
圖13顯示了來自人PBMC的IL-4，IL-13和IFN-γ產(chǎn)生的抑制效應(yīng)。
圖14顯示了每種抗體與人血小板的結(jié)合作用。
圖15顯示了質(zhì)粒pKM2160的VH41和pKM2160的VL61的構(gòu)建步驟。
圖16顯示了質(zhì)粒pKANTEX2160H的構(gòu)建步驟。
圖17顯示了質(zhì)粒pKANTEX2160的構(gòu)建步驟。
實施本發(fā)明的最佳方式實施例1產(chǎn)生CCR4的人CDR移植抗體1.設(shè)計編碼CCR4的人CDR移植抗體的VH和VL的cDNA(1)設(shè)計編碼CCR4的人CDR移植抗體的VH和VL的氨基酸序列首先，CCR4的人CDR移植抗體(抗CCR4 CDR-移植抗體)的VH的氨基酸序列設(shè)計如下。使用在參考例1中建立的抗CCR4鼠抗體KM2160(Int.Immunol.，11，81(1999))選擇人抗體的VH的FR的氨基酸序列來移植VH的CDR1，2和3的氨基酸序列，該氨基酸序列表示為SEQ ID NO1，2和3。與KM2160具有高度同源性的人抗體可通過BLASTP法使用GCG程序包(Genetics Computer Group生產(chǎn))作為序列分析系統(tǒng)，從已存在蛋白質(zhì)的氨基酸序列數(shù)據(jù)庫中搜索到(Nucleic Acid Res.，25，3389(1997))。當(dāng)實際的氨基酸同源性與同源性記分相比較時，SWISSPROT數(shù)據(jù)庫登記編號P01781，Ig重鏈V-III區(qū)Gal(Hoppe.Seylers.Z.Physiol.Chem.，354.1505-1509(1973)；以后稱為″Gal″)是一種顯示最高同源性為82.5％的人抗體，這樣就選擇了抗體的FR氨基酸序列。但在數(shù)據(jù)庫中Gal的FR氨基酸序列中可發(fā)現(xiàn)一些位點和氨基酸殘基，其中在這些位點的氨基酸殘基不能被唯一的確定(分泌性抗體N末端的28和30位)，所述的氨基酸殘基在人抗體的序列中具有較低的產(chǎn)生頻率(Thr作為最終的V區(qū)殘基)。因此，作為鼠KM2160中發(fā)現(xiàn)的Ile和Ser殘基可選擇作為28位和30位，Thr作為V區(qū)的最終殘基被Ser取代。因為發(fā)現(xiàn)這些氨基酸殘基在任何人抗體的序列中都有很高的頻率(Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Dep.Health and Human Services，1991)，它們不背離人體抗體序列的。
表示為SEQ ID NO4的抗CCR4 CDR移植抗體的VH氨基酸序列Gal0，可通過分別將表示為SEQ ID NO1，2和3的抗CCR4鼠抗體的VHCDR1，2和3的氨基酸序列移植至已確定的人抗體FR氨基酸序列中的合適位點上而設(shè)計。編碼SEQ ID NO4的氨基酸序列的核苷酸序列表示為SEQ ID NO49。
抗CCR4 CDR移植抗體的VH的氨基酸序列也可根據(jù)Kabat等人所分類的共有序列來設(shè)計。
Kabat等人已經(jīng)將多種已知的人抗體的VH根據(jù)其氨基酸序列的同源性和在每個亞型中已報道的共有序列，歸為三種亞型(HSG I至III)(Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dep.Health andHuman Services，1991)。共有序列的免疫原性在人體中減小是可能的。因此，為了制備具有高活性的抗CCR4 CDR移植抗體，在人抗體的VH的三個亞型中共有序列的FR氨基酸序列中，設(shè)計選擇與KM2160的VH的FR氨基酸序列具有最高同源性的FR氨基酸序列。表1顯示了人抗體的VH每個亞型的共有序列的FR氨基酸序列和KM2160的VH的FR氨基酸序列之間同源性搜索結(jié)果。如表1所示，KM2160的VH區(qū)的FR氨基酸序列與亞型III顯示具有最高的同源性。
表1HSGI HSGII HSGIII57.47％50.58％77.01％根據(jù)上述的結(jié)果，SEQ ID NO38所示的抗CCR4 CDR移植抗體的VH氨基酸序列HV0，可通過將抗CCR4鼠抗體KM2160的VH的CDR的氨基酸序列移植至人抗體的VH亞型III的共有序列的FR氨基酸序列的合適上而設(shè)計。編碼SEQ ID NO38氨基酸序列的核苷酸序列表示為SEQ ID NO57。
(2)設(shè)計CCR4的人CDR移植抗體的VL的氨基酸序列下一步，抗CCR4 CDR-移植抗體的VL的氨基酸序列設(shè)計如下。人抗體的VL的FR的氨基酸序列選自移植抗CCR4鼠抗體KM2160的VL的CDR1，2和3的氨基酸序列，該氨基酸序列分別表示為SEQ ID NO5，6和7。Kabat等人已經(jīng)將多種已知的人抗體的VL根據(jù)其氨基酸序列的同源性和在每個亞型中已報道的共有序列，歸為四種亞型(HSG I至IV)(Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dep.Health andHuman Services，1991)。因此，在人抗體的VL的四個亞型中共有序列的FR氨基酸序列中，選擇與KM2160的VL的FR氨基酸序列具有最高同源性的FR氨基酸序列。表2顯示了人抗體的VL每個亞型的共有序列的FR氨基酸序列和KM2160的VL的FR氨基酸序列之間同源性搜索結(jié)果。如表2所示，KM2160的VL的FR氨基酸序列與亞型II顯示具有最高的同源性。
表2HSGI HSGII HSGIII HSGIV65.00％82.50％65.00％72.50％根據(jù)上述的結(jié)果，SEQ ID NO8所示的抗CCR4 CDR移植抗體的VL氨基酸序列LV0，可通過將分別表示為SEQ ID NO5，6，7的抗CCR4鼠抗體KM2160的VL的CDR1，2和3的氨基酸序列移植至人抗體的VL亞型II的共有序列的FR氨基酸序列的合適位點上而設(shè)計。編碼SEQ IDNO8氨基酸序列的核苷酸序列表示為SEQ ID NO53。
(3)修飾CCR4的人CDR移植抗體的VH和VL上面設(shè)計的抗CCR4 CDR移植抗體的VH氨基酸序列Gal0和HV0，和VL氨基酸序列LV0是其中抗CCR4鼠抗體KM2160的CDR氨基酸序列單獨被移植至選擇的人抗體FR氨基酸序列上的抗體。但，當(dāng)僅用鼠抗體的CDR氨基酸序列移植時，人CDR移植抗體的活性經(jīng)常會降低，為了避免這種降低，被認(rèn)為對活性有影響的人抗體和鼠抗體之間不同的FR氨基酸殘基中的某些氨基酸殘基通常會與CDR氨基酸序列一起移植。因此，在本實施例中，進(jìn)行一種檢測以鑒定被認(rèn)為對活性有影響的FR氨基酸殘基。
首先，采用計算機(jī)模型技術(shù)構(gòu)建上面設(shè)計的抗CCR4 CDR移植抗體V區(qū)的三維結(jié)構(gòu)(Gal0LV0和HV0LV0)，其中V區(qū)含有VH的氨基酸序列Gal0和HV0和VL的氨基酸序列LV0的抗體。使用軟件AbM(OxfordMolecular制作)來制備三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，使用軟件Pro-Explore(OxfordMolecular制作)或RasMol(Glaxo制作)根據(jù)各自附帶的說明書來顯示三維結(jié)構(gòu)?？笴CR4鼠抗體KM2160的V區(qū)三維結(jié)構(gòu)的計算機(jī)模型也可以相同的方式構(gòu)建。另外，含有修飾氨基酸序列的三維結(jié)構(gòu)模型可以相同的方式構(gòu)建，其中不同于抗CCR4鼠抗體KM2160的VH和VL的FR氨基酸序列Gal0LV0或HV0LV0的某些殘基，可被在抗CCR4鼠抗體KM2160中相應(yīng)位點上發(fā)現(xiàn)的其他殘基取代，并比較抗CCR4鼠抗體KM2160的V區(qū)，Gal0LV0或HV0LV0和修飾產(chǎn)物的三維結(jié)構(gòu)。
結(jié)果是，改變了抗原結(jié)合區(qū)的三維結(jié)構(gòu)，以便選擇Gal0中40位的Ala，42位的Gly，43位的Lys，44位的Gly和76位的Lys，97位中的Ala，HV0中28位的Thr和97中的Ala和LV0中2位的Ile，3位的Val，50位的Gln和88位的Val作為被認(rèn)為是Gal0LV0或HV0LV0的FR氨基酸殘基中對抗體的活性有影響的殘基。在這些選擇的氨基酸殘基中，至少有一個氨基酸被修飾為鼠抗體KM2160中發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基，以便設(shè)計含有多種修飾作用的人CDR移植抗體的VH和VL。
首先，就VH而言，例如設(shè)計Gal1表示為SEQ ID NO9，其中Gal0的97位的Ala被修飾，Gal2表示為SEQ ID NO10，其中Gal0的42位的Gly和44位的Gly被修飾，Gal3表示為SEQ ID NO11，其中Gal0的97位的Ala，42位的Gly和44位上的Gly被修飾，HV1表示為SEQ ID NO39，其中HV0的28位的Thr被修飾，HV2表示為SEQ ID NO40，其中HV0的97位的Ala被修飾，HV3表示為SEQ ID NO41，其中HV0的28位的Thr，97位的Ala被修飾。而且，就VL而言，例如設(shè)計LV1表示為SEQ IDNO12，其中2位的Ile被修飾，LV2表示為SEQ ID NO13，其中3位上的Val被修飾，LV3表示為SEQ ID NO14，其中2位的Ile和3位的Val被修飾。編碼SEQ ID NO9至11，39至41和12至14所示氨基酸序列的核苷酸序列分別表示為SEQ ID NO50至52，58至60和54至56。
2.構(gòu)建編碼抗CCR4 CDR移植抗體的cDNA(1)構(gòu)建編碼抗CCR4 CDR移植抗體的VH的cDNA如下，使用PCR構(gòu)建在實施例1(1)中設(shè)計的編碼抗CCR4 CDR移植抗體的VH的Gal0的氨基酸序列的cDNA。
首先，通過將設(shè)計的氨基酸序列與表示為SEQ ID NO15的抗CCR4鼠抗體KM2160的H鏈分泌信號序列連接，形成完整的抗體氨基酸序列。下一步，氨基酸序列被轉(zhuǎn)變?yōu)檫z傳密碼子。當(dāng)對于一個氨基酸殘基存在兩種或更多的遺傳密碼子，通過考慮在抗體基因核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)的密碼子確定相應(yīng)的遺傳密碼子(Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Dep.Health and Human Services，1991)。通過連接已確定的遺傳密碼子，并結(jié)合PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列(包括為了克隆進(jìn)載體，表達(dá)人源化抗體的限制性酶識別序列)設(shè)計編碼完整抗體V區(qū)氨基酸序列的cDNA的核苷酸序列，并將其加入至其5’末端和3’末端。設(shè)計的核苷酸序列被分成總共6個核苷酸序列，每個都含有從5’末端計大約100個核苷酸(設(shè)計其鄰接的核苷酸序列，這樣在其末端具有大約20個核苷酸的互補(bǔ)序列)，并且6個合成的寡核苷酸SEQ ID NO16，17，18，19，20和21以正義鏈和反義鏈(GENSET制造)的相補(bǔ)順序被合成。
PCR的進(jìn)行是向含有0.2mM dNTPs和1mM氯化鎂的反應(yīng)溶液中添加每種寡核苷酸至終濃度0.1μM，使用0.4μM M13引物RV(TakaraShuzo制造)，0.4μM M13引物M3(GENSET制造)和2.5單位KOD聚合酶(TOYOBO制造)，調(diào)整總體積至50μl。反應(yīng)進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃30秒，55℃30秒和74℃60秒，然后74℃10分鐘進(jìn)行1個循環(huán)。反應(yīng)溶液用QIA快速PCR純化試劑盒(QIAGEN制造)進(jìn)行純化，最后溶解在無菌水中。反應(yīng)溶液使用10單位限制性酶Apal(Takara Shuzo制造)和10單位限制性酶NotI(Takara Shuzo制造)在37℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)溶液通過瓊脂糖凝膠電泳分離，回收大約0.47kb的Apal-NotI片段。
下一步，使用10單位限制性酶ApaI(Takara Shuzo制造)和10單位限制性酶NotI(Takara Shuzo制造)，使3μg質(zhì)粒pBluescript II SK(-)(Stratagene制造)與片段，在37℃反應(yīng)1小時。所述的反應(yīng)溶液通過瓊脂糖凝膠電泳分離，回收大約2.95kb的ApaI-NotI片段。
下一步，得到的抗CCR4 CDR移植抗體的VH的PCR產(chǎn)物的ApaI-NotI片段和質(zhì)粒pBluescript II SK(-)的ApaI-NotI片段使用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo制造)的溶液I根據(jù)產(chǎn)品的說明書進(jìn)行連接。使用以這種方式獲得的重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(TOYOBO制造)，每種質(zhì)粒DNA從轉(zhuǎn)化體克隆中制備，Big DyeTerminator Kit ver.2(Applied Biosystems制造)分析其核苷酸序列。核苷酸序列分析的結(jié)果是，獲得了在圖1中所示的具有目的核苷酸序列的質(zhì)粒pKM2160Gal0。用質(zhì)粒pKM2160Gal0轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，即大腸桿菌DH5α/pKM2160Gal0已經(jīng)在2001年8月22日作為FERM BP-7709存放在專利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)，獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所((National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology)(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-ChomeTsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本))。
下一步，如下修飾在實施例1的1(3)中設(shè)計的FR氨基酸殘基。修飾后氨基酸殘基的遺傳密碼子被修飾為鼠抗體KM2160中發(fā)現(xiàn)的遺傳密碼子。
在97位的Ala修飾為Gly的過程中，使用PCR，使用在此項中制備的25ng質(zhì)粒pKM2160Gal0作為模板，在50μ1的反應(yīng)系統(tǒng)中首次94℃加熱2分鐘，然后反應(yīng)35循環(huán)，每次循環(huán)包括94℃ 15秒，55℃ 30秒和68℃40秒，該系統(tǒng)的制備是通過加入用于基因轉(zhuǎn)變的每種合成的DNA作為引物至終濃度為0.4μM，其含有表示為SEQ ID22和23(GENSET制造)的核苷酸序列，，根據(jù)產(chǎn)品說明書使用2.5單位KOD加聚合酶(TOYOBO制造)。反應(yīng)溶液使用QIA快速PCR純化試劑盒(QIAGEN制造)進(jìn)行純化，最終溶解在無菌水中?？傮w積可允許使用10單位限制性酶PstI(Takara Shuzo制造)在37℃反應(yīng)1小時，然后和10單位限制性酶DraIII(New England Biolabs制造)在37℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)溶液用瓊脂糖凝膠電泳分離，回收大約0.58kb的PstI-DraIII片段。
下一步，3μg質(zhì)粒pKM2160Gal0使用10單位限制性酶PstI(TakaraShuzo制造)在37℃反應(yīng)1小時，然后和10單位限制性酶DraIII(NewEngland Biolabs制造)在37℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)溶液用瓊脂糖凝膠電泳分離，回收大約2.7kb的PstI-DraIII片段。
下一步，這樣從PCR產(chǎn)物中獲得的PstI-DraIII片段和從質(zhì)粒pKM2160Gal0中獲得的PstI-DraIII片段使用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo制造)的溶液I根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行連接。使用以此種方式獲得的重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(TOYOBO制造)，從轉(zhuǎn)化體克隆中制備的每種質(zhì)粒DNA，使用Big Dye Terminator Kit ver.2(Applied Biosystems制造)分析其核苷酸序列。核苷酸序列分析的結(jié)果是，獲得了圖2所示的具有目標(biāo)核苷酸序列的質(zhì)粒pKM2160Gal1。用質(zhì)粒pKM2160Gal1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，即大腸桿菌DH5α/pKM2160Gal1已經(jīng)在2001年8月22日作為FERM BP-7710存放在專利生物保藏中心，獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本)。
在42位的Gly修飾為Asp，44位的Gly修飾為Arg的過程中，通過基本上與上述相似的方法獲得質(zhì)粒pKM2160Gal2，不同之處在于使用用于基因轉(zhuǎn)變的合成DNA和M13引物RV(Takara Shuzo制造)用作PCR引物，所述合成DNA含有SEQ ID NO24(GENSET制造)所示的核苷酸序列。用質(zhì)粒pKM2160Gal2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，即大腸桿菌DH5α/pKM2160Gal2已經(jīng)在2001年8月22日作為FERM BP-7711存放在專利生物保藏中心，獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本)。
同樣，所有上述三種殘基的修飾如下進(jìn)行構(gòu)建。上面獲得的每種pKM2160Gal1和pKM2160Gal2大約0.5μg，使用10單位限制性酶NheI(Takara Shuzo制造)在37℃反應(yīng)1小時，然后和10單位限制性酶ScaI(Takara Shuzo制造)在37℃反應(yīng)1小時，。反應(yīng)溶液用瓊脂糖凝膠電泳分離，回收來自pKM2160Gal1的大約1.3kb的NheI-ScaI片段和來自pKM2160Gal2的大約2.0kb的片段。得到的兩個片段采用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo制造)的溶液I，根據(jù)產(chǎn)品的說明書進(jìn)行連接。使用這種方式獲得的重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(TOYOBO制造)，每一質(zhì)粒DNA從轉(zhuǎn)化體克隆中制備，使用Big Dye Terminator Kitver.2(Applied Biosystems制造)分析核苷酸序列。核苷酸序列分析的結(jié)果是獲得了圖3所示的具有目的核苷酸序列的質(zhì)粒pKM2160Gal3。用質(zhì)粒pKM2160Gal3轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，即大腸桿菌DH5α/pKM2160Gal3已經(jīng)在2001年8月22日作為FERM BP-7712存放在專利生物保藏中心，獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本)。
下一步，使用PCR，如下進(jìn)行構(gòu)建編碼實施例1(1)中設(shè)計的抗CCR4CDR移植抗體的VH的HV0的氨基酸序列的cDNA。
首先，通過將設(shè)計的氨基酸序列與抗CCR4鼠抗體KM2160的H鏈分泌信號序列連接在一起形成的完整抗體氨基酸序列，表示為SEQ IDNO15。下一步，氨基酸序列被轉(zhuǎn)變?yōu)檫z傳密碼子。當(dāng)一個氨基酸殘基存在兩種或更多的遺傳密碼子時，通過考慮在抗體基因核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)的密碼子確定相應(yīng)的遺傳密碼子(Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Dep.Health and Human Services，1991)。連接已確定的遺傳密碼子，因此設(shè)計編碼完整抗體V區(qū)氨基酸序列的cDNA的核苷酸序列，在其5’末端和3’末端加入增加的PCR擴(kuò)增的引物核苷酸序列(包括使用為克隆進(jìn)載體以表達(dá)人源化抗體的限制性酶識別序列)。設(shè)計的核苷酸序列被分成總共6個核苷酸序列，每個都含有從5’末端計大約100個核苷酸(設(shè)計其鄰接的核苷酸序列，這樣在其末端具有大約20個核苷酸的復(fù)制序列)，6個合成的寡核苷酸SEQ ID NO16，42，43，44，45和21以正義鏈和反義鏈(GENSET制造)的互補(bǔ)順序合成，然后pKM2160HV0可通過在此項中所述的類似于pKM2160Gal0的方法獲得。用質(zhì)粒pKM2160HV0轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，即大腸桿菌DH5α/pKM2160HV0已經(jīng)在2001年8月22日作為FERM BP-7718存放在專利生物保藏中心，獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本)。
在28位的Thr修飾為Ile的過程中，使用具有SEQ ID NO69所示的核苷酸序列的寡核苷酸代替具有SEQ ID NO42所示的核苷酸序列的寡核苷酸，使用具有SEQ ID NO46所示的核苷酸序列的寡核苷酸代替具有SEQ ID NO43所示的核苷酸序列的寡核苷酸，進(jìn)行與構(gòu)建上述質(zhì)粒pKM2160HV0相似的反應(yīng)，獲得具有目的核苷酸序列的pKM2160HV1。用質(zhì)粒pKM2160HV1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，即大腸桿菌DH5α/pKM2160HV1已經(jīng)在2001年8月27日作為FERM BP-7719存放在專利生物保藏中心，獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本)。
在28位的Thr修飾為Ile，97位的Ala修飾為Gly的過程中，使用具有SEQ ID NO69所示的核苷酸序列的寡核苷酸代替具有SEQ ID NO42所示的核苷酸序列的寡核苷酸，使用具有SEQ ID NO46所示的核苷酸序列的寡核苷酸代替具有SEQ ID NO43所示的核苷酸序列的寡核苷酸，使用具有SEQ ID NO47所示的核苷酸序列的寡核苷酸代替具有SEQID NO45所示的核苷酸序列的寡核苷酸，進(jìn)行與構(gòu)建上述質(zhì)粒pKM2160HV0相似的反應(yīng)獲得具有目的核苷酸序列的pKM2160HV3。用質(zhì)粒pKM2160HV3轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，即大腸桿菌DH5α/pKM2160HV3已經(jīng)在2001年8月27日作為FERM BP-7721存放在專利生物保藏中心，獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本)。
在97位的Ala修飾為Gly的過程中，質(zhì)粒如下構(gòu)建。每一獲得的pKM2160HV0和pKM2160HV3大約0.5μg，使用10單位限制性酶NheI(Takara Shuzo制造)，在37℃反應(yīng)1小時，然后和10單位限制性酶ScaI(Takara Shuzo制造)在37℃反應(yīng)1小時，。反應(yīng)溶液用瓊脂糖凝膠電泳分離，回收來自pKM2160HV3大約1.3kb的NheI-ScaI片段和來自pKM2160HV0的大約2.0kb的NheI-ScaI片段。得到的兩個片段采用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo制造)的溶液I根據(jù)產(chǎn)品的說明書進(jìn)行連接。使用這種方式獲得的重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(TOYOBO制造)，每一質(zhì)粒DNA從轉(zhuǎn)化體克隆中制備，使用Big DyeTerminator Kit ver.2(Applied Biosystems制造)分析核苷酸序列。核苷酸序列分析的結(jié)果是，獲得了具有目的核苷酸序列的質(zhì)粒pKM2160HV2。用質(zhì)粒pKM2160HV2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，即大腸桿菌DH5α/pKM2160HV2已經(jīng)在2001年8月27日作為FERM BP-7720存放在專利生物保藏中心，獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本)。
(2)構(gòu)建編碼抗CCR4 CDR移植抗體的VL的cDNA類似VH的情況，編碼實施例1的1(2)中設(shè)計的抗CCR4 CDR移植抗體的VL的LV0氨基酸序列的cDNA的構(gòu)建，采用PCR如下進(jìn)行。在此情況下，具有SEQ ID NO25所示氨基酸序列的抗CCR4鼠抗體KM2160的L鏈序列用作分泌信號序列。
首先，合成具有SEQ ID NO26，27，28，29，30和31中所述的核苷酸序列的6個合成寡核苷酸(GENSET制造)。通過向50μl反應(yīng)溶液中加入每種寡核苷酸至終濃度為0.1μM，使用0.4μM M13引物RV(TakaraShuzo制造)，0.4μM M13引物M4(GENSET制造)或SEQ ID NO32所示的M13引物M3(GENSET制造)，和2.5單位KOD聚合酶(TOYOBO制造)進(jìn)行PCR。反應(yīng)進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃30秒，55℃30秒和74℃60秒，然后72℃10分鐘進(jìn)行1個循環(huán)。反應(yīng)溶液用QIA快速PCR純化試劑盒(QIAGEN制造)進(jìn)行純化，最后溶解在無菌水中。反應(yīng)溶液使用10單位限制性酶EcoRI(Takara Shuzo制造)和10單位限制性酶XhoI(Takara Shuzo制造)，在37℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)溶液通過瓊脂糖凝膠電泳分離，回收大約0.44kb的EcoRI-XhoI片段。
下一步，使用15單位限制性酶EcoRI(Takara Shuzo制造)和15單位限制性酶XhoI(Takara Shuzo制造)，使得3μg質(zhì)粒pBluescript II SK(-)(Stratagene制造)，在37℃反應(yīng)1小時。此反應(yīng)溶液通過瓊脂糖凝膠電泳分離，回收大約2.95kb的EcoRI-XhoI片段。
下一步，得到的抗CCR4 CDR移植抗體的VL的PCR產(chǎn)物的EcoRI-XhoI片段和質(zhì)粒pBluescript II SK(-)的EcoRI-XhoI片段，采用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo制造)的溶液I，根據(jù)產(chǎn)品的說明書進(jìn)行連接。使用以這種方式獲得的重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(TOYOBO制造)，每種質(zhì)粒DNA從轉(zhuǎn)化體克隆中制備，使用BigDye Terminator Kit ver.2(Applied Biosystems制造)分析核苷酸序列。核苷酸序列分析的結(jié)果是，獲得了圖4所示的具有目的核苷酸序列的質(zhì)粒pKM2160LV4。用pKM2160LV0轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，即大腸桿菌DH5α/pKM2160LV0已經(jīng)在2001年8月22日作為FERM BP-7713存放在專利生物保藏中心，獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本)。
下一步，如下修飾在實施例1的1(3)中設(shè)計的FR的氨基酸殘基。修飾后的氨基酸殘基的遺傳密碼子被修飾為具有鼠抗體KM2160中發(fā)現(xiàn)的遺傳密碼子。
在2位的Ile修飾為Val的過程中，使用具有SEQ ID NO33所示的核苷酸序列的寡核苷酸代替具有SEQ ID NO27所示的核苷酸序列的寡核苷酸，進(jìn)行與構(gòu)建上述質(zhì)粒pKM2160LV0相似的反應(yīng)，獲得圖5顯示的具有目的核苷酸序列的pKM2160LV1，。用質(zhì)粒pKM2160LV1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，即大腸桿菌DH5α/pKM2160LV1已經(jīng)在2001年8月22日作為FERM BP-7714存放在專利生物保藏中心，獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本)。
當(dāng)3位的Val修飾為Leu時，以同樣的方式，通過使用具有SEQ IDNO34所示的核苷酸序列的寡核苷酸代替具有SEQ ID NO27所示的核苷酸序列的寡核苷酸，獲得每種目的質(zhì)粒pKM2160LV2和pKM2 160LV3，當(dāng)上述兩種殘基都被修飾時，使用具有SEQ ID NO35所示的核苷酸序列的寡核苷酸代替具有SEQ ID NO27所示的核苷酸序列的寡核苷酸。用質(zhì)粒pKM2160LV2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，即大腸桿菌DH5α/pKM2160LV2，用質(zhì)粒pKM2160LV3轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，即大腸桿菌DH5α/pKM2160LV3已經(jīng)在2001年8月22日作為FERM BP-7715和FERM BP-7716分別存放在專利生物保藏中心，獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本)。
(3)構(gòu)建抗CCR4 CDR移植抗體的表達(dá)載體如下，使用人源化抗體表達(dá)載體pKANTEX93(Mol.Immunol.，37，1035(2000))和實例1的2(1)和(2)中獲得的質(zhì)粒pKM2160Gal0和pKM2160LV0構(gòu)建抗CCR4 CDR移植抗體的表達(dá)載體pKANTEX2160Gal0LV0。
實施例1的2(2)中獲得的質(zhì)粒pKM2160LV0(3μg)與10單位限制性酶BsiWI(New England Biolabs制造)55℃反應(yīng)1小時，然后和10單位限制性酶EcoRI(Takara Shuzo制造)37℃反應(yīng)1小時。通過瓊脂糖凝膠電泳分離反應(yīng)溶液，回收大約0.44kb的BsiWI-EcoRI片段。
下一步，3μg人源化抗體的表達(dá)載體pKANTEX93與10單位限制性酶BsiWI(New England Biolabs制造)55℃反應(yīng)1小時，然后和10單位限制性酶EcoRI(Takara Shuzo制造)37℃反應(yīng)1小時。通過瓊脂糖凝膠電泳分離反應(yīng)溶液，回收大約12.75kb的BsiWI-EcoRI片段。
下一步，來源于pKM2160LV0的目的BsiWI-EcoRI片段和來源于pKANTEX93的目的BsiWI-EcoRI片段使用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo制造)的溶液I，根據(jù)產(chǎn)品的說明書進(jìn)行連接。使用以這種方式獲得的重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(TOYOBO制造)，從而獲得圖6中顯示的質(zhì)粒pKANTEX2160LV0。
下一步，實施例1的2(1)中獲得的質(zhì)粒pKM2160Gal0 3μg與10單位限制性酶ApaI(Takara Shuzo制造)37℃反應(yīng)1小時，然后和10單位限制性酶NotI(Takara Shuzo制造)37℃反應(yīng)1小時。通過瓊脂糖凝膠電泳分離反應(yīng)溶液，回收大約0.47kb的ApaI-NotI片段。
下一步，3μg上面獲得的質(zhì)粒pKANTEX2160LV0與10單位限制性酶ApaI(Takara Shuzo制造)37℃反應(yīng)1小時，然后和10單位限制性酶NotI(Takara Shuzo制造)37℃反應(yīng)1小時。通過瓊脂糖凝膠電泳分離反應(yīng)溶液，回收大約0.45kb的ApaI-NotI片段。
下一步，來源于pKM2160Gal0的目的ApaI-NotI片段和來源于質(zhì)粒pKANTEX2160LV0的目的ApaI-NotI片段使用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo制造)的溶液I，根據(jù)產(chǎn)品的說明書進(jìn)行連接。使用以此種方式獲得的重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(TOYOBO制造)，每一質(zhì)粒DNA從轉(zhuǎn)化體克隆中制備。
這樣獲得的質(zhì)粒的核苷酸序列作為結(jié)果，使用Big Dye TerminatorKit ver.2(Applied Biosystems制造)分析，證實得到圖6顯示的表達(dá)載體pKANTEX2160Gal0LV0，目的DNA已被克隆到該表達(dá)載體中。
另外，使用VH和VL上的相同的方法制備表達(dá)載體，其中包括HV0的其他FR的氨基酸殘基被修飾。
具體的是，22個表達(dá)載體pKM2160Gal0LV0，pKM2160Gal0LV1，pKM2160Gal0LV2，pKM2160Gal0LV3，pKM2160Gal1LV1，pKM2160Gal1LV3，pKM2160Gal2LV1，pKM2160Gal2LV3，pKM2160Gal3LV1，pKM2160Gal3LV3，pKM2160HV0LV0，pKM2160HV0LV1， pKM2160HV0LV2， pKM2160HV0LV3，pKM2160HV1LV0， pKM2160HV1LV1， pKM2160HV1LV2，pKM2160HV1LV3. pKM2160HV2LV0， pKM2160HV2LV3，pKM2160HV3LV0和pKM2160HV3LV3通過將實施例1的2(1)中構(gòu)建的pKM2160Gal0，pKM2160Gal1，pKM2160Gal2，pKM2160Gal3，pKM2160HV0，pKM2160HV1，pKM2160HV2和pKM2160HV3與實施例1的2(2)中構(gòu)建的pKM2160LV0，pKM2160LV1，pKM2160LV2和pKM2160LV3分別結(jié)合而構(gòu)建。
實施例2在動物細(xì)胞中表達(dá)抗CCR4 CDR移植抗體1.使用COS-7細(xì)胞(ATCC CRL 1651)瞬時表達(dá)抗CCR4 CDR移植抗體(1)在COS-7細(xì)胞中的瞬時表達(dá)使用含有10％FCS的DMEM培養(yǎng)基(Bibco制造)，1×105細(xì)胞/ml的COS-7細(xì)胞以2ml/孔分裝在6孔板(Iwaki Glass制造)中，37℃培養(yǎng)過夜。每100μl OPTI-MEM培養(yǎng)基(Bibco制造)中加入3μl Fu-GENETM 6轉(zhuǎn)移試劑(Roche制造)，其中進(jìn)一步加入1μg實施例1的2(3)項中獲得的22種抗CCR4 CDR移植抗體的表達(dá)載體中的每一種，混合物在室溫下放置15分鐘，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合體。每種反應(yīng)溶液逐滴加入至上述的COS-7細(xì)胞中，完全混合，然后37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)72小時后，回收培養(yǎng)上清液，評價培養(yǎng)上清液中抗CCR4 CDR移植抗體作用的活性。
(2)人CCR4的抗CCR4 CDR移植抗體的反應(yīng)性評價得到的22種抗體的培養(yǎng)上清液的活性如下進(jìn)行評價。
化合物1(SEQ ID NO37)被選作人CCR4細(xì)胞外區(qū)肽，它可與抗CCR4嵌合抗體KM2760反應(yīng)，該抗體是在參考例2中制備的轉(zhuǎn)化體KM2760(FERM BP-7054)產(chǎn)生的。為了在通過ELISA的活性測定中使用化合物1，制備其與BSA(牛血清白蛋白)(Nakalai Tesque制造)的結(jié)合物，并用作抗原。即，在旋渦條件下，25mg/ml SMCC(4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)(Sigma制造)-DMSO溶液100ml逐滴加入至含有10mg BSA的900ml PBS溶液中，并溫和攪拌30分鐘。1ml反應(yīng)溶液應(yīng)用于已用25ml PBS平衡的一個凝膠過濾柱上，如NAP-10柱等，用1.5ml PBS洗脫的洗脫液用作BSA-SMCC溶液(用A280測定計算BSA濃度)。下一步，0.5mg化合物1中加入250ml PBS，然后通過加入250ml DMF使化合物1完全溶解，然后在旋渦條件下加入上述的BSA-SMCC溶液(BSA含量1.25mg)，溫和攪拌3小時。反應(yīng)溶液在PBS中4℃透析過夜，向其中加入疊氮化鈉至終濃度為0.05％，然后得到的混合物使用0.22mm濾器過濾，得到BSA-化合物1溶液。
0.05μg/ml制備的結(jié)合物以50μl/孔分裝至96孔ELISA板(Greiner制造)中，為了吸附，4℃靜置過夜。用PBS漂洗后，以100μl/孔加入含有1％BSA的PBS(此后稱為″1％BSA-PBS″)，在室溫下反應(yīng)1小時以阻斷殘留的活性基團(tuán)。用含有0.05％Tween 20的PBS(此后稱為″Tween-PBS″)漂洗每個孔后，轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清液以50μl/孔加入，在室溫下反應(yīng)1小時。反應(yīng)和隨后用Tween-PBS漂洗每個孔之后，用1％BSA-PBS稀釋6000倍的過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG(γ)抗體溶液(American Qualex制造)作為二抗溶液，以50μl/孔加入，在室溫下反應(yīng)1小時。反應(yīng)和用Tween-PBS漂洗之后，50μl/孔加入ABTS底物溶液(通過在1升0.1M檸檬酸鹽緩沖液(pH4.2)中溶解0.55g 2，2′-疊氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)胺制備的溶液，并正好在使用前加入1μl/ml過氧化氫)以顯色，此后20分鐘通過以50μl/孔加入5％SDS溶液終止反應(yīng)。之后，在415nm測定吸光度。
同樣，為了比較在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的人IgG抗體的濃度，用PBS稀釋2000倍的羊抗人IgG(γ)抗體(American Qualex制造)用作抗原。
結(jié)果在圖7和圖8中顯示。每種人CCR4 CDR移植抗體顯示與人嵌合抗體KM2760幾乎相同的活性。
2.使用動物細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)抗CCR4 CDR-移植抗體使用實施例1的2(3)中獲得的抗CCR4 CDR移植抗體的表達(dá)載體，在動物細(xì)胞中如下表達(dá)抗CCR4 CDR移植抗體。
(1)在大鼠骨髓瘤細(xì)胞系YB2/0細(xì)胞(ATCC CRL 1581)中的穩(wěn)定表達(dá)通過將每種人CDR移植抗體的表達(dá)質(zhì)粒用限制性酶AatII(TOYOBO制造)消化，該表達(dá)質(zhì)粒被制成線性化狀態(tài)，10μg消化產(chǎn)物通過電穿孔(Cytotechnology，3，133(1990))導(dǎo)入4×106個大鼠骨髓瘤細(xì)胞系YB2/0細(xì)胞(ATCC CRL 1581)的細(xì)胞中，然后細(xì)胞在40mlH-SFM(GIBCO-BRL制造)培養(yǎng)基(添加5％胎牛血清(FBS))中，以200μl/孔分配到96孔微量滴定板(Sumitomo Bakelite制造)中。在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)1至3天后，往里加入(G418(Nakalai Tesque制造)至濃度1mg/ml，并繼續(xù)培養(yǎng)1至2周獲得G418抗性轉(zhuǎn)化體。
從顯示G418抗性的轉(zhuǎn)化體克隆變?nèi)诤系目字谢厥张囵B(yǎng)上清液，通過實施例2的1(2)中顯示的ELISA測定培養(yǎng)上清液中抗CCR4人CDR移植抗體的抗原結(jié)合活性。
為了增加抗體表達(dá)量，采用dhfr基因擴(kuò)增系統(tǒng)，在培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)表達(dá)抗CCR4嵌合抗體的孔中的轉(zhuǎn)化體，被懸浮在含有1mg/ml G418和50nM氨甲喋呤(此后稱為“MTX”)的H-SFM培養(yǎng)基中，達(dá)到1到2×105細(xì)胞/ml的密度，以1ml一份分配至24孔板中(Greiner制造)，所述氨甲喋呤是dhfr基因產(chǎn)物二氫葉酸還原酶的抑制劑。在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)1至2周，誘導(dǎo)顯示50nM MTX抗性的轉(zhuǎn)化體。當(dāng)轉(zhuǎn)化體在孔中融合時，通過實例2的1(2)中所示的ELISA測定培養(yǎng)上清液中抗CCR4人CDR移植抗體的抗原結(jié)合活性。關(guān)于在培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)表達(dá)抗CCR4人CCR4移植抗體的孔中的轉(zhuǎn)化體，通過上述方法增加MTX的濃度至100nM，然后增加至200nM，最終獲得能夠在含有1mg/ml G418和200nM MTX的H-SFM培養(yǎng)基中生長，并也能夠高表達(dá)抗CCR4人CDR移植抗體的轉(zhuǎn)化體。對于這樣獲得的轉(zhuǎn)化體，通過限度稀釋分析進(jìn)行單細(xì)胞分離(克隆)，獲得顯示出抗CCR4人CDR移植抗體最高表達(dá)的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞克隆。通過表達(dá)載體pKANTEX2160Gal1LV3基因轉(zhuǎn)變獲得的抗體生產(chǎn)細(xì)胞KM8760和通過表達(dá)載體pKANTEX2160Gal2LV3基因轉(zhuǎn)變獲得抗體生產(chǎn)細(xì)胞KM8759已經(jīng)在2002年7月30日分別作為FERMBP-8130和FERM BP-8129存放在專利生物保藏中心，獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-ChomeTsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本)。
(2)從培養(yǎng)上清液中純化抗CCR4 CDR移植抗體當(dāng)顯示G418抗性的轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)并融合時，培養(yǎng)基改變?yōu)?00至1,100ml含有濃度為5％的Daigo′s GF21(Wako Pure Chemical Industries制造)的H-SFM培養(yǎng)基，然后培養(yǎng)3至5天。當(dāng)融合時，回收培養(yǎng)上清液。通過使用Prosep-A柱(Millipore制造)，根據(jù)附帶的說明書，從大約300至1,100ml培養(yǎng)上清液中純化抗CCR4 CDR移植抗體，獲得純化的蛋白質(zhì)。
3.純化的抗CCR4 CDR移植抗體的活性評價使用來自抗體生產(chǎn)細(xì)胞的抗CCR4 CDR移植抗體來評價活性，所述的細(xì)胞是通過將表達(dá)載體Gal0LV0，Gal0LV1，Gal0LV3，Gal1LV1，Gal1LV3，Gal2LV1，Gal2LV3，Gal3LV1和Gal3LV3導(dǎo)入YB2/0(此后分別簡稱為″Gal0LV0″，″Gal0LV1″，″Gal0LV3″，″Gal1LV1″，″Gal1LV3″，″Gal2LV1″，″Gal2LV3″，″Gal3LV1″和″Gal3LV3″)中獲得的。
(1)測定人CCR4的抗CCR4 CDR移植抗體的結(jié)合活性(ELISA法)以實施例2的1(2)項中所述方法相同的方式進(jìn)行測定。結(jié)果在圖9中顯示。每種抗CCR4 CDR移植抗體顯示與人嵌合抗體KM2760幾乎相同的活性。
(2)抗CCR4 CDR移植抗體與高度表達(dá)CCR4的人體細(xì)胞的反應(yīng)性(熒光抗體技術(shù))2×105或更多的CCR4/EL-4細(xì)胞，從參考例3中獲得的高度CCR4表達(dá)細(xì)胞被分配到96孔板中。通過用FACS緩沖液稀釋每種純化的抗體和防止非特異性染色的人免疫球蛋白(Welfide制造)至濃度分別為10μg/ml和3.75mg/ml，制備抗體溶液，以100μl/孔加入此抗體溶液，在冰中反應(yīng)30分鐘。作為陰性對照，使用10μg/ml抗人IL-5受體α鏈抗體(WO97/10354)。用FACS緩沖液200μl/孔漂洗兩次后，以50μl/孔加入稀釋100倍的PE標(biāo)記的抗人IgG抗體(Coulter制造)。在冰中避光反應(yīng)，用FACS緩沖液200μl/孔漂洗三次后，反應(yīng)產(chǎn)物懸浮在500μl FACS緩沖液中，使用流式細(xì)胞儀測定熒光強(qiáng)度。結(jié)果在圖10中顯示。所有抗CCR4CDR移植抗體顯示與人嵌合抗體KM2760幾乎相同的活性。
(3)測定抗CCR4 CDR移植抗體與人CCR4結(jié)合的活性(BIAcore法)
為了更詳細(xì)的測定結(jié)合活性，如下采用BIAcore2000(BIACORE制造)測定多種純化抗體的結(jié)合活性。在這種情況下，HBS-EP(BIACORE制造)用作稀釋樣品和測定的緩沖液。首先，0.05μg/ml化合物1溶液5μl作為生物素化的CCR4部分肽，以5μl/分的流速加入至傳感器頭SA(BIACORE制造)上，并固定在傳感器頭上。
4μg/ml每種純化抗體溶液20μl，以5μl/分的流速加入到制備的生物素化的化合物1-固定的傳感器頭上，添加完畢后，監(jiān)測解離反應(yīng)4分鐘，然后通過兩次添加5μl 10mM HCl再生傳感器頭的表面。使用這種方法，就獲得了化合物1的結(jié)合反應(yīng)曲線(sensorgram)。
結(jié)果在圖11中顯示。縱坐標(biāo)代表共振單位(RU)，表示傳感器頭上的質(zhì)量變化。例如，1,000RU對應(yīng)大約1ng/mm2蛋白質(zhì)的質(zhì)量變化。顯示KM2760具有顯著穩(wěn)定的和高的結(jié)合活性，因為化合物1顯示了時間依賴性的結(jié)合活性，很難在解離反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)其結(jié)合的解離。另一方面，每種抗CCR4 CDR移植抗體顯示了與人嵌合抗體KM2760幾乎相同的解離反應(yīng)，但在化合物1與CCR4部分肽的結(jié)合反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)活性有輕微的降低。單獨移植CDR的抗CCR4 CDR移植抗體GalOLV0顯示最低的結(jié)合活性，F(xiàn)R氨基酸殘基的修飾可增加結(jié)合活性。結(jié)果顯示制備保持抗原結(jié)合活性和鼠抗體結(jié)合特異性的抗CCR4 CDR移植抗體，可通過將鼠抗體KM2160的CDR移植至合適的人抗體FR上，制備具有較高結(jié)合活性的抗CCR4 CDR移植抗體，可根據(jù)抗體V區(qū)的三維結(jié)構(gòu)等鑒定對結(jié)合活性很重要的FR氨基酸殘基，并將它們與CDR移植在一起。預(yù)計在本實施例中制備的抗CCR4 CDR移植抗體與CCR4具有很高的結(jié)合活性，與鼠抗體和人嵌合抗體相比在人體中的免疫原性下降，并具有很高的安全性和很高的治療效應(yīng)。
2.抗CCR4 CDR移植抗體的體外細(xì)胞毒活性(ADCC活性)為了評價實施例2的2(2)中獲得的純化的抗CCR4 CDR移植抗體的體外細(xì)胞毒活性，如下測定其ADCC活性。
(1)制備靶細(xì)胞懸液在參考例3中獲得的人CCR4高表達(dá)細(xì)胞CCR4/EL-4培養(yǎng)在含有10％FCS，和0.5mg/ml G418的RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO制造)中，達(dá)到1×106細(xì)胞/0.5ml的密度。往里加入1.85MBq當(dāng)量的放射性鉻酸鈉(Na251CrO4)(Daiichi Pure Chemicals制造)，混合物在37℃反應(yīng)1.5小時，使同位素標(biāo)記細(xì)胞。反應(yīng)后，將其在RPMI1640培養(yǎng)基中的懸浮并離心洗滌三次，重新懸浮在培養(yǎng)基中，然后在冰中4℃孵育30分鐘，自然釋放放射性物質(zhì)。離心后，往里加入5ml含有10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基，達(dá)到2×105細(xì)胞/ml的密度，作為靶細(xì)胞懸液。
(2)制備效應(yīng)細(xì)胞懸液使用含有200單位(200μl)肝素鈉注射液(Takeda Pharmaceutical制造)的注射器收集健康人的外周血(60ml)。用相同體積的生理鹽水(Otsuka Pharmaceutical制造)將其稀釋兩倍，總量達(dá)到120ml。Lymphoprep(NYCOMED制造)以5ml分配至12管15ml容量的離心管(Sumitomo Bakelite制造)中，在其上面鋪10ml稀釋的外周血，混合物在室溫下800×g離心20分鐘。從所有離心管中收集血漿層和Lymphoprep層之間的PBMC部分，懸浮在含有1％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基(此后稱為″1％FCS-RPMI″)中，4℃，400×g，5分鐘離心兩次洗滌，然后重懸達(dá)到5×106細(xì)胞/ml的密度，用作效應(yīng)細(xì)胞。
(3)測定ADCC活性在(1)中制備的靶細(xì)胞懸液以50μl(1×104細(xì)胞/孔)分配進(jìn)U型底96孔板(Falcon制造)的孔中。下一步，在(2)中制備的效應(yīng)細(xì)胞以100μl進(jìn)行分配(5×105細(xì)胞/孔，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比率為501)。下一步，加入每種抗CCR4嵌合抗體達(dá)到終濃度為0.1ng/ml至10ug/ml，混合物在37℃反應(yīng)4小時。反應(yīng)后，平板離心，每孔100μl上清液中51Cr的量通過γ-計數(shù)器來測定。以上述相同的方式，只是使用培養(yǎng)基代替效應(yīng)細(xì)胞懸液和抗體溶液，并測定上清液中的51Cr的量，計算自然解離的51Cr的量。以上述相同的方式，只是加入培養(yǎng)基代替抗體溶液，和1N鹽酸代替效應(yīng)細(xì)胞懸液，測定上清液中51Cr的量，計算總解離51Cr的量。ADCC活性通過下列的等式計算
結(jié)果在圖12中顯示。如在圖12中所示，抗CCR4 CDR移植抗體具有很強(qiáng)的抗體濃度依賴性的細(xì)胞毒活性。
5.抑制人PBMC產(chǎn)生細(xì)胞因子的效果使用抗CCR4 CDR移植抗體Gal1LV3和嵌合抗體KM2760檢測抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生的效果?？笽L-5R抗體用作陰性對照。
以實施例2的4(2)中的相同方式分離PBMC，并以1×106細(xì)胞/孔分配進(jìn)U型底96孔板中，加入評價的抗體至終濃度為1μg/ml，總量調(diào)整至200μl/孔。在37℃共培養(yǎng)24小時，氣流為5％CO2，誘導(dǎo)ADCC活性。培養(yǎng)后，去除100μl上清液，加入100μl含有100ng/ml PMA(佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯)和2μg/ml離子霉素(SIGMA制造)的培養(yǎng)基，至終濃度為50ng/ml PMA和1μg/ml離子霉素，刺激細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生。引入每次刺激后，培養(yǎng)24小時，回收培養(yǎng)上清液，使用細(xì)胞因子檢測試劑盒(Biosource制造)測定IL-4，IL-13和干擾素(IFN)-γ。產(chǎn)生的抑制比例的計算是通過在缺少抗體時每種細(xì)胞因子產(chǎn)生的定義為0％抑制率，結(jié)果在圖13中顯示。如在圖13中所示，類似于嵌合抗體KM2760，加了抗CCR4CDR移植抗體Gal1LV3的組明顯抑制Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-13的產(chǎn)生，但對Th1細(xì)胞因子IFN-γ的影響很小。
此結(jié)果顯示通過有效活化人效應(yīng)細(xì)胞，每種抗CCR4 CDR移植抗體可減少或除去表達(dá)CCR4的Th2細(xì)胞，并作為結(jié)果，具有抑制Th2細(xì)胞產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子的效應(yīng)，因此可用于治療或診斷人Th2介導(dǎo)的免疫疾病如支氣管哮喘，異位性皮炎和類似疾病。
6.分析人血小板的反應(yīng)性(1)分離人血小板向從健康人中收集的血樣品中加入1/10體積的3.2％檸檬酸鈉，并完全混合。以5ml的量將血分配進(jìn)15ml容量管(Greiner制造)中，室溫下90×g離心10分鐘。收集上清液，進(jìn)一步在室溫下1,950×g離心10分鐘。棄去上清液后，在FACS緩沖液中懸浮沉淀物，室溫下1,190×g離心5分鐘洗滌沉淀物。再次在FACS緩沖液中懸浮沉淀物，以相同的方式離心，然后沉淀形式的血小板使用FACS緩沖液調(diào)整至大約1×107沉淀/ml的密度。
(2)血小板染色實施例2的3項中獲得的每種純化的抗CCR4人CDR移植抗體加入100μl的6(1)項中獲得的血小板懸液中至濃度10μg/100μl，在室溫下避光反應(yīng)30分鐘。作為對比的對照，每種抗CCR4人嵌合抗體KM2760和抗鼠抗體1G1抗體(Pharmingen制造)與100ml相同濃度的血小板懸液反應(yīng)。反應(yīng)后，向每個15ml容量管中加入2ml FACS緩沖液，攪拌混合物，然后840×g4℃離心5分鐘洗滌。棄去上清液后，再次執(zhí)行相同的操作。加入20μl用FACS緩沖液稀釋50倍的PE-標(biāo)記的抗鼠IgG抗體(Coulter制造)至含有與每種人CDR移植抗體和KM2760反應(yīng)的樣品的管中，在室溫下避光反應(yīng)30分鐘。關(guān)于含有與1G1抗體反應(yīng)的樣品的管，進(jìn)一步加入50倍稀釋的PE標(biāo)記的抗鼠IgG抗體(DAKO制造)20μl，在室溫下避光反應(yīng)30分鐘。
反應(yīng)后，向每管中加入2ml FACS緩沖液，然后攪拌，4℃下混合物840×g離心5分鐘洗滌。棄去上清液后，再次執(zhí)行相同的操作。將殘留物懸浮在500μl FACS緩沖液后，使用流式細(xì)胞儀EPICSXL-MCL(Beckman Coulter制造)測定熒光強(qiáng)度。
結(jié)果在圖14中顯示。作為對比性對照的1G1抗體顯示與血小板的反應(yīng)性，但所有抗CCR4人CDR移植抗體類似于抗CCR4人嵌合抗體KM2760并不顯示與人血小板的特異反應(yīng)性。
參考例1制備產(chǎn)生鼠抗CCR4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生鼠抗CCR4單克隆抗體KM2160(.，11，81(1999))的雜交瘤細(xì)胞根據(jù)下面的步驟產(chǎn)生。
(1)制備抗原人CCR4(此后稱為“hCCR4”)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQ ID NO48)使用Genetyx Mac來分析，在有高親水性，N末端和C末端的部分中選擇認(rèn)為適合作為抗原的化合物2(SEQ ID NO36)作為部分序列。
(2)制備免疫原為了增加參考例1(1)中獲得的hCCR4部分肽的免疫原性，通過下列方法制備它與KLH(Calbiochem)的結(jié)合物后，它被用作免疫原。具體是，KLH溶解在PBS中達(dá)到濃度10mg/ml，往里逐滴加入1/10體積的25mg/ml MBS(Nakalai Tesque制造)，通過攪拌混合物反應(yīng)30分鐘。通過凝膠過濾柱如Sephadex G-25柱去掉游離的MBS，該柱預(yù)先用PBS或類似物平衡，得到的2.5mg KLH-MB與溶解在0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中的1mg肽混合，然后室溫下攪拌3小時。反應(yīng)后，在PBS中透析混合物。
(3)免疫動物，生產(chǎn)抗體產(chǎn)生細(xì)胞參考例1(2)中制備的肽-KLH結(jié)合物100μg與2mg鋁凝膠和1×109個百日咳疫苗細(xì)胞(Chiba Serum Institute制備)一起給予5-周齡雌性小鼠(Balb/c)，2周后，每周給予一次100μg結(jié)合物，總共4次。從每只動物的眼底靜脈叢中抽取血樣，通過下面所述的酶免疫測定檢測血清效價，最后一次免疫后3天從小鼠身上切下脾臟，其顯示充分的抗體效價。最后給藥后第三天從小鼠中切下脾臟，并在MEM(Nissui Pharmaceutical制造)中切碎，使用一鑷子將細(xì)胞弄散，離心(1,200rpm，5分鐘)，去掉上清液，然后用3ml Tris-氯化銨緩沖液(pH7.65)處理1至2分鐘去除紅細(xì)胞。剩余的細(xì)胞進(jìn)一步用MEM漂洗3次，作于細(xì)胞融合。
(4)制備鼠骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)8-氮鳥嘌呤抗性的鼠骨髓瘤細(xì)胞系，P3X63Ag8U.1(ATCCCRL-1597，此后稱為″P3-U1″)，并在細(xì)胞融合中用作親代細(xì)胞系。
(5)制備雜交瘤細(xì)胞在參考例1(3)和(4)中獲得的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞以10∶1的比例混合，然后離心(1,200rpm，5分鐘)去掉上清液，在37℃下，這種沉淀的細(xì)胞每108脾細(xì)胞中加入0.5ml聚乙二醇溶液(含有2g聚乙二醇-1000，2mlMEM和0.7ml DMSO的溶液)，然后完全懸浮。此后，間隔1至2分鐘，幾次加入1至2ml MEM，終體積用MEM調(diào)整至50ml。離心(900rpm，5分鐘)去上清液后，沉淀懸浮在100ml HAT培養(yǎng)基中，以100μl/孔分配在96孔微量滴定板(Sumitomo Bakelite制造)中，然后在5％CO2的培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)10至14天。使用可觀察到融合細(xì)胞增殖的孔，通過ELISA(抗體(Antibodies)實驗室手冊(A Laboratory Manual)，ColdSpring Harbor Laboratory，第14章(1988)，單克隆抗體(MonoclonalAntibodies)原理和實踐(Principles and Practice)，Academic PressLimited(1966)等)測定在培養(yǎng)上清液中與hCCR4部分肽(化合物2)的結(jié)合活性。活性被確定的孔通過總共兩次限度稀釋克隆，一次改變培養(yǎng)基為HT培養(yǎng)基，然后改變培養(yǎng)基為正常培養(yǎng)基。以此方式，獲得了產(chǎn)生鼠抗體KM2160的雜交瘤細(xì)胞KM2160。KM2160與hCCR4部分肽(化合物2)特異反應(yīng)。
參考例2制備抗CCR4嵌合抗體1.分離和分析編碼抗CCR4鼠抗體V區(qū)的cDNA(1)從產(chǎn)生抗CCR4鼠抗體的雜交瘤細(xì)胞中制備mRNA從參考例1中所述的雜交瘤細(xì)胞KM2160中制備mRNA。根據(jù)產(chǎn)品說明書，使用mRNA制備試劑盒Fast Track mRNA分離試劑盒(Invitrogen制造)，從8×107個雜交瘤細(xì)胞KM2160中制備大約48μg mRNA。
(2)制備抗CCR4鼠抗體的H鏈和L鏈cDNA文庫根據(jù)產(chǎn)品說明書，使用cDNA合成試劑盒(Amersham PharmaciaBiotech制造)從參考例2的1(1)中獲得的5μg KM2160mRNA中合成在兩個末端都具有EcoRI-NotI適配子(adapter)的cDNA。由此制備的cDNA溶解在20μl無菌水中，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGEN制備)分別回收對應(yīng)IgG型抗體的H鏈的大約1.5kb的cDNA片段，和對應(yīng)κ型L鏈的大約1.0kb的cDNA片段。下一步，使用EcoRI/CIAP預(yù)消化處理的λZAPII載體試劑盒(Stratagene制造)，每0.1μg大約1.5kb的cDNA片段和0.1μg大約1.0kb的cDNA片段連接于1μgλZAPII載體，該載體根據(jù)產(chǎn)品的說明書已經(jīng)用限制性酶EcoRI消化，末端用小牛腸堿性磷酸酶脫磷酸化。連接后，根據(jù)產(chǎn)品的說明書，使用GigapackIII Gold Packing Extract(Stratagene制造)，2.5μl每種反應(yīng)溶液被包裝進(jìn)λ噬菌體中，然后用合適量的此噬菌體感染大腸桿菌XL1-Blue(Biotechniques，5，376(1987))，獲得9.3×104噬菌體克隆作為KM2160的H鏈cDNA文庫，7.4×104噬菌體克隆作為L鏈cDNA文庫。然后根據(jù)產(chǎn)品的說明書每個噬菌體被固定在尼龍濾膜(nylon membranefilter)Hybond-N+(Amersham Pharmacia Biotech制造)上。
(3)克隆抗CCR4鼠抗體的H鏈和L鏈cDNA使用ECL直接核酸標(biāo)記和檢測系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech制造)，根據(jù)產(chǎn)品的說明書，在參考例2的1(2)中制備的尼龍濾膜上的KM2160 H鏈cDNA文庫和L鏈cDNA文庫的克隆，用鼠抗體(H鏈?zhǔn)鞘驝γl cDNA的BamHI-EcoRI片段(EMBO J.，3，2047(1984))，L鏈?zhǔn)荂κcDNA的HpaI-EcoRI片段(Cell，22，197(1980))C區(qū)的cDNA作為探針進(jìn)行探測，每一H鏈和L鏈中獲得與探針強(qiáng)結(jié)合的噬菌體的10個克隆。下一步，根據(jù)產(chǎn)品的說明書，使用λZAPII克隆試劑盒(Stratagene制造)，每個噬菌體克隆通過體內(nèi)切割法轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)粒。使用BigDye終止子循環(huán)測序FS備用反應(yīng)試劑盒(PE Biosystems制造)，以這種方式獲得的每種質(zhì)粒中含有的cDNA的核苷酸序列用相同生產(chǎn)廠家的DNA測序儀ABIPRISM 377，根據(jù)產(chǎn)品的說明書來分析。結(jié)果，獲得了含有H鏈全長功能性cDNA的質(zhì)粒pKM2160H4，和含有L鏈全長cDNA的質(zhì)粒pKM2160L6，其中ATG序列被認(rèn)為是存在于cDNA 5’末端的起始密碼子。
(4)分析抗CCR4鼠抗體V區(qū)的氨基酸序列包含在質(zhì)粒pKM2160H4中的H鏈V區(qū)的全長核苷酸序列，由其推測的H鏈V區(qū)的全長氨基酸序列，包含在質(zhì)粒pKM2160L6中的L鏈V區(qū)的全長核苷酸序列，由此推測的L鏈V區(qū)的全長氨基酸序列分別表示為SEQ ID NO61，62，63和64。根據(jù)與已知鼠抗體的序列數(shù)據(jù)的比較(Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dept.Health andHuman Services(1991))，與使用蛋白質(zhì)測序儀(PPSQ-10，Shimadzu制造)進(jìn)行的純化抗CCR4鼠抗體KM2160的H鏈和L鏈N末端氨基酸序列分析的結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)由此分離的每種cDNA是編碼含有分泌信號序列的抗CCR4鼠抗體KM2160的全長cDNA，該信號序列是在H鏈的氨基酸序列中1-19位的氨基酸，由SEQ ID NO15表示，在L鏈的氨基酸序列中1-19位的氨基酸，由SEQ ID NO25表示。
下一步，檢測抗CCR4鼠抗體KM2160的H鏈和L鏈的V區(qū)氨基酸序列的新穎性。使用GCG程序包(版本9.1，Genetics Computer Group制造)作為序列分析系統(tǒng)，用BLAST法搜索已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(Nucleic Acids Res.，25，3389(1997))。結(jié)果，H鏈和L鏈都沒有發(fā)現(xiàn)完全相同的序列，這樣證實了抗CCR4鼠抗體KM2160的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)是新的氨基酸序列。
通過比較已知抗體的氨基酸序列也確定了抗CCR4鼠抗體KM2160的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的CDR?？笴CR4鼠抗體KM2160H鏈V區(qū)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分別表示為SEQ ID NO1，2和3，L鏈V區(qū)中的CDR1，CDR2和CDR3氨基酸序列分別表示為SEQ ID NO5，6和7。
2.使用動物細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)抗CCR4嵌合抗體(1)構(gòu)建抗CCR4嵌合抗體表達(dá)載體pKANTEX2160抗CCR4嵌合抗體表達(dá)載體pKANTEX2160構(gòu)建如下，使用表達(dá)人IgG1和K型抗體的人源化抗體表達(dá)載體pKANTEX2160H4和參考例2的1(3)中獲得的質(zhì)粒pKM2160H4和pKM2160L6。
通過PCR設(shè)計具有SEQ ID NO65和66所示的核苷酸序列的合成DNA，以獲得KM2160的H鏈V區(qū)cDNA，另一個合成DNA具有SEQ IDNO67和68所示核苷酸序列，以獲得L鏈V區(qū)cDNA。每個合成DNA為了克隆進(jìn)pKANTEX93，在其5’末端含有一個限制性酶識別序列，DNA的合成委托給Genset Inc.。參考例2的1(3)中獲得的質(zhì)粒pKM2160H4(20ng)加入至含有50μl PCR緩沖液#1，該緩沖液是KOD DNA聚合酶(TOYOBO制造)附帶的，0.2mM dNTPs，1mM氯化鎂和0.5μM具有SEQ ID NO11和12所示核苷酸序列的合成DNA的緩沖液中，混合物在94℃加熱3分鐘。加入2.5單位KOD DNA聚合酶(TOYOBO制造)后，混合物反應(yīng)25個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃加熱30秒，58℃30秒，74℃1分鐘，使用DNA熱循環(huán)儀GeneAmp PCR系統(tǒng)9600(PERKIN ELMER制造)。以相同的方式，20ng參考例2的1(3)中獲得的質(zhì)粒pKM2160L6加入至含有50μl PCR緩沖液#1，該緩沖液是KOD DNA聚合酶(TOYOBO制造)附帶的，0.2mM dNTPs，1mM氯化鎂和0.5μM具有SEQ ID NO67和68所示核苷酸序列的合成DNA的緩沖液中，PCR以上述相同的方式進(jìn)行。反應(yīng)溶液(10ul)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGEN制造)回收每一個大約0.46kb的H鏈V區(qū)的PCR產(chǎn)物和大約0.43kb的L鏈V區(qū)的PCR產(chǎn)物。
下一步，通過用限制性酶Smal(Takara Shuzo制造)消化質(zhì)粒pBluescript SK(-)(Stratagene制造)，獲得的0.1μg DNA，和上面獲得的大約0.1μg每種PCR產(chǎn)物加入至無菌水中，至終體積7.5μl，往里加入7.5μl TAKARA DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo制造)的溶液I和0.3μl限制性酶Smal，混合物22℃反應(yīng)過夜。使用得到的重組質(zhì)粒DNA溶液，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(TOYOBO制造)。每一質(zhì)粒DNA從轉(zhuǎn)化體克隆中制備，使用BigDye終止子循環(huán)測序儀FS備用反應(yīng)試劑盒(PEBiosystems制造)，根據(jù)產(chǎn)品的說明書進(jìn)行反應(yīng)，核苷酸序列使用相同廠家的DNA測序儀ABI PRISM 377來分析。因此獲得了圖15中顯示的具有所需核苷酸序列的質(zhì)粒pKM2160的VH41和pKM2160的VL61。
下一步，3μg人源化抗體表達(dá)載體pKANTEX93和3ug上面獲得的pKM2160的VH41加入至含有30μl 10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM氯化鎂和1mM DTT的緩沖液中，向其中加入10單位限制性酶ApaI(Takara Shuzo制造)，混合物在37℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)溶液用乙醇沉淀，得到的沉淀加入至含有10μl 50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM氯化納，10mM氯化鎂，1mM DTT，100μg/ml BSA和0.01％Triton X-100的緩沖液中，向其中加入10單位限制性酶NotI(Takara Shuzo制造)，混合物在37℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)混合物通過瓊脂糖凝膠電泳分離，分別回收pKANTEX93和pKM2160的VH41的大約12.75kb和大約0.44kb的ApaI-NotI片段。由此獲得的兩個片段使用TAKARA DNA連接試劑盒Ver.2，根據(jù)產(chǎn)品的說明書進(jìn)行連接，使用得到的重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(TOYOBO制造)。每一質(zhì)粒DNA從轉(zhuǎn)化體克隆中制備，通過限制性酶處理證實，獲得圖16中的質(zhì)粒pKANTEX2160H，其中已經(jīng)插入了所需的大約0.44kb的ApaI-NotI片段。
下一步，3μg pKANTEX2160H和3μg從上面獲得的pKM2160的VL61加入至含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM氯化鈉，10mM氯化鎂，1mM DTT和100μg/ml BSA的緩沖液中，調(diào)整溶液的總體積至30μl，向其中加入10單位限制性酶BsiWI(New England Biolabs制造)，混合物在55℃反應(yīng)1小時。然后向其中加入限制性酶EcoRI(Takara Shuzo制造)，混合物在37℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)混合物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，分別回收pKANTEX2160H和pKM2160的VL61的大約13.20kb和大約0.41kb的EcdRI-BsiWI片段。由此獲得的兩個片段使用TAKARA DNA連接試劑盒Ver.2，根據(jù)產(chǎn)品的說明書進(jìn)行連接，用得到的重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(TOYOBO制造)。每一質(zhì)粒DNA從轉(zhuǎn)化體克隆中制備，通過限制性酶處理證實，獲得圖17中的質(zhì)粒pKANTEX2160，其中已經(jīng)插入了所需的大約0.41kb的EcoRI-BsiWI片段。當(dāng)質(zhì)粒使用BigDye終止子循環(huán)測序儀FS備用反應(yīng)試劑盒(PEBiosystems制造)，根據(jù)產(chǎn)品的說明書進(jìn)行反應(yīng)時，其核苷酸序列使用相同廠家的DNA測序儀ABI PRISM 377來分析，證實已經(jīng)獲得了所需的質(zhì)粒，編碼KM2160 H鏈和L鏈V區(qū)的cDNA已經(jīng)被克隆進(jìn)質(zhì)粒中。
(2)使用動物細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)抗CCR4嵌合抗體如下所述，使用參考例2的2(1)中獲得的抗CCR4嵌合抗體表達(dá)載體pKANTEX2160，在動物細(xì)胞中表達(dá)抗CCR4嵌合抗體。
通過用限制性酶AatII(TOYOBO制造)消化，質(zhì)粒pKANTEX2160轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性形式，其10μg通過電穿孔被導(dǎo)入進(jìn)4×106個鼠骨髓瘤細(xì)胞系YB2/0(ATCC CRL1662)中(Cytotechnology，3，133(1990))，細(xì)胞懸浮在40ml H-SFM(GIBCO-BRL制造)培養(yǎng)基(添加5％FCS)中，并以200μl/孔分配于96孔微量滴定板(Sumitomo Bakelite制造)中。在5％CO2的培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)(incubation)24小時后，加入G418至濃度1mg/ml，然后培養(yǎng)1至2周。從出現(xiàn)G418抗性轉(zhuǎn)化體克隆，并融合的孔中回收培養(yǎng)上清液，上清液中抗CCR4嵌合抗體的抗原結(jié)合活性用參考例2的2(3)中所示的ELISA來檢測(過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG(γ)抗體用作二抗)。
為了增加抗體的表達(dá)量，使用dhfr基因擴(kuò)增系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)上清液中有抗CCR4嵌合抗體表達(dá)的孔中的轉(zhuǎn)化體懸浮在含有1mg/ml G418和50nM氨甲喋呤(此后稱為″MTX″Sigma制造)的H-SFM培養(yǎng)基中，至1到2×105細(xì)胞/ml的密度，氨甲喋呤是dhfr基因產(chǎn)物二氫葉酸還原酶的抑制劑，懸液以1ml分配進(jìn)24孔板的孔中(Greiner制造)?；旌衔镌?7℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1至2周，因此誘導(dǎo)出對50nM MTX顯示抗性的轉(zhuǎn)化體。當(dāng)轉(zhuǎn)化體在孔中融合時，培養(yǎng)上清液中抗CCR4嵌合抗體的抗原結(jié)合活性用參考例2的2(3)中所示的ELISA來測定。對于在培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)有抗CCR4嵌合抗體的表達(dá)的孔中的轉(zhuǎn)化體，MTX濃度增加至100nM，然后以相同的方式增加至200nM，最終獲得的轉(zhuǎn)化體可在含有1mg/ml G418和200nM MTX的H-SFM培養(yǎng)基生長，并能高表達(dá)抗CCR4嵌合抗體由此得到的轉(zhuǎn)化體通過兩次限度稀釋測定進(jìn)行單細(xì)胞分離(克隆)，具有最高的抗CCR4嵌合抗體表達(dá)的轉(zhuǎn)化體克隆命名為KM2760。KM2760的抗CCR4嵌合抗體表達(dá)量大約為5μg/106細(xì)胞/24小時。另外，KM2760抗體的H鏈C區(qū)屬于人IgG1亞型。KM2760已經(jīng)在國際上作為FERM BP-7054，于2000年2月24日，存放在國際生物科學(xué)和人類技術(shù)學(xué)會(National Institute of Bioscience and Human andHuman Technology，)，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)(Agency of Industrial Scienceand Technology)，世界貿(mào)易和工業(yè)部(Ministry of International Trade andIndustry)(現(xiàn)名專利生物保藏中心，獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所)(Higashi 1-1-3，Tsukuba-shi，Ibaraki Prefecture，日本(現(xiàn)地址AISTTsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305-8566 Japan))。
參考例3建立高表達(dá)hCCR4的細(xì)胞(1)構(gòu)建動物細(xì)胞表達(dá)載體CAG-pcDNA3如下所述，通過產(chǎn)生表達(dá)載體(CAG-pcDNA3)而構(gòu)建表達(dá)載體，其中動物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3(INVITROGEN制造)的啟動子區(qū)從巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子改變?yōu)镃AG(AG(修飾的雞β肌動蛋白)啟動子，含有CMV-IE增強(qiáng)子)，并將CCR4基因插入至載體中。
pcDNA3(5μg)與限制性酶NruI(Takara Shuzo制造)在37℃反應(yīng)1小時，然后通過乙醇沉淀回收DNA片段。下一步，它們與限制性酶HindIII(Takara Shuzo制造)37℃反應(yīng)1小時，然后通過瓊脂糖凝膠電泳分離，回收含有無CMV啟動子區(qū)的大約5.8kb的DNA片段。具有CAG啟動子區(qū)的質(zhì)粒CAG-pBluescript IIKS(+)(Nuc.Acid Res.，23，3816(1995))(3μg)與限制性酶SalI(Takara Shuzo制造)在37℃反應(yīng)1小時，然后通過乙醇沉淀回收DNA片段。它們用DNA平末端試劑盒(TakaraShuzo制造)平末端化，進(jìn)一步與HindIII 37℃反應(yīng)1小時，然后通過瓊脂糖凝膠電泳分離，回收含有CAG啟動子區(qū)的大約1.8kb的DNA片段。分別回收的DNA片段用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo制造)進(jìn)行連接，采用得到的重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得質(zhì)粒CAG-pcDNA3。
(2)構(gòu)建hCCR4表達(dá)載體如下所述，用參考例2的3(1)中獲得的CAG-pcDNA3和hCCR4DNA-插入的pcDNA3(CCR4/pcDNA3)構(gòu)建hCCR4表達(dá)載體。CAG-pcDNA3和CCR4/pcDNA3都在37℃與HindIII反應(yīng)1小時，通過乙醇沉淀回收DNA片段。下一步，它們與BglII(Takara Shuzo制造)37℃反應(yīng)1小時，然后通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收含有CAG啟動子區(qū)的大約2.0kb的DNA片段，和含有hCCR4基因區(qū)的大約5.5kb的DNA片段。此后，以參考例2的3(1)中的相同方式，使用那兩種DNA片段，獲得質(zhì)粒CAG-CCR4/pcDNA3。
(3)動物細(xì)胞中hCCR4的表達(dá)如參考例2的2(2)中所述的相同方式，通過電穿孔將質(zhì)粒導(dǎo)入進(jìn)動物細(xì)胞中。EL-4細(xì)胞(ATCC TIB-39)懸浮在PBS(-)(GIBCO-BRL制造)中至1×107細(xì)胞/500μl的密度，向其中加入在參考例2的3(2)中獲得的10μg CAG-CCR4/pcDNA3，混合物在冰中孵育10分鐘，然后置入專用的杯中(Bio-Rad制造)，在260V和500μFD下進(jìn)行基因?qū)搿；旌衔镞M(jìn)一步在冰中孵育10分鐘后，細(xì)胞懸浮在200ml 10％FCS-RPMI培養(yǎng)基中，并以200μl/孔分配進(jìn)96孔板中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，從每孔中移去100μl培養(yǎng)上清液，以100μl/孔加入含有1mg/ml G418的10％FCS-RPMI培養(yǎng)基，得到終濃度為0.5mg/ml。兩周后，選擇10和100之間的單個克隆，并再次培養(yǎng)。
(4)選擇hCCR4高表達(dá)的細(xì)胞使用參考例1的(5)中制備的KM2160通過免疫熒光法選擇它們。選擇出的數(shù)十個基因已導(dǎo)入的克隆中的每一種取2×105細(xì)胞分配進(jìn)U形96孔板中。通過已知方法用生物素標(biāo)記的KM2160(酶抗體方法(EnzymeAntibody Method)，Gakusai Kikaku出版)用FACS緩沖液(1％BSA-PBS，0.02％EDTA，0.05％NaN3，pH7.4)稀釋為5μg/ml，人IgG(Welfide制造)稀釋為3.75mg/ml以防止非特異性染色，由此稀釋的每種抗體溶液以200μl/孔進(jìn)行分配，混合物在冰中反應(yīng)30分鐘。作為陰性對照，使用相同濃度的生物素化的抗IL-5R抗體(WO97/10354)。用緩沖液200μl/孔漂洗兩次后，鏈親和素(streptoavidin)-PE(Becton Dickinson Japan制造)以20μl/孔進(jìn)行分配。避光在冰上反應(yīng)30分鐘后，細(xì)胞以200μl/孔漂洗3次，最終懸浮至500μl，通過流式細(xì)胞儀測定熒光密度，選擇具有最高熒光強(qiáng)度的細(xì)胞系。使用的具有最高熒光強(qiáng)度的細(xì)胞系作為CCR4/EL-4。
當(dāng)發(fā)明已被詳細(xì)描述時，根據(jù)其具體的實施例，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說它將是顯而易見的，即在那里可作各種不偏離本發(fā)明的精神和范圍的改變和修飾。所有引用的參考文獻(xiàn)在此完整合并。
本申請是根據(jù)在2001年8月31日提交的日本申請2001-265144號，其全部內(nèi)容在此合并為參考文獻(xiàn)。
工業(yè)應(yīng)用性如上所述，根據(jù)本發(fā)明，其中可與人CCR4特異結(jié)合的重組抗體或其抗體片段，含有CCR4的新CDR。本發(fā)明的抗體可用診斷或治療CCR4相關(guān)疾病。具體是，通過免疫細(xì)胞染色，可用于免疫學(xué)檢測人Th2細(xì)胞，并可診斷或治療所有Th2介導(dǎo)的免疫疾病，包括支氣管哮喘和異位性皮膚疾病，由于Th2細(xì)胞的異常平衡和包括血癌如白血病在內(nèi)的癌癥引起病情進(jìn)展的疾病。
序列列表正文SEQ ID NO4--人工序列的說明合成肽SEQ ID NO8--人工序列的說明合成肽SEQ ID NO9--人工序列的說明合成肽SEQ ID NO10-人工序列的說明合成肽SEQ ID NO11-人工序列的說明合成肽
SEQ ID NO12-人工序列的說明合成肽SEQ ID NO13-人工序列的說明合成肽SEQ ID NO14-人工序列的說明合成肽SEQ ID NO16-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO17-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO18-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO19-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO20-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO21-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO22-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO23-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO24-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO26-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO27-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO28-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO29-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO30-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO31-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO32-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO33-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO34-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO35-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO38-人工序列的說明合成肽SEQ ID NO39-人工序列的說明合成肽SEQ ID NO40-人工序列的說明合成肽SEQ ID NO41-人工序列的說明合成肽SEQ ID NO42-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO43-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO44-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO45-人工序列的說明合成DNA
SEQ ID NO46-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO47-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO49-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO50-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO51-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO52-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO53-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO54-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO55-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO56-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO57-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO58-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO59-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO60-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO65-人工序列的說明合成DNASEQ ID NO66--人工序列的說明合成DNASEQ ID NO67--人工序列的說明合成DNASEQ ID NO68--人工序列的說明合成DNASEQ ID NO69--人工序列的說明合成DNASEQ ID NO70--人工序列的說明合成肽SEQ ID NO71--人工序列的說明合成肽SEQ ID NO72--人工序列的說明合成肽SEQ ID NO73--人工序列的說明合成肽SEQ ID NO74--人工序列的說明合成肽SEQ ID NO75--人工序列的說明合成肽SEQ ID NO76--人工序列的說明合成肽SEQ ID NO77--人工序列的說明合成肽SEQ ID NO78--人工序列的說明合成肽序列表<110>協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社(KYOWA HAKKO KOGYO CO.LTD.)<120>人CDR-移植抗體及其抗體片段<130>P-41263<140>日本2001-265144<141>2001-08-31<160>83<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>5<212>PRT<213>小鼠(Mus Musculus)<400>1Asn Tyr Gly Met Ser1<210>2<211>17<212>PRT<213>小鼠(Mus Musculus)<400>2Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>3<211>10<212>PRT<213>小鼠(Mus Musculus)<400>3His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr1 5 10<210>4<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽
<400>4Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr20 25 30Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>5<211>16<212>PRT<213>小鼠(Mus Musculus)<400>5Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu1 5 10 15<210>6<211>7<212>PRT<213>小鼠(Mus Musculus)<400>6Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser1 5<210>7<211>9<212>PRT<213>小鼠(Mus Musculus)<400>7
Phe Gln Gly Ser Leu Leu Phe Trp Thr1 5<210>8<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>8Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile20 25 30Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110<210>9<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>9Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr20 25 30Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys85 90 95Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>10<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>10Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr20 25 30Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>11<211>119<212>PRT<213>人工序列 合成肽
<220>
<223>合成肽<400>11Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr20 25 30Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys85 90 95Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>12<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>12Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile20 25 30Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110<210>13<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>13Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile20 25 30Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110<210>14<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>14Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110<210>15<211>19<212>PRT<213>小鼠(Mus Musculus)<400>15Met Asn Leu Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly1 5 10 15Val Gln Cys<210>16<211>98<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>16aacagctatg accatggcgg ccgcgacccc tcaccatgaa cctcgggctc agtttgattt 60tccttgccct cattttaaaa ggtgtccagt gtgaggtg 98<210>17<211>97<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>17atgaatccag aggctgcaca ggagagtctc agggacctcc caggctgtac caagtctccc 60
ccagactcca ccagctgcac ctcacactgg acacctt 97<210>18<211>98<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>18tgtgcagcct ctggattcat tttcagtaat tatggcatgt cttgggtccg ccaggctcca 60gggaaggggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtgc 98<210>19<211>98<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>19acagggagtt cttggcattg tctctggaga tggtgaatcg tcccttcaca ctgtctggat 60aataggaata agtgctagca ctactaatgg ttgcgacc 98<210>20<211>98<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>20acaatgccaa gaactccctg tatctgcaga tgaacagcct gagagtcgag gacacggccc 60tgtattactg tgcgagacat agcgatggaa acttcgcg 98<210>21<211>96<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA
<400>21gtaaaacgac ggccagtggg cccttggtgg aggctgagga gacggtgacc agggttccct 60ggccccaata accaaacgcg aagtttccat cgctat 96<210>22<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>22gatggttcac gtagtgg17<210>23<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>23ctgtatctgc agatgaacag cctgagagtc gaggacacgg ccctgtatta ctgtggaaga 60c 61<210>24<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
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Ser Ser Ser<210>26<211>92<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>26aacagctatg accatggaat tcgcctcttc aaaatgaagt tgcctgttag gctgttggtg 60ctgatgttct ggattcctgc ttccagcagt ga 92<210>27<211>94<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>27tagatctgca ggagatggag gccggctctc caggggtgac gggcagggag agtggagact 60gagtcatcac gatatcactg ctggaagcag gaat 94<210>28<211>92<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>28ctccatctcc tgcagatcta gtcggaacat tgttcatatt aatggtgaca catatttaga 60atggtacctg cagaagccag gccagtctcc ac 92<210>29<211>93<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA
<400>29tgtgcctgac ccactgccac tgaacctgtc tgggacccca gaaaatcggt tggaaacttt 60atagatcagg agctgtggag actggcctgg ctt 93<210>30<211>92<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成DNA<400>31gtaaaacgac ggccagtctc gagcgtacgt ttgatttcca ccttggtccc ttggccgaac 60gtccacggaa gaagtgaacc ttgaaagcag t91<210>32<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>32gtaaaacgac ggccagt17<210>33<211>94<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA
<400>33tagatctgca ggagatggag gccggctctc caggggtgac gggcagggag agtggagact 60gagtcatcac aacatcactg ctggaagcag gaat 94<210>34<211>94<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>34tagatctgca ggagatggag gccggctctc caggggtgac gggcagggag agtggagact 60gagtcatcaa gatatcactg ctggaagcag gaat 94<210>35<211>94<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>35tagatctgca ggagatggag gccggctctc caggggtgac gggcagggag agtggagact 60gagtcatcaa aacatcactg ctggaagcag gaat 94<210>36<211>28<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>36Asn Pro Thr Asp Ile Ala Asp Thr Thr Leu Asp Glu Ser Ile Tyr Ser1 5 10 15Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro Cys20 25<210>37<211>18<212>PRT<213>人(Homo sapiens)
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<223>合成肽<400>39Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr20 25 30Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>40<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>40Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr20 25 30Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115<210>41<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>41Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr20 25 30Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>42<211>97<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>42gtgaatccag aggctgcaca ggagagtctc agggaccccc caggctgtac caagcctccc 60ccagactcca ccagctgcac ctcacactgg acacctt 97<210>43<211>98
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<223>合成DNA<400>45acaattccaa gaacacgctg tatctgcaga tgaacagcct gagagccgag gacacggccg 60tgtattactg tgcgagacat agcgatggaa acttcgcg 98<210>46<211>98<212>DNA<213>人工序列<220>
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<210>47<211>98<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>47acaattccaa gaacacgctg tatctgcaga tgaacagcct gagagccgag gacacggccg 60tgtattactg tggaagacat agcgatggaa acttcgcg 98<210>48<211>360<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>48Met Asn Pro Thr Asp Ile Ala Asp Thr Thr Leu Asp Glu Ser Ile Tyr1 5 10 15Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro Cys Thr Lys Glu20 25 30Gly Ile Lys Ala Phe Gly Glu Leu Phe Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu35 40 45Val Phe Val Phe Gly Leu Leu Gly Asn Ser Val Val Val Leu Val Leu50 55 60Phe Lys Tyr Lys Arg Leu Arg Ser Met Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn65 70 75 80Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Ser Leu Pro Phe Trp Gly85 90 95Tyr Tyr Ala Ala Asp Gln Trp Val Phe Gly Leu Gly Leu Cys Lys Met100 105 110Ile Ser Trp Met Tyr Leu Val Gly Phe Tyr Ser Gly Ile Phe Phe Val115 120 125Met Leu Met Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe130 135 140Ser Leu Arg Ala Arg Thr Leu Thr Tyr Gly Val Ile Thr Ser Leu Ala145 150 155 160Thr Trp Ser Val Ala Val Phe Ala Ser Leu Pro Gly Phe Leu Phe Ser165 170 175
Thr Cys Tyr Thr Glu Arg Asn His Thr Tyr Cys Lys Thr Lys Tyr Ser180 185 190Leu Asn Ser Thr Thr Trp Lys Val Leu Ser Ser Leu Glu Ile Asn Ile195 200 205Leu Gly Leu Val Ile Pro Leu Gly Ile Met Leu Phe Cys Tyr Ser Met210 215 220Ile Ile Arg Thr Leu Gln His Cys Lys Asn Glu Lys Lys Asn Lys Ala225 230 235 240Val Lys Met Ile Phe Ala Val Val Val Leu Phe Leu Gly Phe Trp Thr245 250 255Pro Tyr Asn Ile Val Leu Phe Leu Glu Thr Leu Val Glu Leu Glu Val260 265 270Leu Gln Asp Cys Thr Phe Glu Arg Tyr Leu Asp Tyr Ala Ile Gln Ala275 280 285Thr Glu Thr Leu Ala Phe Val His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Ile Tyr290 295 300Phe Phe Leu Gly Glu Lys Phe Arg Lys Tyr Ile Leu Gln Leu Phe Lys305 310 315 320Thr Cys Arg Gly Leu Phe Val Leu Cys Gln Tyr Cys Gly Leu Leu Gln325 330 335Ile Tyr Ser Ala Asp Thr Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Gln Ser Thr Met340 345 350Asp His Asp Leu His Asp Ala Leu355<210>49<211>357<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(357)<223>合成DNA<400>49gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gac ttg gta cag cct ggg agg 48Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc att ttc agt aat tat 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr20 25 30ggc atg tct tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45gca acc att agt agt gct agc act tat tcc tat tat cca gac agt gtg 192Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60aag gga cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tcc ctg tat 240Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80ctg cag atg aac agc ctg aga gtc gag gac acg gcc ctg tat tac tgt 288Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga cat agc gat gga aac ttc gcg ttt ggt tat tgg ggc cag gga 336Ala Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110acc ctg gtc acc gtc tcc tca 357Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>50<211>357<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(357)<223>合成DNA<400>50gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gac ttg gta cag cct ggg agg 48Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc att ttc agt aat tat 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr20 25 30ggc atg tct tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
gca acc att agt agt gct agc act tat tcc tat tat cca gac agt gtg 192Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pto Asp Ser Val50 55 60aag gga cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tcc ctg tat 240Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80ctg cag atg aac agc ctg aga gtc gag gac acg gcc ctg tat tac tgt 288Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys85 90 95gga aga cat agc gat gga aac ttc gcg ttt ggt tat tgg ggc cag gga 336Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110acc ctg gtc acc gtc tcc tca 357Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>51<211>357<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(357)<223>合成DNA<400>51gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gac ttg gta cag cct ggg agg 48Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc att ttc agt aat tat 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr20 25 30ggc atg tct tgg gtc cgc cag gct cca gac aag agg ctg gag tgg gtc 144Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val35 40 45gca acc att agt agt gct agc act tat tcc tat tat cca gac agt gtg 192Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60aag gga cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tcc ctg tat 240Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80ctg cag atg aac agc ctg aga gtc gag gac acg gcc ctg tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga cat agc gat gga aac ttc gcg ttt ggt tat tgg ggc cag gga 336Ala Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110acc ctg gtc acc gtc tcc tca 357Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>52<211>357<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(357)<223>合成DNA<400>52gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gac ttg gta cag cct ggg agg 48Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc att ttc agt aat tat 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asr Tyr20 25 30ggc atg tct tgg gtc cgc cag gct cca gac aag agg ctg gag tgg gtc 144Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val35 40 45gca acc att agt agt gct agc act tat tcc tat tat cca gac agt gtg 192Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60aag gga cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tcc ctg tat 240Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80ctg cag atg aac agc ctg aga gtc gag gac acg gcc ctg tat tac tgt 288Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys85 90 95gga aga cat agc gat gga aac ttc gcg ttt ggt tat tgg ggc cag gga 336Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110acc ctg gtc acc gtc tcc tca 357Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115<210>53<211>336<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(336)<223>合成DNA<400>53gat atc gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15gag ccg gcc tcc atc tcc tgc aga tct agt cgg aac att gtt cat att 96Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile20 25 30aat ggt gac aca tat tta gaa tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct 144Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45cca cag ctc ctg atc tat aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60gac agg ttc agt ggc agt ggg tca ggc aca gat ttc aca ctg aaa atc 240Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc ttt caa ggt 288Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95tca ctt ctt ccg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 336Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110<210>54<211>336<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(336)<223>合成DNA
<400>54gat gtt gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Glyl 5 10 15gag ccg gcc tcc atc tcc tgc aga tct agt cgg aac att gtt cat att 96Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile20 25 30aat ggt gac aca tat tta gaa tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct 144Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45cca cag ctc ctg atc tat aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60gac agg ttc agt ggc agt ggg tca ggc aca gat ttc aca ctg aaa atc 240Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc ttt caa ggt 288Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95tca ctt ctt ccg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 336Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110<210>55<211>336<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(336)<223>合成DNA<400>55gat atc ttg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15gag ccg gcc tcc atc tcc tgc aga tct agt cgg aac att gtt cat att 96Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile20 25 30aat ggt gac aca tat tta gaa tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct 144Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45
cca cag ctc ctg atc tat aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60gac agg ttc agt ggc agt ggg tca ggc aca gat ttc aca ctg aaa atc 240Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc ttt caa ggt 288Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95tca ctt ctt ccg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 336Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110<210>56<211>336<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(336)<223>合成DNA<400>56gat gtt ttg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15gag ccg gcc tcc atc tcc tgc aga tct agt cgg aac att gtt cat att 96Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile20 25 30aat ggt gac aca tat tta gaa tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct 144Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45cca cag ctc ctg atc tat aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60gac agg ttc agt ggc agt ggg tca ggc aca gat ttc aca ctg aaa atc 240Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc ttt caa ggt 288Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95tca ctt ctt ccg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 336
Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110<210>57<211>357<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(357)<223>合成DNA<400>57gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt aat tat 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr20 25 30ggc atg tct tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45tca acc att agt agt gct agc act tat tcc tat tat cca gac agt gtg 192Ser Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60aag gga cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80ctg cag atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 288Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga cat agc gat gga aac ttc gcg ttt ggt tat tgg ggc cag gga 336Ala Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110acc ctg gtc acc gtc tcc tca 357Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>58<211>357<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>CDS<222>(1)..(357)<223>合成DNA<400>58gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc att ttc agt aat tat 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr20 25 30ggc atg tct tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45tca acc att agt agt gct agc act tat tcc tat tat cca gac agt gtg 192Ser Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60aag gga cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80ctg cag atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 288Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga cat agc gat gga aac ttc gcg ttt ggt tat tgg ggc cag gga 336Ala Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110acc ctg gtc acc gtc tcc tca 357Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>59<211>357<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(357)<223>合成DNA<400>59gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt aat tat 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr20 25 30ggc atg tct tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45tca acc att agt agt gct agc act tat tcc tat tat cca gac agt gtg 192Ser Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60aag gga cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80ctg cag atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 288Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gga aga cat agc gat gga aac ttc gcg ttt ggt tat tgg ggc cag gga 336Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110acc ctg gtc acc gtc tcc tca 357Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>60<211>357<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(357)<223>合成DNA<400>60gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc att ttc agt aat tat 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr20 25 30ggc atg tct tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
tca acc att agt agt gct agc act tat tcc tat tat cca gac agt gtg 192Ser Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60aag gga cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80ctg cag atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 288Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gga aga cat agc gat gga aac ttc gcg ttt ggt tat tgg ggc cag gga 336Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110acc ctg gtc acc gtc tcc tca 357Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>61<211>414<212>DNA<213>小鼠(Mus Musculus)<220>
<221>CDS<222>(1)..(414)<400>61atg aac ctc ggg ctc agt ttg att ttc ctt gcc ctc att tta aaa ggt 48Met Asn Leu Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly1 5 10 15gtc cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gac tta atg aag 96Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Met Lys20 25 30cct gga ggg tcc ctg aaa atc tcc tgt gca gcc tct gga ttc att ttc 144Pro Gly Gly Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe IIe Phe35 40 45agt aat tat ggc atg tct tgg gtt cgc cag act cca gac atg agg ctg 192Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Met Arg Leu50 55 60gaa tgg gtc gca acc att agt agt gct agt act tat tcc tat tat cca 240Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro65 70 75 80gac agt gtg aag gga cga ttc acc ata tcc agg gac aac gcc gag aac 288Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn
85 90 95tcc cta tat ctg caa atg aat agt ctg agg tct gag gac aca ggc ata 336Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Ile100 105 110tat tac tgt gga aga cat agc gat gga aac ttc gcg ttt ggt tat tgg 384Tyr Tyr Cys Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp115 120 125ggc cga ggg act ctg gtc act gtc tct gca 414Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala130 135<210>62<211>138<212>PRT<213>小鼠(Mus Musculus)<400>62Met Asn Leu Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly1 5 10 15Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Met Lys20 25 30Pro Gly Gly Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe35 40 45Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Met Arg Leu50 55 60Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro65 70 75 80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn85 90 95Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Ile100 105 110Tyr Tyr Cys Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp115 120 125Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala130 135<210>63<211>396<212>DNA<213>小鼠(Mus Musculus)
<220>
<221>CDS<222>(1)..(396)<400>63atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala1 5 10 15tcc agc agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val20 25 30agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cgg aac att 144Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile35 40 45gtt cat att aat ggt gac aca tat tta gaa tgg tac ctg cag aga ccg 192Val His Ile Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro50 55 60ggc cag tct cca aag ctc cta atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser65 70 75 80ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc 336Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys100 105 110ttt caa ggt tca ctt ctt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc agg ctg 384Phe Gln Gly Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu115 120 125gaa atc aga cgg 396Glu Ile Arg Arg130<210>64<211>132<212>PRT<213>小鼠(Mus Musculus)<400>64Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala1 5 10 15Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile35 40 45Val His Ile Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro50 55 60Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser65 70 75 80Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys100 105 110Phe Gln Gly Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu115 120 125Glu Ile Arg Arg130<210>65<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>65aaggaaaaaa gcggccgcga cccctcacca tgaacctcg 39<210>66<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>66cgatgggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccag 39<210>67<211>31<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA<400>67ccggaattcg cctcctcaaa atgaagttgc c31<210>68<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>68agccaccgta cgtctgattt ccagcctggt g31<210>69<211>97<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>69atgaatccag aggctgcaca ggagagtctc agggaccccc caggctgtac caagcctccc 60ccagactcca ccagctgcac ctcacactgg acacctt 97<210>70<211>28<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>70Asn Pro Thr Asp Ile Ala Asp Thr Thr Leu Asp Glu Ser Ile Tyr Ser1 5 10 15Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro Cys20 25<210>71<211>18<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>71Asp Glu Ser Ile Tyr Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys1 5 10 15Pro Cys<210>72<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>72Glu Ser Ile Tyr Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro1 5 10 15Cys<210>73<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>73Ser Ile Tyr Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro Cys1 5 10 15<210>74<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>74Ile Tyr Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro Cys1 5 10 15
<210>75<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>75Glu Ser Ile Tyr Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Cys1 5 10<210>76<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>76Glu Ser Ile Tyr Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Cys1 5 10<210>77<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>77Glu Ser Ile Tyr Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Cys1 5 10<210>78<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>78Glu Ser Ile Tyr Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Cys1 5 10
權(quán)利要求
1.一種人CDR移植抗體或其抗體片段，其與人CC趨化因子受體4(CCR4)的細(xì)胞外區(qū)特異反應(yīng)，但不與人血小板反應(yīng)。
2.一種人CDR移植抗體或其抗體片段，其與人CC趨化因子受體4(CCR4)的細(xì)胞外區(qū)特異反應(yīng)，并且對CCR4表達(dá)細(xì)胞有細(xì)胞毒活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的人CDR移植抗體或其抗體片段，其對CCR4表達(dá)細(xì)胞有細(xì)胞毒活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其中所述細(xì)胞外區(qū)選自SEQ ID NO48所示的氨基酸序列中的1位至39位，98位至112位，176位至206位和271位至284位。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其中所述細(xì)胞外區(qū)是SEQ ID NO48所示的氨基酸序列中的2位至29位表示的抗原決定簇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其中所述細(xì)胞外區(qū)是SEQ ID NO48所示的氨基酸序列中的13位至29位表示的抗原決定簇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其中所述細(xì)胞外區(qū)是SEQ ID NO48所示的氨基酸序列中的13位至25位表示的抗原決定簇。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其與CCR4表達(dá)細(xì)胞特異反應(yīng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其較非人動物雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體具有更高的對CCR4表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求2至9任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其中所述細(xì)胞因子活性是抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的人CDR移植抗體或其抗體片段，其中所述ADCC活性是誘導(dǎo)CCR4表達(dá)細(xì)胞凋亡的活性。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，具有消除CCR4表達(dá)細(xì)胞的活性。
13.根據(jù)權(quán)利要求8至12任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其中所述CCR4表達(dá)細(xì)胞是Th2細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其具有抑制Th2細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的活性。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的人CDR移植抗體或其抗體片段，其中所述細(xì)胞因子是IL-4，IL-5或IL-13。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其屬于人IgG抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗CCR4單克隆抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))和輕鏈(L鏈)V區(qū)的互補(bǔ)決定簇(CDRs)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗CCR4的單克隆抗體的重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))和輕鏈(L鏈)V區(qū)的互補(bǔ)決定簇(CDR)，以及人抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的框架區(qū)(FRs)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗CCR4的單克隆抗體的重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))和輕鏈(L鏈)V區(qū)的互補(bǔ)決定簇(CDR)，人抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的框架區(qū)(FRs)，和人抗體的H鏈恒定區(qū)(C區(qū))和L鏈C區(qū)。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有分別具有SEQ ID NO1，2和3所示氨基酸序列的抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))的互補(bǔ)決定簇(CDR)1，CDR2和CDR3。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，含有分別具有SEQ ID NO5，6和7所示氨基酸序列的抗體輕鏈(L鏈)可變區(qū)(V區(qū))的互補(bǔ)決定簇(CDR)1，CDR2和CDR3。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至21任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，含有分別具有SEQ ID NO1，2和3所示氨基酸序列的抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))的互補(bǔ)決定簇(CDR)1，CDR2和CDR3和分別具有SEQ IDNO5，6和7所示氨基酸序列的抗體輕鏈(L鏈)可變區(qū)(V區(qū))的互補(bǔ)決定簇(CDR)1，CDR2和CDR3。
23.根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有的氨基酸序列中，至少一個選自SEQ ID NO4所示氨基酸序列中40位的Ala，42位的Gly，43位的Lys，44位的Gly，76位的Lys和97位的Ala的氨基酸殘基被另一個氨基酸取代。
24.根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有的氨基酸序列中，至少一個選自SEQ ID NO38所示氨基酸序列中28位的Thr，和97位的Ala的氨基酸殘基被另一個氨基酸取代。
25.根據(jù)權(quán)利要求1至24任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗體輕鏈(L鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有的氨基酸序列中，至少一個選自SEQ ID NO8所示氨基酸序列中2位的Ile，3位的Val，50位的Gln，和88位的Val的氨基酸殘基被另一個氨基酸取代。
26.根據(jù)權(quán)利要求1至23和25任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有的氨基酸序列中，至少一個選自SEQ ID NO4所示氨基酸序列中40位的Ala，42位的Gly，43位的Lys，44位的Gly，76位的Lys和97位的Ala的氨基酸殘基被另一個氨基酸取代；和抗體輕鏈(L鏈)V區(qū)，該區(qū)含有的氨基酸序列中，至少一個選自SEQ ID NO8所示氨基酸序列中2位的Ile，3位的Val，50位的Gln，和88位的Val的氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代。
27.根據(jù)權(quán)利要求1至22，24和25任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有的氨基酸序列中，至少一個選自SEQ ID NO38所示氨基酸序列中28位的Thr，和97位的Ala的氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代；和抗體輕鏈(L鏈)V區(qū)，該區(qū)含有的氨基酸序列中，至少一個選自SEQ ID NO8所示氨基酸序列中2位的Ile，3位的Val，50位的Gln，和88位的Val的氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基取代。
28.根據(jù)權(quán)利要求1至22和25任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有SEQ ID NO4，9，10，11，38，39，40或41所示的氨基酸序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求1至24和28任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗體輕鏈(L鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有SEQ ID NO8，12，13或14所示的氨基酸序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有SEQ ID NO4，9，10，11，38，39，40或41所示的氨基酸序列，和抗體輕鏈(L鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有SEQ ID NO8，12，13或14所示的氨基酸序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段，其含有抗體重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))，該區(qū)含有SEQ ID NO9或10所示的氨基酸序列；和抗體輕鏈(L鏈)V區(qū)，該區(qū)含有SEQ ID NO14所示的氨基酸序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求1至31任一項的抗體片段，其中所述抗體片段選自Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，單鏈抗體(scFv)，二聚化可變區(qū)(V區(qū))片段(微型雙功能抗體)，二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)片段(dsFv)和含有互補(bǔ)決定簇(CDR)的肽。
33.一種人CDR移植抗體或其抗體片段，可由轉(zhuǎn)化體KM8759(PERM BP-8129)或KM8760(FERM BP-8130)產(chǎn)生。
34.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1至33任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段的轉(zhuǎn)化體。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的轉(zhuǎn)化體，其中所述轉(zhuǎn)化體是KM8759(FERMBP-8129)或KM8760(FERM BP-8130)。
36.一種用于產(chǎn)生能夠產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1至33任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段的轉(zhuǎn)化體方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求34或35的轉(zhuǎn)化體，以在培養(yǎng)物中形成和累積人CDR移植抗體或其抗體片段；從培養(yǎng)物中回收抗體或抗體片段。
37.一種人CDR移植抗體或其抗體片段，其中根據(jù)權(quán)利要求1至33任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段與放射性同位素，蛋白質(zhì)或試劑化學(xué)性或遺傳性的連接在一起。
38.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1至33任一項所述的人CDR移植抗體或其抗體片段的DNA。
39.一種含有根據(jù)權(quán)利要求38所述的DNA的重組載體。
40.一種將根據(jù)權(quán)利要求39的重組載體導(dǎo)入進(jìn)宿主細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)化體。
41.一種藥物，其含有選自根據(jù)權(quán)利要求1至33和37任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段中的至少一種作為活性成分。
42.一種治療CCR4相關(guān)疾病的治療劑，其含有選自根據(jù)權(quán)利要求1至33和37任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段中的任一種作為活性成分。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的治療劑，其中所述CCR4相關(guān)疾病是癌癥或炎性疾病。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的治療劑，其中所述癌癥是血癌。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的治療劑，其中所述血癌是白血病或淋巴瘤病。
46.根據(jù)權(quán)利要求43的治療劑，其中所述的炎性疾病是急性或慢性呼吸道敏感性過度或支氣管哮喘、異位異位性疾病、過敏性鼻炎或花粉病。
47.一種CCR4相關(guān)疾病的診斷試劑，其含有選自權(quán)利要求1至33和37任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段中的至少一種作為活性成分。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的診斷試劑，其中所述CCR4相關(guān)疾病是癌癥或炎性疾病。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的診斷試劑，其中所述癌癥是血癌。
50.根據(jù)權(quán)利要求48的診斷試劑，其中所述血癌是白血病或淋巴瘤病。
51.根據(jù)權(quán)利要求48的診斷試劑，其中所述炎性疾病是慢性呼吸道敏感性過度、支氣管哮喘、異位性皮膚疾病、過敏性鼻炎或花粉病。
52.一種治療Th2介導(dǎo)免疫疾病的治療制劑，其含有選自權(quán)利要求1至33和37任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段中的至少一種作為活性成分。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的治療制劑，其中所述Th2介導(dǎo)免疫疾病是慢性呼吸道敏感性過度、支氣管哮喘、異位性皮膚疾病、過敏性鼻炎或花粉病。
54.一種Th2介導(dǎo)的免疫疾病的診斷試劑，其含有選自權(quán)利要求1至33和37任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段中的至少一種作為活性成分。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的診斷試劑，其中所述Th2介導(dǎo)的免疫疾病是慢性呼吸道敏感性過度、支氣管哮喘、異位性皮膚疾病、過敏性鼻炎或花粉病。
56.一種免疫學(xué)檢測CCR4的方法，該方法使用了根據(jù)權(quán)利要求1至33和37任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段。
57.一種免疫學(xué)檢測細(xì)胞表面上表達(dá)CCR4的細(xì)胞的方法，其含有使用根據(jù)權(quán)利要求1至33和37任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段。
58.一種減少或消除細(xì)胞表面上表達(dá)CCR4的細(xì)胞的方法，該方法包括使用根據(jù)權(quán)利要求1至33和37任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段。
59.一種抑制Th2細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的方法，該方法包括使用根據(jù)權(quán)利要求1至33和37任一項的人CDR移植抗體或其抗體片段。
全文摘要
一種與人CC趨化因子受體4(CCR4)的細(xì)胞外區(qū)特異反應(yīng)，但不與人血小板反應(yīng)的人CDR移植抗體或其抗體片段；一種與CCR4的細(xì)胞外區(qū)特異反應(yīng)，并對CCR4表達(dá)細(xì)胞有細(xì)胞毒活性的人CDR移植抗體或其抗體片段；和一種含有這些抗體或其抗體片段中的至少一種作為活性成分的藥物，治療劑或診斷試劑。
文檔編號C07K14/715GK1575303SQ0282088
公開日2005年2月2日 申請日期2002年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月31日
發(fā)明者設(shè)樂研也, 中村和靖, 保坂繪美, 田中晶子, 小池正道 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社