使用特定的蒽醌染料配體結(jié)構(gòu)來(lái)純化抗體、抗體片段或其工程變體的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及適用于分離或純化抗體、抗體片段或其工程變體的方法的新的吸附劑，其包含蒽醌染料配體；涉及對(duì)應(yīng)的純化方法；以及對(duì)應(yīng)的分析型或制備型分離試劑盒。
【專利說(shuō)明】使用特定的蒽醌染料配體結(jié)構(gòu)來(lái)純化抗體、抗體片段或其工 程變體的方法
[0001] 本發(fā)明涉及適用于分離或純化抗體、抗體片段或其工程變體的方法的新的吸附 劑，其包含蒽醌染料配體;涉及對(duì)應(yīng)的純化方法；以及對(duì)應(yīng)的分析或制備型分離試劑盒。
[0002] 發(fā)明背景:
[0003] 活性染料是公知的產(chǎn)品，其廣泛應(yīng)用于纖維紡織品例如棉花或纖維膠染色的紡織 工業(yè)。所述活性染料的分子被看作是由兩個(gè)互相連接的單元組成，各單元具有不同的功能。 一個(gè)單元是生色團(tuán)，其功能是向紡織品提供所需的顏色和其它染色特性。另一個(gè)單元是纖 維反應(yīng)性基團(tuán)，其在公認(rèn)的應(yīng)用條件下與纖維素進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，將染料分子與紡織品共價(jià) 結(jié)合，以產(chǎn)生對(duì)洗滌過(guò)程抵抗力高的染色物質(zhì)。
[0004] 盡管最初開(kāi)發(fā)活性染料是為了解決在纖維紡織品材料染色和印刷中遇到的某些 問(wèn)題，但經(jīng)過(guò)多年后還發(fā)現(xiàn)它們具有使其能夠用于紡織品染色領(lǐng)域以外的性質(zhì)。
[0005] 已知例如從美國(guó)專利號(hào)4,016,149和4,546,161中，這些染料可以通過(guò)類似的技術(shù) 與碳水化合物底物連接，所述底物例如來(lái)自瓊脂糖、葡萄糖、葡聚糖等的聚合物和共聚物。 所述碳水化合物底物與某些市場(chǎng)可獲得的活性染料的反應(yīng)產(chǎn)物已經(jīng)用作某些蛋白質(zhì)類物 質(zhì)的色譜分離或純化的吸附劑。在市售的紡織品染料中，已經(jīng)用作蛋白質(zhì)或酶分離的配體 的是某些包含單氯三嗪部分的藍(lán)色蒽醌染料，例如C.I.活性藍(lán)2(Cibacron Blue 3GA)、 C. I.活性藍(lán)5和C. I.活性藍(lán)49。一般而言，這些吸附劑包含不止一個(gè)官能團(tuán)，例如疏水性和 離子的或親水性的相互作用，通常稱為混合式層析(MMC)吸附劑。與利用蛋白質(zhì)和配體的一 種確定的相互作用模式的離子交換（IEX)或疏水性相互作用(HIC)的色譜(分別利用蛋白質(zhì) 的電荷和疏水性)相反，蛋白質(zhì)與混合型配體的相互作用是一種復(fù)雜的多因素相互作用，取 決于在給定的pH和溶劑和配體的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)排列的條件下蛋白質(zhì)的電荷和疏水性分布。
[0006] 親和色譜是基于蛋白質(zhì)或酶類對(duì)于吸附劑的固定相上配體的不同強(qiáng)度的親和性， 且日益證實(shí)了在例如生物藥劑學(xué)和診斷學(xué)的高端應(yīng)用領(lǐng)域中非常關(guān)鍵，例如W0 2004/ 052870中所述。該相互作用的本質(zhì)是氫鍵合、靜電力、由于有利的幾何學(xué)而堆疊或者促進(jìn)配 體-靶點(diǎn)關(guān)系的任何其它方面。配體-靶點(diǎn)相互作用應(yīng)當(dāng)足夠強(qiáng)以允許從混合物中除去其它 污染物分子，同時(shí)保持配體-靶點(diǎn)復(fù)合物完整，即，與配體具有親和性的蛋白質(zhì)結(jié)合在基質(zhì) 上，而其它無(wú)親和性的物質(zhì)被洗掉。結(jié)合的蛋白質(zhì)可以選擇性地在不同pH、離子強(qiáng)度和緩沖 劑條件下洗脫，例如P.D.G.Dean，W.S.Johnson和F.A.Middle(編輯），Affinity Chromatography:A Practical Approach，1982中所述。蛋白質(zhì)混合物可以經(jīng)振搖或通過(guò)吸 附劑柱進(jìn)行分離。
[0007] 免疫球蛋白類是包含至少一個(gè)具有兩個(gè)相同輕鏈(~25kDa分子量)和兩個(gè)相同的 重鏈(~50kDa分子量)的Y形結(jié)構(gòu)單元的糖蛋白類。每個(gè)鏈都是由可以劃分為獨(dú)立結(jié)構(gòu)域的 恒定區(qū)和可變區(qū)組成。在高等哺乳動(dòng)物中觀察到免疫球蛋白的五個(gè)不同分類(對(duì)應(yīng)于特定 的重鏈同種型α(IgA)、δ(IgD)、 ε(IgE)、μ(IgM)和γ(IgG))。這些分子的大小、電荷、生物特 性、氨基酸組成和碳水化合物含量不同。輕鏈可以以兩種同種型(稱為κ和λ)之一存在。
[0008] 免疫球蛋白在診斷或治療領(lǐng)域或者制備型及分析型應(yīng)用中的可用性是公認(rèn)的。與 多克隆抗體相反，單克隆抗體(Mab)是具有針對(duì)單一抗原的相同特異性的抗體，且構(gòu)成生物 藥劑學(xué)工業(yè)中發(fā)展最迅速的領(lǐng)域。除了特異性單克隆抗體作為生物藥的使用以外，對(duì)于源 自其的不同類型的抗體片段或工程蛋白變體的興趣也日益增加，因?yàn)樗鼈冊(cè)诨瘜W(xué)和功能方 面可能與多克隆免疫球蛋白制品或單克隆抗體不同。
[0009] 片段抗體(fAb)包括從完整的、特別是單克隆抗體獲得的片段，該片段保留了抗原 結(jié)合特性，同時(shí)避免了與完整的整個(gè)免疫球蛋白分子相關(guān)的缺點(diǎn)。具體而言，所述片段提供 了超越完整蛋白的在成像和治療中的優(yōu)點(diǎn)。由于沒(méi)有Fc(重鏈)區(qū)域或者被患者免疫系統(tǒng)識(shí) 別為異物的分子部分，它們?cè)诨颊咧芯哂懈俚母弊饔?，且可以?duì)它們進(jìn)行修飾以包含治 療性有效荷載。有幾種類型的抗體片段。它們是由特定的內(nèi)肽酶消化制備的或者經(jīng)基因工 程操作并由對(duì)應(yīng)的重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白片段。它們可能具有一個(gè)或多個(gè)、相同 或不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)。fAb包括例如單價(jià)片段例如Fab'、Fab和scFv ;二價(jià)片段，例如F (ab'）2雙特異抗體和微小抗體(minibodies);以及多價(jià)片段例如三特異性抗體、四特異性 抗體以及串聯(lián)雙抗體(TandAbs)。
[0010] 制備fAb的最重要的方法是通過(guò)重組技術(shù)。該技術(shù)使用宿主細(xì)胞表達(dá)所需fAb，隨 后將其從生產(chǎn)介質(zhì)中分離并純化。純化一般經(jīng)色譜完成，且通常是個(gè)復(fù)雜、多步驟的過(guò)程。 該復(fù)雜性不可避免地限制了可獲得的fAb的產(chǎn)率，并顯著地減慢了生產(chǎn)過(guò)程。
[0011]許多完整的抗體是通過(guò)使用蛋白質(zhì)A親和色譜進(jìn)行純化。但是，認(rèn)為蛋白質(zhì)A具有 許多缺點(diǎn)，包括弱穩(wěn)定性、變性、高成本和由于蛋白質(zhì)A自身是生物物質(zhì)的事實(shí)而引起監(jiān)管 部門的關(guān)注。因此，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了合成的親和配體作為具有蛋白質(zhì)A親和性的抗體純化的替代 物。fAb不是經(jīng)蛋白質(zhì)A親和色譜純化，因?yàn)閒Ab不具有對(duì)蛋白質(zhì)A的親和性，因此不能結(jié)合。
[0012] 本
【申請(qǐng)人】的W0 2006/108760描述了蒽醌染料配體及其用于分離生物物質(zhì)的用途， 選自肽類、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、多核苷酸類、核酸類、留類、脂類、激素類，并且特別是酶 類、蛋白質(zhì)和肽類。
[0013] 用于免疫球蛋白分子的親和純化的基于三嗪的染料在WO 97/10887、W0 2004/ 035199和W0 2007/099374中所公開(kāi)。
[0014] W0 2007/004954提出了用于IgG及其片段親和純化的染料的某些[1，2,4]_三唑并 [1，5-A]嘧啶衍生物。
[0015] W0 2009/138714也提出了用于純化fAb的某些三嗪染料的用途。
[0016] W0 2010/102114描述了用于純化fAb的與有機(jī)聚合物組合的藍(lán)色染料吸附劑的用 途。
[0017] 雖然已經(jīng)建議用于分離抗體、抗體片段或其工程變體的方法，但是仍然存在相關(guān) 的缺點(diǎn)，因此需要用于抗體例如fAb分離的改良方法。此外，對(duì)于應(yīng)用在藥物純化過(guò)程而言， 高特異性的結(jié)合能力是不可或缺的。
[0018] 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0019] 發(fā)明人檢測(cè)了多種蒽醌染料(藍(lán)色-染料)配體作為吸附劑，其用于抗體、抗體片段 及其變體的改良的分離與純化。令人驚訝地是，僅有包含如下文所定義的蒽醌染料衍生物 的蒽醌染料衍生物(與載體物質(zhì)連接）的亞群提供了分離和純化來(lái)自免疫球蛋白分子的片 段的改良方法。
[0020] 附圖簡(jiǎn)述
[0021] 圖1說(shuō)明了 a)分析型尺寸排阻色譜法(SEC)的結(jié)果和b)用IgG單體及由其制備的聚 集物(如實(shí)驗(yàn)部分所述通過(guò)熱處理制備)進(jìn)行的SDS-PAGE。
[0022] 圖2說(shuō)明了（a)現(xiàn)有技術(shù)的樹(shù)脂BiueSepharose ?在分離人多克隆IgG抗體聚集 物(Mu)和單體(Mo)的試驗(yàn)中所觀察到的色譜分離曲線，以及色譜分離的匯集流分A和B的 (b)SDS-PAGE和(c)SEC的結(jié)果。(mAU =在280nm的毫吸收單位;CV =柱體積）。
[0023]圖3說(shuō)明了觀察到的在分離人多克隆IgG抗體聚集物(Mu)和單體(Mo)的試驗(yàn)中本 發(fā)明的BASF樹(shù)脂BR36、BR37、BR45、BR46和BR47的色譜分離曲線。
[0024]圖4說(shuō)明了如圖2a和圖3所述的每種色譜分離的單個(gè)流分的SDS-PAGE結(jié)果。
[0025] 圖5說(shuō)明了通過(guò)分析型尺寸排阻色譜的圖3的匯集物A和B(來(lái)自色譜分離）的分析 結(jié)果。
[0026] 圖6說(shuō)明了通過(guò)SDS PAGE的圖3的匯集物A和B(來(lái)自色譜分離)的分析結(jié)果。
[0027] 詳細(xì)描述
[0028] a)具體實(shí)施方案：
[0029]本發(fā)明涉及以下具體實(shí)施方案：
[0030] 1.用于免疫球蛋白分子的色譜分離的吸附劑，該吸附劑包含與染料配體共價(jià)連接 的載體基質(zhì)（或載體），其中所述染料配體是選自蒽醌染料，且其中所述吸附劑的配體密度 是超過(guò) 150,例如 151-500或 160-500 或 170-400或 200-350 或 180-350或 190-330 或 220-330或 250-300ymol/g干燥的吸附劑，其中優(yōu)選在160-500ymol/g干燥的吸附劑的配體密度，更加 優(yōu)選在170-400μηιο 1 /g干燥的吸附劑的配體密度，最優(yōu)選190-330μηιο 1 /g干燥的吸附劑的配 體密度。
[0031] 2.實(shí)施方案1的吸附劑，其中所述吸附劑包括所述載體基質(zhì)（例如化學(xué)活化的；特 別是以現(xiàn)有技術(shù)本身已知的方式化學(xué)活化，例如試驗(yàn)部分中所述)和通式1的蒽醌化合物的 反應(yīng)產(chǎn)物
[0033] 其中
[0034] X是鹵素，特別是F、C1或Br;經(jīng)該基團(tuán)與載體通過(guò)化學(xué)反應(yīng)形成所述共價(jià)連接；
[0035] k和m各自互相獨(dú)立地是0或1，且k+m之和是1或2;特別是k是0且m是1;
[0036] B是芳香基團(tuán)，其包含一個(gè)或多個(gè)稠合或非稠合的、特別是一個(gè)、任選的單-或多取 代的芳香環(huán)；
[0037] V是下式的取代基
[0042] 其中
[0043] η各自是0或1;條件是兩個(gè)η不同時(shí)是0;
[0044] R是相同或不同的，選自Η、烷基、ΝΗ2、ΝΗ-烷基、ΝΗ-芳基、Ν(烷基)2、勵(lì)2、0!1、0-烷基、 CN、C(0)烷基、C(0)芳基、C(0)NH2、C(0)N(H)烷基、C(0)N(烷基)2、C(0)N(H)芳基、或鹵素； [0045]特別地，R是氫;在任何上述含義中的烷基特別是&-C4烷基;且芳基特別是苯基； [0046] Ri是氫或任選被取代的C1-C4烷基，特別是Ri是氫；
[0047] Z選自化學(xué)鍵，
[0048] -(CH2)nl_，nl 是 1-4 的整數(shù)，
[0049] 亞芳基、
[0050] -CH2-亞芳基 _、
[0051] -S02-亞芳基 _、
[0052] -C(0)N(H)亞芳基 _、
[0053] -S02N(H)亞芳基 _、
[0054] -CH=CH_、
[0055] -S02_CH2_CH2_；
[0056] -C(0)NH-(CH2)n2-，n2 是 1-4 的整數(shù)；
[0057] 特別地，Z是化學(xué)鍵或-S02-CH2-CH2-基團(tuán)；在任何上述含義中的亞芳基特別是亞苯 基；
[0058]且
[0059] Y是相同或不同的極性官能團(tuán)，選自-s〇3h、-os〇3h、-⑶ 2h、-p(o)(oh)2、-op(o) (0H)2、0H 和 SH;
[0060] 特別地，Y選自-s〇3h、-os〇3h和-c〇2h ;
[0061] 以及任選的連接體分子，其在載體基質(zhì)和蒽醌化合物之間形成連接基團(tuán)，優(yōu)選共 價(jià)連接基團(tuán)。
[0062] 具體的實(shí)例是式（1)化合物，其中B是任選被取代的亞苯基橋，其中所述N-基團(tuán)是 連接在芳香環(huán)B的間位或?qū)ξ弧?br>[0063] 其它具體實(shí)例是式(1)化合物，其中V是式(2a)的取代基，特別是下式
[0067]優(yōu)選的吸附劑包含載體基質(zhì)，其共價(jià)連接至少一個(gè)上文所述的本實(shí)施方案的具體 染料，其中優(yōu)選的配體密度是160-500ymol/g干燥的吸附劑，更優(yōu)選的配體密度是170-400μ mo 1 /g干燥的吸附劑，最優(yōu)選190-330μηιο 1 /g干燥的吸附劑。
[0068] 3.上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的吸附劑，其中 [0069] B是下式的取代基
[0071] 其中
[0072] Y如上文所定義，
[0073] η是 0是 1
[0074] η3是0、1、2、3或4;
[0075] Yi相同或不同，選自：鹵素，特別是C1;烷基，特別是&_〇4烷基;烷氧基，特別是&_〇4 烷氧基;N0 2或Y，其中Y如上文所定義；
[0076] W 是化學(xué)鍵，或選自-C(0)N(H)-、-S02N(H)-、-S02-或-N(H)- ;且
[0077] R2選自Η或烷基，特別是&心烷基。
[0078]具體實(shí)例是式（1)化合物，其中Β是任選被取代的式3a的亞苯基橋，在其間位或?qū)?位與所述的N-基團(tuán)連接。
[0079]其它具體實(shí)例是式（1)化合物，其中B是式3a的亞苯基橋，在其間位或?qū)ξ慌c所述 N-基團(tuán)連接，且其中n3是1、2、3或4,且其中至少一fYi基團(tuán)是Y，特別是-S03H、-0S03H或-C0 2H。例如，n3是0或1，且或n3是4,且其中一個(gè)￥1是-30出，其它三個(gè)基團(tuán)是相同或 不同的&-C4烷基，例如甲基。
[0080] 進(jìn)一步優(yōu)選的吸附劑包含載體基質(zhì)，其共價(jià)連接至少一個(gè)上文所述的本實(shí)施方案 的特定染料，其中優(yōu)選的配體密度是160-500μηιο 1 /g干燥的吸附劑，更優(yōu)選的配體密度是 170-400μηιο 1 /g干燥的吸附劑，最優(yōu)選190-330μηιο 1 /g干燥的吸附劑。
[0081] 4.上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的吸附劑，其中B是式3a的芳香基團(tuán)。
[0082] 進(jìn)一步優(yōu)選的吸附劑包含載體基質(zhì)，其共價(jià)連接至少一個(gè)上文所述的本實(shí)施方案 的特定染料，其中優(yōu)選的配體密度是160-500μηιο 1 /g干燥的吸附劑，更優(yōu)選的配體密度是 170-400μηιο 1 /g干燥的吸附劑，最優(yōu)選190-330μηιο 1 /g干燥的吸附劑。
[0083] 5.上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的吸附劑，其中V是式2a的取代基，例如2a'或2a"。
[0084]進(jìn)一步優(yōu)選的吸附劑包含載體基質(zhì)，其共價(jià)連接至少一個(gè)上文所述的本實(shí)施方案 的特定染料，其中優(yōu)選的配體密度是160-500μηιο 1 /g干燥的吸附劑，更優(yōu)選的配體密度是 170-400μηιο 1 /g干燥的吸附劑，最優(yōu)選190-330μηιο 1 /g干燥的吸附劑。
[0085] 6.實(shí)施方案4的吸附劑，其中B是式3a的芳香基團(tuán)，其中n3是0、1、2、3或4，且￥1是烷 基例如Q-C4烷基，或Y，例如_S03H。例如，B可以是1，3-亞苯基基團(tuán)，其在2、4和5位帶有Q-C4 烷基基團(tuán)，特別是甲基基團(tuán)，且在5位是基團(tuán)Y，例如-S03H。
[0086] 進(jìn)一步優(yōu)選的吸附劑包含載體基質(zhì)，其共價(jià)連接至少一個(gè)上文所述的本實(shí)施方案 的特定染料，其中優(yōu)選的配體密度是160-500μηιο 1 /g干燥的吸附劑，更優(yōu)選的配體密度是 170-400μηιο 1 /g干燥的吸附劑，最優(yōu)選190-330μηιο 1 /g干燥的吸附劑。
[0087] 7.實(shí)施方案5的吸附劑，其中V是式2a的取代基，其中R是H，且Z是選自化學(xué)鍵或-S02-CH 2-CH2-;特別地，Z是化學(xué)鍵，且Y是-S03H、-0S03H或-C0 2H，例如-S03H;特別是式2a '或 2a"的取代基。
[0088] 進(jìn)一步優(yōu)選的吸附劑包含載體基質(zhì)，其共價(jià)連接至少一個(gè)上文所述的本實(shí)施方案 的特定染料，其中優(yōu)選的配體密度是160-500μηιο 1 /g干燥的吸附劑，更優(yōu)選的配體密度是 170-400μηιο 1 /g干燥的吸附劑，最優(yōu)選190-330μηιο 1 /g干燥的吸附劑。
[0089] 8.上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的吸附劑，其中k是0且m是1。
[0090] 進(jìn)一步優(yōu)選的吸附劑包含載體基質(zhì)，其共價(jià)連接至少一個(gè)上文所述的本實(shí)施方案 的特定染料，其中優(yōu)選的配體密度是160-500μηιο 1 /g干燥的吸附劑，更優(yōu)選的配體密度是 170-400μηιο 1 /g干燥的吸附劑，最優(yōu)選190-330μηιο 1 /g干燥的吸附劑。
[0091] 9.上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的吸附劑，其中所述吸附劑包含所述蒽醌化合物， 其與所述載體基質(zhì)經(jīng)連接體連接，其中所述連接體是選自6-二氨基己烷(DAH)、1，4_二氨基 丁烷(DAB)、1，2-二氨基乙烷(DAE)、1，8-二氨基辛烷(DAO)、1，10-二氨基癸烷，以及特別是 三-2'-氨基乙基胺(TREN)。
[0092] 本實(shí)施方案的進(jìn)一步優(yōu)選的吸附劑是那些吸附劑，其中優(yōu)選的配體密度是160-500ymol/g干燥的吸附劑，更優(yōu)選的配體密度是170-400ymol/g干燥的吸附劑，最優(yōu)選190-330ymol/g干燥的吸附劑。
[0093] 10.實(shí)施方案1-9中任一項(xiàng)所述的吸附劑，其具有10-200,例如20-180或45-165或 80-120或90-110μπι的平均粒徑，測(cè)定為D(0,5)或D(4,3)，特別是D(4,3)。
[0094] 本實(shí)施方案的進(jìn)一步優(yōu)選的吸附劑是那些吸附劑，其中優(yōu)選的配體密度是160-500ymol/g干燥的吸附劑，更優(yōu)選的配體密度是170-400ymol/g干燥的吸附劑，最優(yōu)選190-330ymol/g干燥的吸附劑。
[0095] 11.免疫球蛋白分子的色譜純化方法，該方法包括將包含混有污染的無(wú)機(jī)和/或有 機(jī)物質(zhì)的免疫球蛋白分子的至少一種所需類型的樣品與實(shí)施方案1-10任一項(xiàng)所述的吸附 劑接觸，將免疫球蛋白分子的所需類型吸附在所述吸附劑上，任選地用洗滌液洗滌所述吸 附劑，并隨后洗脫該被吸附的物質(zhì)，以獲得包含富集（即更加純的）形式的所述所需免疫球 蛋白分子的洗脫物。
[0096] 12.免疫球蛋白分子的色譜純化方法，該方法包括將包含混有污染的無(wú)機(jī)和/或有 機(jī)物質(zhì)的免疫球蛋白分子的至少一種所需類型的樣品與實(shí)施方案1-10任一項(xiàng)所述的吸附 劑接觸，吸附(任選在選擇的條件下)所述污染的無(wú)機(jī)和/或有機(jī)物質(zhì)，并獲得包含更加純的 形式的所述所需免疫球蛋白分子的流分。
[0097] 實(shí)施方案11和12的方法還可以重復(fù)進(jìn)行，它們還可以以任何次序組合，且該組合 的方法可以以任何次序重復(fù)。
[0098] 13.實(shí)施方案11或12的方法，其中所述免疫球蛋白分子的所需類型是功能抗體 (Ab)或片段抗體(fAb)。
[0099] 14.實(shí)施方案11-13中之一的方法，其中Ab和fAb是選自通過(guò)化學(xué)、酶或重組產(chǎn)生的 Ab 或fAb。
[0100] 15.實(shí)施方案 14的方法，其中所述fAb選自Fab、F(ab'M或Fab2)、Fab3、scFv、：-scFv、微小抗體、雙特異抗體、三特異性抗體、四特異性抗體、串聯(lián)雙抗體;和單個(gè)抗體結(jié)構(gòu) 域及其片段;其中其多價(jià)片段可以具有相同或不同的抗原特異性。
[0101] 16.實(shí)施方案15的方法，其中所述抗體結(jié)構(gòu)域是選自VH、VL、VhH和ν-NAR結(jié)構(gòu)域。
[0102] 17.實(shí)施方案16的方法，其中所述結(jié)構(gòu)域片段包含至少一個(gè)⑶R，特別是至少⑶R1、 CDR2 和 CDR3 中之一。
[0103 ] 18.實(shí)施方案11 -17中之一的方法，其中需純化的包含樣品的免疫球蛋白是被變性 的和/或聚集的/多聚化的(mulitimerized)免疫球蛋白、免疫球蛋白或抗體降解產(chǎn)物、抗體 的游離輕鏈或重鏈、其它生物分子如DNA或宿主細(xì)胞蛋白所污染。
[0104] 19.上述實(shí)施方案11-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述Ab或fAb在pH4-8下與吸附 劑結(jié)合。
[0105] 20.實(shí)施方案11-19中之一的方法，其中所述樣品反復(fù)地與實(shí)施方案1-10中之一所 定義的相同或不同的吸附劑接觸。
[0106] 21.如實(shí)施方案1-9中任一項(xiàng)所定義的化合物用于分離免疫球蛋白分子、特別是Ab 和fAb的用途。
[0107] 22.實(shí)施方案21的用途，其中進(jìn)行所述分離的目的是為了至少一種Ab或fAb的去除 或者定性或定量分離、定性或定量檢測(cè)、或鑒定。
[0108] 23.制備型或分析型試劑盒，其包含至少一種如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所定義的 帶有蒽醌化合物的吸附劑，以及用于鑒別至少一種分離的fAb的其它物質(zhì)。
[0109] 24.制備實(shí)施方案1 -10中之一的吸附劑的方法，該方法包括將任選活化的載體與 適合的連接體例如三_2'_氨基乙基胺(TREN)反應(yīng)，隨后將由此獲得的官能化的吸附劑與實(shí) 施方案1-9的蒽醌化合物反應(yīng)。
[0110] b)具體定義
[0111]術(shù)語(yǔ)"分離"和"純化"在本發(fā)明全文中具有相同含義，用于描述對(duì)包含復(fù)雜混合物 的蛋白質(zhì)物質(zhì)和/或其它不同分子量和類型的生物物質(zhì)(例如通常形成細(xì)胞成分的物質(zhì)）的 組合物進(jìn)行處理，所述物質(zhì)包含至少一種目標(biāo)fAb分子作為一種成分，且該純化/分離獲得 包含富集形式的所述目標(biāo)分子的產(chǎn)物。
[0112] 術(shù)語(yǔ)"富集"的含義是將除所述目標(biāo)分子以外的其它物質(zhì)部分或全部地從所述復(fù) 雜混合物中除去，特別是除去如上文所述的蛋白質(zhì)物質(zhì)和/或其它生物物質(zhì)。
[0113] 術(shù)語(yǔ)"配體密度"定義了每干燥重量的吸附劑（載體和直接或共價(jià)連接的染料配 體）中的蒽醌染料分子(如式（1)的那些）的摩爾含量(例如μ mol/g)。所述配體密度是在標(biāo)準(zhǔn) 條件下通過(guò)干燥該吸附劑，特別是經(jīng)冷凍干燥以除去來(lái)自物質(zhì)中殘余的液體而測(cè)定。得到 干燥粉末?；谖絼┑目傊亓?，可以剩余低于1重量％或更特別是低于0.1重量％的比例 的殘余液體。隨后，將所述干燥的吸附劑物質(zhì)的預(yù)定的量溶于酸如HC1 (例如6N HC1)中，然 后在升高溫度下孵育，如lh/400C或lh/600C。因此，通過(guò)水解裂解釋放染料。然后進(jìn)行光譜 測(cè)定染料含量(在特定染料的A max下）。整體方法在下文實(shí)驗(yàn)部分中進(jìn)一步描述。鑒于吸附劑 的液體含量相對(duì)較高的事實(shí)(根據(jù)樣品的制備方法，觀察到市售的Blue Sepharose產(chǎn)品的 液體含量在約60-90重量％范圍內(nèi)），認(rèn)為表示為每干燥重量的所述吸附劑的配體密度值最 適合表征吸附劑的配體含量。
[0114] 術(shù)語(yǔ)"粒徑"定義為平均粒徑。優(yōu)選地，本發(fā)明的顆粒是通過(guò)狹窄的、特別是基本上 單峰或單峰的粒徑分布來(lái)表征。粒徑測(cè)定可以通過(guò)本身已知的方式進(jìn)行，例如通過(guò)在 Malvern Mastersizer儀器上應(yīng)用粒徑分布檢測(cè)。通常情況下，該檢測(cè)可以在0，1M NaOH中 進(jìn)行。本文所述的平均粒徑值是D(0.5)或D(4.3)值，其可以稍微不同，但是其仍在指定參數(shù) 范圍內(nèi)，D(0.5)代表了以μπι計(jì)的平均粒徑，在此點(diǎn)處50 %的粒徑分布更小且50%的粒徑分 布更大。D(4,3)代表體積平均直徑。
[0115] 對(duì)于基團(tuán)B或V中的"Q-C4烷基"，可考慮例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、 仲丁基、叔丁基或異丁基，特別是甲基或乙基，尤其是甲基。
[0116] 對(duì)于基團(tuán)B或V中的"&-C4烷氧基"或"-0?4烷基"，可考慮例如甲氧基、乙氧基、 正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基或異丁氧基，特別是甲氧基或乙氧基， 尤其是甲氧基。
[0117] 對(duì)于基團(tuán)B或V中的"鹵素"，可考慮例如氟、氯和溴，特別是氯或溴，尤其是氯。
[0118] 對(duì)于基團(tuán)B或V中的"亞芳基"，可考慮亞萘基、亞聯(lián)苯基或亞苯基，特別是亞苯基， 且更加特別是鄰 _、間-和尤其是對(duì)-亞苯基。
[0119] c)具體的B和V基團(tuán)
[0120] 在隨后的表1和2中列出了式1的基團(tuán)B和V的非限定性的實(shí)例。
[0121] 表1:基團(tuán)B的實(shí)例(表中的"No指編號(hào)，"Formula"指化學(xué)式）
[0126] 表2:基團(tuán)V的實(shí)例(表中的"No ·"指編號(hào)，"Formula"指化學(xué)式）
[0130] d)具體的染料配體
[0131 ]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，式(1)化合物對(duì)應(yīng)于下式的化合物
[0133] 其中
[0134] B是亞苯基基團(tuán)，其未被取代或被磺基(_S03H)取代且任選地進(jìn)一步被&-〇4烷基取 代;例如下式的基團(tuán)
[0136] V是苯基氛基或N-C1-C4烷基-N-苯基氛基，其在苯環(huán)上被橫基或-S〇2-CH2-CH2-〇_ s〇2〇h取代，例如苯基氨基，其在間-或?qū)?位被-so2oh取代；
[0137] 式(1)化合物的結(jié)構(gòu)變化可能解決具體的分離或純化問(wèn)題。
[0138] 具體的式1 a化合物的非限定性實(shí)例如下表3中所提供；
[0143] e)基質(zhì)物質(zhì)(底物和間隔物）
[0144] 用于制備本發(fā)明所用吸附劑的底物、載體或基質(zhì)基本上可以是水溶性的。作為所 述底物的實(shí)例可以提到的是丙烯酸聚合物，例如聚丙烯酰胺或羥基烷基甲基丙烯酸酯，以 及這些物質(zhì)的共聚物，金屬氧化物，例如鋯、鈦或鋁，硅石或多孔玻璃，但優(yōu)選的水溶性固體 載體是具有多個(gè)羥基基團(tuán)的聚合物底物，式(1)化合物可以通過(guò)該反應(yīng)基團(tuán)與其連接。尤其 適合的底物是碳水化合物和修飾的碳水化合物。適合的碳水化合物底物的實(shí)例是瓊脂糖、 交聯(lián)的瓊脂糖、葡萄糖、葡聚糖，及其修飾的版本，例如以"瓊脂糖(Sepharose)"和"葡聚糖 (Sephadex)〃凝膠（〃Sepharose〃和〃Sephadex〃是GE Healthcare的商標(biāo))提供，以及如GB 1， 540,165中所述。其它聚合物底物是聚酰胺。特別感興趣的底物是例如瓊脂糖和交聯(lián)瓊脂 糖。
[0145] 應(yīng)用于本發(fā)明中的吸附劑可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備，例如，通過(guò)將式（1)化合物與底 物(例如碳水化合物底物)在酸結(jié)合試劑(例如堿金屬氫氧化物或碳酸鹽，如氫氧化鈉或碳 酸鈉)的存在下反應(yīng)以形成共價(jià)鍵，所述底物具有能夠與所述式（1)化合物中的反應(yīng)性基團(tuán) 發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)，其中變量如上文所定義和優(yōu)選。
[0146] 此類吸附劑及包含其的色譜柱的制備方法是有據(jù)可查的，例如美國(guó)專利號(hào)4,016， 149和4，546，161。因此，這些文獻(xiàn)將引入本文作為參考。
[0147] 正如已經(jīng)指出的，底物或基質(zhì)，例如瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖、葡萄糖或葡聚糖，可以進(jìn) 一步通過(guò)引入不同長(zhǎng)度的間隔物進(jìn)行修飾，有利地是，隨后再將式(1)化合物與該間隔物共 價(jià)結(jié)合。間隔物可以使得染料配體與待純化的蛋白質(zhì)物質(zhì)的相互作用增強(qiáng)，因?yàn)樘岣吡巳?料配體的易進(jìn)入性，從而提高了吸附劑的選擇性和效能。在特定的實(shí)施方案中，基質(zhì)是被間 隔物修飾的。
[0148] 例如，通過(guò)將底物用表氯環(huán)氧丙烷在酸結(jié)合試劑(例如堿金屬氫氧化物或碳酸鹽， 如氫氧化鈉或碳酸鈉）的存在下處理，并隨后用聚胺在適合的溫度下例如20_80°C、特別是 20-60 °C處理，從而實(shí)施間隔物的引入。
[0149] 適合間隔物引入的聚胺化合物是直鏈或支鏈的，特別是直鏈的間隔物基團(tuán)。它們 可以選自芳香族聚胺、脂肪族聚胺和脂環(huán)聚胺。通常的實(shí)例包括聚乙烯基胺、聚乙烯基亞 胺、1,2-乙二胺、肼、肼-2-二-(3-氨基丙基)-胺、1,4-二氨基環(huán)己燒、3-氨基-1-甲基氨基丙 燒、N-羥基乙基乙二胺、N-甲基-二_(3_氨基丙基)-胺、四亞乙基二胺、1，4_二氨基丁燒、1， 6-六亞甲基二胺、1，8_二氨基辛燒、二-2 氨基乙基胺、1-氨基乙基-1，2-乙二胺、二亞乙基 三胺、四亞乙基五胺、五亞乙基六胺、亞苯基二胺、二苯乙烯二胺、2,4,6_三氨基甲苯-三鹽 酸化物、1，3，6-三氨基萘、異佛爾酮二胺、苯二甲基二胺、氫化的苯二甲基二胺、4，4 二-二 氨基苯基甲烷、氫化的4,4'_二氨基二苯基甲烷，以及這些聚胺單體的衍生物；以及支鏈的 間隔物，例如二 _2'_氨基乙基胺。
[0150] 特別感興趣的是脂肪族和/或脂環(huán)聚胺。特別感興趣的是脂肪族和/或脂環(huán)二胺。 所提到的特別是1,4-二氨基丁燒、1，6-六亞甲基二胺、1，8-二氨基辛燒和1，10-二氨基癸 烷。
[0151] 所述聚胺可以單獨(dú)使用或者作為至少兩種聚胺的混合物使用。
[0152] 包含與固體載體結(jié)合的式（1)或（la)化合物的吸附劑可以是柱子的形式以達(dá)到色 譜分離目的，或者是薄膜的形式以便以膜分離模式進(jìn)行分離。
[0153] f)用于分離的生物物質(zhì)
[0154] 應(yīng)用于吸附劑的生物物質(zhì)包含或者有可能包含免疫球蛋白分子，例如抗體片段抗 體(fAb)物質(zhì)。其可以是例如以粗的或預(yù)處理的細(xì)胞培養(yǎng)物上清、全細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞勻漿， 或適合應(yīng)用于吸附劑的其任何部分。獲得合適蛋白質(zhì)類樣品物質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知，例 如Cooper，Biochemische Arbeitsweisen,Walter de Gruyter，1981 中所述。
[0155] 可以通過(guò)本發(fā)明方法純化的fAb是包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域集 合的抗體的部分，其能夠與抗原結(jié)合，且在許多實(shí)施方案中，其包含至少一個(gè)重鏈片段，通 常稱為VH域，或其功能片段，和/或輕鏈片段，通常稱為VL域，或其功能片段，它們?nèi)芜x地與 至少一個(gè)其它肽鏈一起，例如一個(gè)或多個(gè)恒定域。
[0156]來(lái)自輕鏈的恒定域通常指定為CL。
[0157] 來(lái)自重鏈的恒定域是例如：IgG分子的CHI、CH2和CH3; IgM分子的Cyl、Cy2、Cy3或Cy 4;IgA分子的Cαl、Cα2和Cα3;IgE分子的Cεl、Cε2、Cε3或Cε4 ;IgD分子的Cδl、Cδ2和Cδ3。
[0158] 在某些實(shí)施方案中，fAb包含重鏈衍生的片段和輕鏈衍生的片段，各個(gè)鏈片段是由 恒定域和可變域構(gòu)成，該片段稱為Fab片段。
[0159] 在其它實(shí)施方案中，該fAb包含兩個(gè)或多個(gè)區(qū)域，通常是重鏈或輕鏈的可變和恒定 域的組合、來(lái)自兩個(gè)重鏈可變域的組合、來(lái)自兩個(gè)輕鏈的可變域的組合，或者來(lái)自輕鏈的可 變域和來(lái)自重鏈的可變域的組合。
[0160] 在某些實(shí)施方案中，fAb包含由防止解離的可彎曲的多肽連接體連接的VH和VL域 (稱為單鏈Fv、ScFv)。
[0161] 而在其它實(shí)施方案中，fAb包含單個(gè)結(jié)構(gòu)域或其片段，通常為可變的重鏈或其片 段，或者可變的輕鏈或其片段。
[0162] 在其它實(shí)施方案中，fAb是多聚體形式，例如雙8〇?￥、？&匕2、？ &匕3、微抗體(如8〇卩￥_ Ch3)、雙特異抗體、三特異性抗體、四特異性抗體（參見(jiàn)例如Hoi linger等人，Nature Biotechnology，2005，23，9，1126-1136)或 Tandab'?。
[0163] 可以通過(guò)本發(fā)明方法純化的fAb的實(shí)例包括包含組合的重鏈和輕鏈的蛋白質(zhì)或多 肽構(gòu)建體，各個(gè)鏈?zhǔn)怯珊愣ㄓ蚝涂勺冇驑?gòu)成，其中該免疫球蛋白的輕鏈和重鏈相互作用以 形成單一功能的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
[0164] 其它實(shí)例包括基于VH鏈的域抗體，其為能夠結(jié)合靶點(diǎn)的多肽，該多肽包含至少一 個(gè)結(jié)合域，其中該結(jié)合域是可變的重鏈抗體或其功能片段的單一可變區(qū)域。
[0165] 其它實(shí)例包括基于VL鏈的域抗體，其為能夠結(jié)合靶點(diǎn)的多肽，該多肽包含至少一 個(gè)結(jié)合域，其中該結(jié)合域是可變的輕鏈抗體或其功能片段的單一可變區(qū)域。
[0166] 上文所述的fAb可以衍生自任何上文所述的不同的免疫球蛋白類別（IgA、IgD、 IgE、IgM或IgG，特別是IgG;以及其任何亞類(例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。
[0167] 具體的fAb是scFv和Fab類型。
[0168] 本發(fā)明待純化的免疫球蛋白或抗體可以是任何Ig類別（IgA、IgD、IgE、Igim!UgG， 特別是IgG;以及其任何亞類(如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。
[0169] 更加優(yōu)選地，fAb或抗體或其工程變體是重組產(chǎn)生，例如通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)， 例如在原核宿主例如大腸桿菌或在真核宿主例如畢赤酵母或在哺乳動(dòng)物或植物細(xì)胞中表 達(dá)。
[0170] g)分離方法
[0171] 本發(fā)明的分離或純化方法還可以通過(guò)在包含式（1)化合物的吸附劑存在下，在適 合的pH和離子強(qiáng)度的水性環(huán)境中處理，例如振搖生物物質(zhì)，分離吸附劑，例如經(jīng)過(guò)濾分離， 并通過(guò)適合的pH和離子強(qiáng)度的變動(dòng)將結(jié)合的蛋白質(zhì)從吸附劑上洗脫而進(jìn)行。
[0172] 有利地是，本發(fā)明的分離或純化方法是經(jīng)相互作用或色譜法進(jìn)行，其包括：
[0173 ] (a)接觸階段，其中將包含生物物質(zhì)的混合物與固定在色譜柱上的包含式（1)化合 物的吸附劑接觸，
[0174] (b)洗滌階段，其中通過(guò)將洗滌溶液流經(jīng)吸附劑而將未結(jié)合的物質(zhì)從包含式（1)化 合物的吸附劑中除去，和
[0175] (c)洗脫階段，其中將洗脫溶液流經(jīng)包含式（1)化合物的吸附劑，以回收柱子中截 留的所需生物物質(zhì)。
[0176] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了吸附劑，其包含如上文所定義的式（1)化合物與具 有能夠與所述式（1)化合物的反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)以形成共價(jià)鍵的底物的加合物，其中變量定 義如上文所提供且特別有價(jià)值。
[0177] 本發(fā)明的吸附劑是高純度的物質(zhì)，沒(méi)有任何染料浸出行為，且在基質(zhì)上包含不同 水平的染料配體濃度。
[0178] 此外，本發(fā)明的吸附劑在結(jié)合和分離抗體、抗體片段以及其工程變體方面是化學(xué) 和熱穩(wěn)定的，并且是高度選擇性的。
[0179] 染料配體可以類似地按照本領(lǐng)域已知的方法制備。
[0180] 現(xiàn)在將通過(guò)參考以下實(shí)施例來(lái)更加詳細(xì)的解釋本發(fā)明。溫度以攝氏度提供。除非 另外指明，否則份數(shù)是重量份數(shù)，且百分比是指重量百分比。重量份數(shù)是指以千克對(duì)升的比 率表示的單位體積內(nèi)的重量。
[0181] 實(shí)驗(yàn)部分
[0182] A · -般方法
[0183] 1.測(cè)定色譜樹(shù)脂性能
[0184] 1.1抗體聚集物的產(chǎn)生
[0185] 將蛋白A瓊脂糖純化的人多克隆IgG分子(20ml，蛋白質(zhì)含量15mg/ml)用25mM乙酸 鈉 pH 4.0緩沖液透析兩次(分別4小時(shí)和16小時(shí)）。將IgG樣品在60°C孵育20小時(shí)，以誘發(fā)IgG 聚集物的產(chǎn)生。隨后將熱處理的IgG樣品調(diào)至75mM NaCl和pH 5.0,再次用緩沖液A1透析 (25mm MES 20%1，2_丙二醇pH 6.0)。將未處理的對(duì)照IgG樣品用緩沖液A1透析。
[0186] 圖1說(shuō)明了 IgG單體樣品及經(jīng)熱處理獲得的IgG聚集物的分析型SEC(圖la)以及非 還原的SDS-PAGE分析（圖lb)的結(jié)果（IgG =免疫球蛋白，HT =熱處理，Mu =蛋白多聚體，Mo = 蛋白單體）。
[0187] 熱處理的IgG和未處理的對(duì)照IgG樣品的蛋白質(zhì)含量調(diào)至15mg/ml。
[0188] 1.2色譜條件
[0189] 色譜柱(直徑=0.5cm，長(zhǎng)度5，2cm)用大約1.0ml色譜樹(shù)脂填充，并安裝到標(biāo)準(zhǔn)HPLC 系統(tǒng)上。
[0190] 緩沖液:
[0191] 裝載/平衡緩沖液Al:25mM MES pH 6.0,20%1，2丙二醇
[0192] 洗脫緩沖液Bl:25mM MES pH 6.0,20% 1,2丙二醇，1.0M NaCl
[0193] 洗脫緩沖液B2:25mM Tris/HCl pH8.5，10%異丙醇
[0194] CIP緩沖液Α2:1·0Μ NaOH
[0195] 上樣:
[0196] 樣品（2.0ml，15mg/ml)以75cm/h(0.25ml/min,保留時(shí)間4分鐘)施加，并用緩沖液 A1洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。以300cm/h用20CV至100%B1線性梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后用 7CV的緩沖液B2和7CV的緩沖液A2完全抽提。將蛋白質(zhì)樣品在UV 280nm下檢測(cè)，并收集蛋白 質(zhì)流分。
[0197] SDS PAGE:
[0198] 將10yg樣品和lml流分中的15μ1在非還原條件下加載至SDS-PAGE上，然后用考瑪 斯亮藍(lán)染色。
[0199] 收集窗口 'A'和窗口 'B'的流分，調(diào)至0.9mg/ml，并用25mM乙酸鈉 pH4.0緩沖液透 析。在非還原條件下將相等的量(l〇yg)加載至SDS-PAGE上，然后用考瑪斯亮藍(lán)染色。
[0200] 分析型 SEC:
[0201] 將25μ1'Α'和'B'的混合流分加載至在30°C下緩沖液以1.0ml/min流動(dòng)的BioSep-SEC-S2000柱上（Phenomenex)(100mM磷酸鈉 pH 4.0緩沖液，300mM NaCl)〇
[0202] 在UV280nm下檢測(cè)等度蛋白質(zhì)洗脫。
[0203] 2.用UV-可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定染料含量(配體密度）
[0204] 2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
[0205] 制備標(biāo)準(zhǔn)溶液:
[0206] 在100ml容量瓶中在振搖下將染料(25mg)溶于水(80ml)，并隨后超聲處理10分鐘。 將該容量瓶用水裝滿至刻度。
[0207] 制備校準(zhǔn)溶液
[0208] 按照如下方法制備具有5、10、15、20和25!1^/1濃度的五份標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液 (1、2、3、4和5ml)移液至50ml容量瓶中，向其中加入HCl(6mol/l，40ml)。將該溶液在振搖浴 中于40 °C混合1小時(shí)。還可以將該溶液在振搖浴中于更高溫度下混合，例如在60 °C下1小時(shí)。 將該溶液冷卻至室溫，并用HCl(6mol/l)將容量瓶裝滿至刻度。
[0209] 樣品制備與檢測(cè)
[0210]為了從待分析的染料樣品中除去液體，進(jìn)行常規(guī)的冷凍干燥步驟。例如，為了干燥 含水樣品，冷凍干燥可以在_15°C和〈lmbar減壓下進(jìn)行。將一份所述冷凍干燥的樹(shù)脂樣品 (lOOOmg)置于50ml容量瓶中，加入HCl(6mol/l，40ml)。將該溶液在振搖浴中于40°C混合1小 時(shí)。還可以將該溶液在振搖浴中于更高溫度下混合，例如在60 °C下1小時(shí)。將該溶液冷卻至 室溫，并用HCl(6mol/l)將容量瓶裝滿至刻度。
[0211] 使用lcm比色杯和具體染料的Amax來(lái)檢測(cè)UV-可見(jiàn)光光譜。用6M HC1來(lái)完成儀器的 空白設(shè)置。
[0212] 計(jì)算
[0213 ] R =從校準(zhǔn)曲線中讀取樣品中染料的量[mg/1 ]
[0214] 在50ml容量瓶中染料的量= R/1000*50[mg]
[0216] B.合成樣品 [0217] 1.染料配體的制備
[0218]合成以下通式5的染料配體以進(jìn)行如下文所述的富集試驗(yàn)。
[0220] X =鹵素
[0221] R = H或甲基
[0222] n = l、2或 3
[0223] 表4(表中的"Triazine"是指三嗪）
[0225] υ"三嗪"指示了基團(tuán)B與三嗪環(huán)的連接，如上式5中所示。[0226] 表5(表中的"Triazine"是指三嗪）
[0229] υ"三嗪"指示了基團(tuán)V與三嗪環(huán)的連接，如上式5中所示。
[0230]具體染料可以按照如W0 2006/108760中所詳細(xì)描述來(lái)制備，其公開(kāi)內(nèi)容引入本文 作為參考。
[0231] 1.1蒽醌染料的制備：
[0232] 4-氨基芳基-取代的蒽醌染料可以容易地從起始原料溴氨酸和對(duì)應(yīng)的取代的苯二 胺通過(guò)文獻(xiàn)中的Ullman偶聯(lián)方法制備(例如H.Zollinger，Color Chemistry，第3版，Wiley-VCH(2003),273-278·)。
[0233] 合成實(shí)施例D1:
[0234] 具有結(jié)構(gòu)基團(tuán)B-2的蒽醌染料的合成:
[0236] 通過(guò)氯化亞銅（I)催化的1-氨基-4-溴蒽醌-2-磺酸與對(duì)氨基乙酰苯胺在碳酸氫鈉 緩沖水溶液中于70 °C下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)3小時(shí)，隨后在10-12%的發(fā)煙硫酸中于環(huán)境溫度下磺 化，然后在稀釋的硫酸中于75°C下水解和脫保護(hù)6小時(shí)，從而獲得所述染料。
[0237] 合成實(shí)施例D2:
[0238] 具有結(jié)構(gòu)基團(tuán)B-3的蒽醌染料的合成:
[0240]通過(guò)乙酸銅（II)催化的1-氨基-4-溴蒽醌-2-磺酸與對(duì)苯二胺磺酸在碳酸鈉緩沖 水溶液中于80°C下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)2小時(shí)，得到所述染料。
[0241] 合成實(shí)施例D3:
[0242]具有結(jié)構(gòu)基團(tuán)B-4的蒽醌染料的合成:
[0244] 通過(guò)銅催化的1-氨基-4-溴蒽醌-2-磺酸與1，3-苯二胺-4-磺酸在碳酸氫鈉緩沖水 溶液中于60°C下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)17小時(shí)，得到所述染料。
[0245] 1.2染料配體的制備
[0246] 染料配體通?？梢园凑諆煞N不同的方法制備(也參見(jiàn)流程1):
[0247] 方法bl)在pH4-5和15°C下將對(duì)應(yīng)的蒽醌染料(B-2至B-4)與氰脲酰氯偶聯(lián)90分鐘， 生成藍(lán)色二氯中間體，并隨后與對(duì)應(yīng)的取代的胺(V-1至V-8)在pH7.5-8.5和60 °C下偶聯(lián)5小 時(shí)，或者
[0248] 方法b2)將取代的胺(V-1至V-8)與氰脲酰氯在pH3.5-4和5°C下偶聯(lián)120分鐘，生成 無(wú)色的二氯中間體，并隨后與對(duì)應(yīng)的蒽醌染料(B-2至B-4)在pH7.5-8.5和50 °C下偶聯(lián)16小 時(shí)。
[0250]合成實(shí)施例L1:染料D15
[0252] 方法bl):
[0253] 5°C下將184.4g(1.0mol)氰脲酰氯溶于1870ml乙基甲基酮中，并加入2240g冰水來(lái) 沉淀。5°C下將0，933mol蒽醌染料B-3在2240g中的溶液和pH 7 · 5的448g碳酸鈉溶液(20 % ) 加入該氰脲酰氯混懸液中。將反應(yīng)物加溫至15°C，并在此溫度下攪拌90分鐘，其間通過(guò)緩慢 加入112g碳酸鈉溶液（20 % )將pH值維持在4-5。反應(yīng)完成后(HPLC監(jiān)控），在15 °C下將194g (l，12mol)對(duì)-氨基苯磺酸(V-8)在670g水中的溶液和ρΗ7·5的300g碳酸鈉溶液(20%)加入 該二氯中間體中。通過(guò)加入672g碳酸鈉溶液(20%)將pH調(diào)至7.5-8.5,并保持該水平直至偶 聯(lián)完成。將該混合物加熱至60°C，并攪拌5小時(shí)。
[0254]反應(yīng)完成后(HPLC監(jiān)控），將1140g氯化鈉加入反應(yīng)混合物中，并在2小時(shí)內(nèi)冷卻至 25°C，并另外保持該溫度16小時(shí)以沉淀配體染料。過(guò)濾后，用1200g濃的氯化鈉溶液洗滌，將 濾餅在水中重新成漿，并經(jīng)反滲透脫鹽。將該濃縮的不含氯化物的染料溶液噴霧干燥，得到 512g(61%產(chǎn)率)的染料D15的三鈉鹽，為深藍(lán)色細(xì)粉(X max.=622nm)。
[0255] 方法 b2):
[0256] 將60.68(0.35111〇1)對(duì)-氨基苯磺酸(￥-8)溶于16(^水和43.48氫氧化鈉溶液(30%) 中。在第二個(gè)瓶子中，將65.9g(0.36mol)氰脲酰氯良好地懸浮于370g冰和100g水中，并加入 對(duì)-氨基苯磺酸鈉溶液。用420ml氫氧化鈉溶液(10 % )對(duì)pH進(jìn)行校準(zhǔn)并維持在2.5-3.5，并將 溫度保持在5°C。將反應(yīng)物攪拌120分鐘，隨后加溫至40°C，并再攪拌30分鐘。迅速加入 0.25mol蒽醌染料B-3在420ml水中的溶液和150ml氫氧化鈉溶液（30%)，并用460ml氫氧化 鈉溶液(10% )將pH調(diào)整并保持在7.5-8.5，并將該混合物在50°C攪拌16小時(shí)。
[0257] 反應(yīng)完成后，將600g氯化鈉加入反應(yīng)混合物中，并在2小時(shí)內(nèi)冷卻至25°C，另外保 持該溫度16小時(shí)以沉淀配體染料。過(guò)濾后，用530ml氯化鈉溶液(26 % )洗滌，將濾餅在水中 重新成漿，并經(jīng)反滲透脫鹽。將該濃縮的不含氯化物的染料溶液噴霧干燥，得到lllg(52% 產(chǎn)率)的染料D15的三鈉鹽，為深藍(lán)色細(xì)粉(X max.=622nm)。
[0258] 合成實(shí)施例L2:染料D16:
[0260]按照實(shí)施例1中的方法b2)，通過(guò)將0.082mol氰脲酰氯與0.080mol鄰氨基苯磺酸 (V-6)在pH2.5-3.5和0-5 °C下偶聯(lián)120分鐘以得到二氯中間體，并隨后將該中間體與 0.057mol蒽醌染料B-2在pH7.5-8.5和50°C下偶聯(lián)16小時(shí)，得到染料D16,產(chǎn)率78%(Amax.= 605/619nm)〇
[0261]合成實(shí)施例L3:染料Dll
[0263] 按照實(shí)施例1中的方法bl)，通過(guò)將0.0315mol氰脲酰氯與0.030mol蒽醌染料B-4在 PH4-5和15°C下偶聯(lián)90分鐘以得到二氯中間體，并隨后將該中間體與0.0318mol間氨基苯磺 酸(V-7)在 ρΗ7·5-8·5 和60°C 下偶聯(lián)5 小時(shí)，得到染料 D11，產(chǎn)率 64%(Xmax.=591/624nm)。 [0264]合成實(shí)施例L4:染料D01
[0266] 按照實(shí)施例1中的方法b 1)，通過(guò)將1.Omo 1氰脲酰氯與0.933mo 1蒽醌染料B-4在 PH4-5和15 °C下偶聯(lián)90分鐘以得到二氯中間體，并隨后將該中間體與1.12mo 1 N-乙基-N-(間-(β-硫酸基乙基）磺?；?苯基）胺(V-4)在pH7 · 5-8 · 5和60 °C下偶聯(lián)5小時(shí)，得到染料 D01，產(chǎn)率49% (Amax. =623nm)。
[0267] 合成實(shí)施例L5:染料D21:
[0269] 按照實(shí)施例1中的方法b2)，通過(guò)將0.057mol氰脲酰氯與0.057mol間氨基苯磺酸 (V-7)在pH2.5-3.5和0-5 °C下偶聯(lián)120分鐘以得到二氯中間體，并隨后將該中間體與 0.040mol蒽醌染料B-2在pH7.5-8.5和50°C下偶聯(lián)16小時(shí)，得到染料D21，產(chǎn)率79%(A max.= 609/629nm)。
[0270] 合成實(shí)施例L6:染料D20:
[0272]按照實(shí)施例1中的方法bl)，通過(guò)將1 .Omol氰脲酰氯與0.933mol蒽醌染料B-3在 PH4-5和15 °C下偶聯(lián)90分鐘以得到二氯中間體，并隨后將該中間體與1.12mo 1間氨基苯磺酸 (V-7)在 ρΗ7·5-8·5 和60°C 下偶聯(lián)5 小時(shí)，得到染料 D20,產(chǎn)率 63%(Xmax.=627nm)。
[0273]合成實(shí)施例L7:染料DIO:
[0275] 按照實(shí)施例1中的方法b2)，通過(guò)將0.143mol氰脲酰氯與0.140mol對(duì)氨基苯磺酸 (V-8)在pH2.5-3.5和0-5 °C下偶聯(lián)120分鐘以得到二氯中間體，并隨后將該中間體與 0. lOOmol蒽醌染料B-4在pH7.5-8.5和50°C下偶聯(lián)16小時(shí)，得到染料D10，產(chǎn)率50 % (Amax.= 595/620nm)
[0276] 2.吸附劑(樹(shù)脂)的制備
[0277] 按照如W006/108760A2中所述經(jīng)聚胺間隔物的吸附劑合成的一般方法，該公開(kāi)物 引入本文作為參考。
[0278] 2.1具體吸附劑
[0279] 制備了以下樹(shù)脂：
[0280] 表 6
[0282] 以下間隔物用于這些實(shí)施例：1，6_二氨基己烷(DAH)。
[0283] 合成實(shí)施例A1:
[0284] a)經(jīng)DAH連接體合成吸附劑的方法-樹(shù)脂BR 36、37
[0285] 將瓊脂糖凝膠(6%交聯(lián)，225g)用水(4500ml)洗滌，并在2L加套的反應(yīng)器里立即懸 浮于水(900ml)中。加入表氯環(huán)氧丙烷（37.5g，405mmol)，然后加入等當(dāng)量的NaOH( 16.2g， 405mmol)，并將反應(yīng)物質(zhì)以290rpm在25°C振搖4小時(shí)。隨后將混懸液過(guò)濾，用水(4500ml)徹 底洗滌，得到環(huán)氧基-活化的瓊脂糖。
[0286] 將環(huán)氧基-活化的瓊脂糖（225g)加入1，6_二氨基己烷（12.55g，108mmol)在水 (900ml)的溶液中。將反應(yīng)混合物在45°C振搖4小時(shí)，并過(guò)濾。將所得的氨基官能化的凝膠用 水(4500ml)徹底洗滌并排空。
[0287] 將氨基官能化的瓊脂糖（225g)分成75g的三份，將第一份懸浮于染料D10(2.32g， 3mmo 1)在水（300ml)的溶液中，并將該混合物于45°C在290rpm振搖16小時(shí)。將該混懸液過(guò) 濾，并用水（2000ml)、lM NaCl(500ml)、匪 P(1000ml)、l:lv/v 匪 P:水（500mL)、lM NaCl (300ml)、1M NaOH( 300ml)、1M NaCl (300ml)以及最后用水（2000ml)洗去過(guò)量的染料配體。 將排空的吸附劑BR36在20 % v/v乙醇中于4 °C儲(chǔ)存。
[0288] 將第二份75g的氨基官能化的瓊脂糖懸浮于染料D11 (2.32g，3mmol)在水(300ml) 的溶液中，并將該混合物于45°C在290rpm振搖16小時(shí)。將該混懸液過(guò)濾，并用水(2000ml)、 1M NaCl(500ml)、NMP(1000ml)、l:lv/v NMP:水（500mL)、lM NaCl(300ml)、lM NaOH (300ml)、lM NaCl (300ml)以及最后用水（2000ml)洗去過(guò)量的染料配體。將排空的吸附劑 BR37在20%v/v乙醇中于4°C儲(chǔ)存。
[0289] b)用于合成吸附劑BR45、BR46、BR47的操作程序
[0290]將瓊脂糖凝膠(6%交聯(lián)，225g)用水(4500ml)洗滌，并在2L加套的反應(yīng)器里立即懸 浮于水(900ml)中。加入表氯環(huán)氧丙烷（37.5g，405mmol)，然后加入等當(dāng)量的NaOH( 16.2g， 405mmol)，并將反應(yīng)物質(zhì)以290rpm在25°C振搖4小時(shí)。隨后將混懸液過(guò)濾，用水(4500ml)徹 底洗滌并排空，得到環(huán)氧基-活化的瓊脂糖。
[0291] 將環(huán)氧基-活化的瓊脂糖（225g)加入1，6_二氨基己烷（12.55g，108mmol)在水 (900ml)的溶液中。將反應(yīng)混合物在45°C振搖4小時(shí)，并過(guò)濾。將所得的氨基官能化的凝膠用 水(4500ml)徹底洗滌并排空。
[0292] 將氨基官能化的瓊脂糖（225g)分成75g的三份，將第一份懸浮于染料D21(2.32g， 3mmo 1)在水（300ml)的溶液中，并將該混合物于45°C在290rpm振搖16小時(shí)。將該混懸液過(guò) 濾，并用水（2000ml)、lM NaCl(500ml)、匪 P(1000ml)、l:lv/v 匪 P:水（500mL)、lM NaCl (300ml)、1M NaOH( 300ml)、1M NaCl (300ml)以及最后用水（2000ml)洗去過(guò)量的染料配體。 將排空的吸附劑BR45在20 % v/v乙醇中于4 °C儲(chǔ)存。
[0293] 將第二份75g的氨基官能化的瓊脂糖懸浮于染料D19(2.32g，3mmol)在水(300ml) 的溶液中，并將該混合物于45°C在290rpm振搖16小時(shí)。將該混懸液過(guò)濾，并用水(2000ml)、 1M NaCl(500ml)、NMP(1000ml)、l:lv/v NMP:水（500mL)、lM NaCl(300ml)、lM NaOH (300ml)、lM NaCl (300ml)以及最后用水（2000ml)洗去過(guò)量的染料配體。將排空的吸附劑 BR46在20 % v/v乙醇中于4 °C儲(chǔ)存。
[0294] 將第三份75g的氨基官能化的瓊脂糖懸浮于染料D16(2.32g，3mmol)在水(300ml) 的溶液中，并將該混合物于45°C在290rpm振搖16小時(shí)。將該混懸液過(guò)濾，并用水(2000ml)、 1M NaCl(500ml)、NMP(1000ml)、l:lv/v NMP:水（500mL)、lM NaCl(300ml)、lM NaOH (300ml)、lM NaCl (300ml)以及最后用水（2000ml)洗去過(guò)量的染料配體。將排空的吸附劑 BR47在20%v/v乙醇中于4°C儲(chǔ)存。
[0295] C.試驗(yàn)實(shí)施例
[0296] 實(shí)施例T1:從單體IgG分子中進(jìn)行不充分的HMWA(高分子量聚集物）分離(現(xiàn)有技 術(shù)）
[0297] IgG抗體聚集物如方法部分(A. 1.1)中所述制備。
[0298] 聚集物樣品是按照如上文A. 1.2所述在市售的BlueSepharose⑧(BS)樹(shù)脂(染料 配體密度137ymol/g)上進(jìn)行分析。具體而言，將柱洗脫液如圖2a所示混合。混合物A(BS-A) 和B(BS-B)進(jìn)一步經(jīng)SDS-PAGE(圖2b)和分析型尺寸排阻色譜法（圖2c)分析。
[0299] (L =加載，Mu =蛋白多聚體，Mo =蛋白單體;非還原的SDS-PAGE，用考馬斯藍(lán)染色） [0300]特別是在混合物B中，Mo和Mu的未充分分離是很明顯的。
[0301]實(shí)施例T2:通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的BASF樹(shù)脂從單體IgG分子中的改善的HMWA分離 [0302] IgG抗體聚集物如方法部分(A. 1.1)中所述制備。
[0303] 將聚集物樣品按照如上文A. 1.2所述在BASF樹(shù)脂81?36、81?37、81?45、81?46和81?47(染 料配體010、011、021、015、016分別具有284、281、280、307、256以111〇1/^的染料配體密度<6連 接體）（參見(jiàn)圖3a和3b)。每個(gè)色譜分離的單一流分經(jīng)SDS-PAGE分析（圖4)，表明改善的聚集 物(Mu)去除。為了進(jìn)一步分析BASF樹(shù)脂的更優(yōu)越的分離特性，將如圖2a和3a、b中所示的柱 洗脫液混合。將混合物A和B進(jìn)一步經(jīng)分析型尺寸排阻色譜法（圖5)和SDS PAGE(圖6)分析。 [0304] (L =加載，F(xiàn)T =流穿，Mu =蛋白質(zhì)多聚體，Mo =蛋白質(zhì)單體;非還原的SDS-PAGE，用 考馬斯藍(lán)染色）
[0305]如果與市售的藍(lán)瓊脂糖（實(shí)施例T1)相比，特別是在混合物B中Mo和Mu的改善的分 離是很明顯的。
[0306]本文所引用的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的內(nèi)容引入本文作為參考。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于免疫球蛋白分子的色譜純化的吸附劑，該吸附劑包含與染料配體共價(jià)連接的載 體基質(zhì)，其中所述染料配體選自蔥釀染料，且其中所述吸附劑的配體密度超過(guò)150μπιο 1 /g干 燥的吸附劑。2. 如權(quán)利要求1所述的吸附劑，其中所述吸附劑包括所述載體基質(zhì)、任選的連接體分子 W及通式1的蔥釀化合物的反應(yīng)產(chǎn)物其中 X是面素； k和m各自互相獨(dú)立地是0或1，且k+m之和是1或2; B是芳香基團(tuán)，其包含一個(gè)或多個(gè)稠合或非稠合的、任選的單-或多取代的芳香環(huán)； V是下式的取代基其中 η各自是0或1;條件是兩個(gè)η不同時(shí)是0; R是相同或不同的，選自Η、烷基、畑2、ΝΗ-烷基、ΝΗ-芳基、Ν(烷基)2、N02、0H、0-烷基、CN、C (0)烷基、C(0)芳基、C(0)N出、C(0)N化)烷基、C(0)N(烷基)2、C(0)N化)芳基、面素； 化是氨或任選被取代的C1-C4烷基； Z選自化學(xué)鍵， -(C出）η廣，nl是1-4的整數(shù)， 亞芳基、 -C出-亞芳基-、 -S〇2-亞芳基-、 -C(0)N(H)亞芳基-、 -S02N化)亞芳基-、 -CH=CH-、 -SOrC 出-CH2-; -C(0)NH-(C 出)η2-，η2 是 1-4 的整數(shù)； 且 Υ是相同或不同的極性官能團(tuán)，選自-S03H、-0S0抽、-C0抽、-Ρ(0)(0Η)2、-0Ρ(0)(0Η)2、0Η 和甜。3. 如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的吸附劑，其中 Β是下式的取代基其中 Υ如上文所定義， η是0或1 η3是0、1、2、3或4; Yi相同或不同，選自面素、烷基、烷氧基、Ν02或Υ，其中Υ如上文所定義； W是化學(xué)鍵，或選自-C(0)N化)-、-S02N化)-、-S〇2-或-Ν化)-;且 化選自Η或烷基。4. 如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的吸附劑，其中Β是式3a的芳香基團(tuán)。5. 如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的吸附劑，其中V是式2a的取代基。6. 如權(quán)利要求4所述的吸附劑，其中B是式3a的芳香基團(tuán)，其中n3是0、1、2、3或4,且Yi獨(dú) 立地是烷基或Y。7. 如權(quán)利要求5所述的吸附劑，其中V是式2a的取代基，其中R是H，且Z選自化學(xué)鍵或- 50廣師-師-。8. 如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的吸附劑，其中k是0且m是1。9. 如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的吸附劑，其具有10-200,例如20-180或45-165或80- 120或90-110皿的平均粒徑。10. 免疫球蛋白分子的色譜純化方法，該方法包括將包含混有污染的無(wú)機(jī)和/或有機(jī)物 質(zhì)的免疫球蛋白分子的至少一種所需類型的樣品與權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的吸附劑接 觸，將免疫球蛋白分子的所需類型吸附在所述吸附劑上，任選地用洗涂液洗涂所述吸附劑， 并隨后洗脫被吸附的物質(zhì)，W獲得包含富集形式的所述所需免疫球蛋白分子的洗脫物;或 者該方法包括將包含混有污染的無(wú)機(jī)和/或有機(jī)物質(zhì)的免疫球蛋白分子的至少一種所需類 型的樣品與權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的吸附劑接觸，吸附（在選擇的條件下)所述污染的無(wú) 機(jī)和/或有機(jī)物質(zhì)，獲得包含更加純的形式的所述所需免疫球蛋白分子的流分。11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述免疫球蛋白分子的所需類型是功能抗體(Ab) 或片段抗體(fAb)。12. 如權(quán)利要求10和11中任一項(xiàng)所述的方法，其中待純化的包含免疫球蛋白的樣品是 被變性的和/或聚集的/多聚化的免疫球蛋白污染。13. 權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所定義的化合物用于分離免疫球蛋白分子、特別是Ab和fAb 的用途。14. 制備型或分析型試劑盒，其包含至少一種如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所定義的帶有蔥 釀化合物的吸附劑，W及用于鑒別至少一種分離的fAb的其它物質(zhì)。15. 制備權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的吸附劑的方法，該方法包括將任選活化的載體與適合 的連接體例如Ξ-2'-氨基乙基胺(TREN)反應(yīng)，隨后將由此獲得的官能化的吸附劑與權(quán)利要 求1 -8的蔥釀化合物反應(yīng)。
【文檔編號(hào)】C09B69/10GK105980485SQ201580007238
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2015年2月4日
【發(fā)明人】M·F·菲勒, M·格蘭斯特羅姆, D·林德, S·S·科爾德, A·薩麥爾
【申請(qǐng)人】巴斯夫歐洲公司