專利名稱：保守的大腸桿菌免疫原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對病原性大腸桿菌(Escherichia coli)菌株的免疫。
背景技術(shù)：
通常將大腸桿菌菌株分類為共生性或致病性，并將致病性菌株再細分為腸部或腸外菌株。致病性大腸桿菌在參考文獻I中有更詳細的討論，其分成多種不同致病型，即用一 組共同的毒力因子導致共同疾病的一組大腸桿菌菌株。菌株的致病型分型是常規(guī)技術(shù)，可用基因分型或表型分型進行。近期一項基于基因分型的致病型分型法[2]采用DNA微陣列。腸部菌株中，已知至少6種充分描述的致病型腸致病性(EPEC)、腸出血性(EHEC)、腸凝聚性(EAEC)、腸侵染性(EIEC)、腸產(chǎn)毒性(ETEC)和擴散粘附性(DAEC)。大腸桿菌的腸外致病性菌株(或‘ExPEC’菌株[3，4])包括尿致病性(UPEC)菌株、新生兒腦膜炎(NMEC)菌株和敗血癥相關(guān)菌株(SEPEC)。ExPEC是尿道感染的最常見病因，也是人類新生兒腦膜炎和新生兒敗血癥的主要原因之一，可引起嚴重并發(fā)癥和死亡。其他類型的腸外感染包括骨髓炎，肺部、腹內(nèi)、軟組織和血管內(nèi)器械相關(guān)的感染。人以外的另一種ExPEC致病型是禽致病性(APEC)，導致家禽腸外感染。以前的ExPEC疫苗大多數(shù)基于細胞裂解物或細胞結(jié)構(gòu)物。S0LC0UR0VAC 包括10種不同的熱滅活細菌，包括6種ExPEC菌株。UR0-VAX0M 是口服片劑疫苗，包含18種選定大腸桿菌菌株的凍干細菌裂解物。百特疫苗公司(Baxter Vaccines)開發(fā)了基于來自6_10種不同菌株的菌毛的UTI疫苗。醫(yī)學免疫公司(MedImmune)基于FimH粘附素復合物開發(fā)了名為MEDI 516的產(chǎn)品。相反，參考文獻5和6公開了來自ExPEC菌株的具體免疫原，其可用作針對NMEC和UPEC菌株的明確疫苗的基礎(chǔ)。但是，仍需要提供保護抵御廣泛的腸部和腸外大腸桿菌菌株的疫苗。大腸桿菌是多功能性(versatile)微生物，其適應新的小生境(niche)并導致多種疾病的能力有所提高。適應性、毒力和定居因子可變化以使微生物適應不同的組織和宿主。因此，潛在的抗原承受高度選擇壓力，其結(jié)果是不同菌株間可能具有序列差異?？色@自ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站的基因組(genomes)欄目下的基因組數(shù)據(jù)庫中列有21種致病性和非致病性大腸桿菌的基因組，其蛋白質(zhì)少則僅為4，126種，多則可達5，339種。但是，這種羅列沒有指出在致病性大腸桿菌的主要部分中保守性的有哪些，在這樣保守性的蛋白質(zhì)中的保守區(qū)域是哪些，或者數(shù)千種潛在蛋白質(zhì)中哪些蛋白質(zhì)可用于疫苗中以產(chǎn)生充分的免疫應答來保護抵御致病性大腸桿菌，這需要篩選大量蛋白質(zhì)以鑒定最佳的候選物。本發(fā)明的一個目的在于提供其它的且更好的抗原用于針對致病性大腸桿菌的免疫，且更具體地，針對腸部致病型(例如，EAEC, EIEC、EPEC和ETEC菌株)以及ExPEC致病型的免疫
發(fā)明內(nèi)容
參考文獻5所公開的許多抗原中，其一標注為‘orf353’(該文獻中的SEQ ID705和706)，也稱為來自大腸桿菌NMEC菌株IHE3034的‘orf236’，來自大腸桿菌CFT073菌株的‘C0368’和來自大腸桿菌536菌株的ecp_0248。參考文獻5所公開的另一此類抗原標注為細菌Ig-樣結(jié)構(gòu)域(組1，Group I)蛋白(也標注為‘orf405’，SEQ ID 809和810)，也稱為來自大腸桿菌NMEC菌株IHE3034的‘orf284’，來自大腸桿菌CFT073菌株的‘C0415’和來自大腸桿菌536菌株的ecp_0367。參考文獻5公開的另一此類抗原標注為流感(Flu)抗原43蛋白(也標注為‘orfl364’，SEQ ID 2727和2728)，也稱為來自大腸桿菌NMEC菌株IHE3034的‘orf 1109’，來自大腸桿菌CFT073菌株的‘cl273’和來自大腸桿菌536菌株的ecp_3009。參考文獻5公開的另一此類抗原標注為NodT-家族外膜因子脂蛋白流出轉(zhuǎn)運子蛋白(也標注為‘orfl767’，SEQ ID 3533和3534)，也稱為來自大腸桿菌NMEC菌株IHE3034的‘orf 1488’，來自大腸桿菌CFT073菌株的‘cl765’和來自大腸桿菌536菌株的ecp_1346。參考文獻5公開的另一此類抗原標注為gspK通用分泌途徑蛋白(也標注為‘orf3515’，SEQ ID 7029和7030)，也稱為來自大腸桿菌NMEC菌株IHE3034的 ‘orf3332’，來自大腸桿菌CFT073菌株的‘c3702’和來自大腸桿菌536菌株的ecp_3039。參考文獻5公開的另一此類抗原標注為gspj通用分泌途徑蛋白(也標注為‘orf3516’，SEQ ID 7029和7030)，也稱為來自大腸桿菌NMEC菌株IHE3034的‘orf3333’和來自大腸桿菌536菌株的ecp_3040。參考文獻5公開的另一此類抗原標注為tonB-依賴性鐵載體受體(tonB-dependent siderophore receptor,也標注為 ‘orf3597，，SEQ ID 7193 和7194)，也稱為來自大腸桿菌NMEC菌株IHE3034的‘orf3415’，來自大腸桿菌CFT073菌株的‘c3775’和來自大腸桿菌536菌株的ecp_3121。參考文獻5公開的另一此類抗原標注為菌毛蛋白(也標注為‘orf3613’，SEQ ID 7225和7226)，也稱為來自大腸桿菌NMEC菌株 IHE3034 的 ‘orf3431’ 和來自大腸桿菌 CFT073 菌株的 ‘c3791’。W02008/020330 公開的另一此類抗原標注為溶血素A蛋白(也標注為‘recp3768’，SEQ ID 3)，也稱為來自大腸桿菌CFT073菌株的‘C3570’和來自大腸桿菌536菌株的ecp_3827。來自大腸桿菌UPEC的‘upec948’蛋白也稱為來自大腸桿菌CFT073菌株的‘c0975’。參考文獻6公開的來自大腸桿菌UPEC的‘upecl232’蛋白(SEQ ID 138)也稱為來自大腸桿菌CFT073菌株的‘C1275’。參考文獻6公開的另一此類抗原標注為I型菌毛蛋白，A鏈前體(也標注為‘upecl875’，SEQ ID 221)，也稱為來自大腸桿菌NMEC菌株IHE3034的‘orf 1642’和來自大腸桿菌CFT073菌株的‘C1936’。參考文獻6公開的另一此類抗原標注為YapH同源蛋白(也標注為‘upec2820’，SEQ ID 307)，也稱為來自大腸桿菌CFT073菌株的‘c2895’。參考文獻5、參考文獻6、W02008/020330和其它參考文獻公開來自NMEC菌株IHE3034或UPEC菌株的序列，本發(fā)明的某些方面基于已在包括APEC、UPEC, EAEC, EIEC、EPEC和ETEC菌株在內(nèi)的其它致病型中鑒定出的以下蛋白的變體ExPEC ‘orf353’，細菌Ig-樣結(jié)構(gòu)域(組I)蛋白，流感抗原43蛋白，NodT-家族外膜因子脂蛋白流出轉(zhuǎn)運子蛋白，gspK通用分泌途徑蛋白，gspj通用分泌途徑蛋白，tonB-依賴性鐵載體受體,菌毛蛋白，‘upec948’蛋白，‘upecl232’，l型菌毛蛋白，A鏈前體和YapH同源蛋白。與參考文獻5的公開不同，這 些變體可對治療腸致病型特別有用。因此，本發(fā)明提供了這些變體及其用于免疫患者抵御大腸桿菌感染的應用。此外，本公開包括所有大腸桿菌致病型的各所述蛋白-細菌Ig-樣結(jié)構(gòu)域(組I)蛋白(orf405)、流感抗原43 (orf 1364)、NodT-家族外膜因子脂蛋白流出轉(zhuǎn)運子(orf 1767)、gspK(orf3515)、gspj(orf3516)、tonB-依賴性鐵載體受體(orf3597)、菌毛蛋白(orf3613)、upec-948、upec-1232、I 型菌毛蛋白的 A 鏈前體(upec-1875)、yapH 同源物(upec-2820)、溶血素 A(recp-3768)和含 Sell 重復蛋白(sell repeat-containingprotein，Upec-5211)-的片段，所述片段在多種菌株中為保守性，因此可在對象中提供免疫應答來提供針對多種菌株的保護。本發(fā)明所用多肽本發(fā)明提供多肽，其包含的氨基酸序列衍生自orf353、細菌Ig-樣結(jié)構(gòu)域(組I)蛋白(orf405)、流感抗原43 (orf 1364)、NodT-家族外膜因子脂蛋白流出轉(zhuǎn)運子(orf 1767)、gspK (orf3515)、gspj (orf3516)、tonB-依賴性鐵載體受體(orf3597)、菌毛蛋白(orf3613)、upec-948、upec_1232、l 型菌毛蛋白的 A 鏈前體(upec-1875) >yap H 同源物(upec-2820)、溶血素A (recp-3768)和含Sell重復蛋白(upec-5211),本文對上述各蛋白均有更詳細描述。orf353 蛋白參考文獻5公開的來自大腸桿菌NMEC的‘orf353’蛋白(SEQ ID 705和706)也稱為來自大腸桿菌NMEC菌株IHE3034的‘orf236’，來自CFT073的‘c0368’來自536的ecp—0248。按本發(fā)明所述使用時，orf353蛋白可采取多種形式。優(yōu)選的orf353序列與SEQID NO 1-2 有 50%或更高的相同性(例如，60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)。這包括變體(例如等位基因變體、同源物、直向同源物、旁系同源物、突變體等。
其它優(yōu)選的orf353序列包含來自SEQ ID 1_2的至少n個連續(xù)氨基酸，其中n為7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多)。優(yōu)選片段包含orf353的表位或免疫原性片段。其它優(yōu)選片段缺少SEQ ID NO 1-2的C-末端和/或N-末端的一個或多個氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個)。示例性片段為在下列序列比對中鑒定出的保守片段SEQ ID NO。
權(quán)利要求
1.一種含大腸桿菌(E.coli)蛋白的分離或重組多肽，所述大腸桿菌蛋白選自下組orf353、細菌Ig樣結(jié)構(gòu)域(組I)蛋白(orf405)、流感抗原43(orfl364)、NodT-家族外膜因子脂蛋白流出轉(zhuǎn)運子(orfl767)、gspK(orf3515)、gspj(orf3516)、tonB-依賴性鐵載體受體(orf3597)、菌毛蛋白(orf3613)、upec-948、upec_1232、l型菌毛蛋白的A鏈前體(upec-1875)、yapH 同源物(upec-2820)和溶血素 A(recp_3768)。
2.如權(quán)利要求I所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽含有的氨基酸序列與SEQ ID NO 1-105有至少80%相同性，至少85%相同性，至少90%相同性，至少95%相同性，至少96%相同性，至少97%相同性，至少98%相同性，至少99%相同性或100%相同性。
3.如權(quán)利要求I所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽包含的氨基酸采用成對比對算法與SEQ ID NO :1-105中任一項比對時，從N末端向C末端的各X個氨基酸的移動窗口中具有至少X y個相同的匹配氨基酸，其中X為30而y為0. 75。
4.一種含SEQ ID NO :1-105中任一項的至少10個連續(xù)氨基酸的分離或重組多肽，其特征在于，所述至少10個連續(xù)氨基酸是致免疫的。
5.如權(quán)利要求4所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽是orf353且包含SEQID NO :1-2的少于160個、少于150個、少于140個或少于130個氨基酸。
6.如權(quán)利要求5所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述至少10個連續(xù)氨基酸包含選自SEQ ID NO =211-218的氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求5所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽至少包含SEQID NO1-2的氨基酸21-162。
8.如權(quán)利要求4所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽是細菌Ig-樣結(jié)構(gòu)域(組I)蛋白(orf405)且包含SEQ ID NO :3_18的少于1410個、少于1400個、少于1390個或少于1380個氨基酸。
9.如權(quán)利要求8所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述至少10個連續(xù)氨基酸包含選自SEQ ID NO =219-307和683的氨基酸序列。
10.如權(quán)利要求8所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽至少包含SEQID NO3-18 的氨基酸 595-1008。
11.如權(quán)利要求4所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽是流感抗原43(orfl364)且包含SEQ ID NO 19-40的少于1040個、少于1030個、少于1020個或少于1010個氨基酸。
12.如權(quán)利要求11所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述至少10個連續(xù)氨基酸包含選自SEQ ID NO =308-350的氨基酸序列。
13.如權(quán)利要求11所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽至少包含SEQIDNO 19-40 的氨基酸 53-620。
14.如權(quán)利要求4所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽是NodT-家族外膜因子脂蛋白流出轉(zhuǎn)運子(orfl767)且包含SEQ ID NO :41-47的少于450個、少于440個、少于430個或少于420個氨基酸。
15.如權(quán)利要求14所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述至少10個連續(xù)氨基酸包含選自SEQ ID NO =351-368的氨基酸序列。
16.如權(quán)利要求14所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽至少包含SEQIDNO :41-47 的氨基酸 15-457。
17.如權(quán)利要求4所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽是gSpK(orf3515)且包含SEQ ID NO 48-60的少于320個、少于310個、少于300個或少于290個氨基酸。
18.如權(quán)利要求17所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述至少10個連續(xù)氨基酸包含選自SEQ ID NO =369-384的氨基酸序列。
19.如權(quán)利要求17所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽至少包含SEQIDNO 48-60 的氨基酸 32-325。
20.如權(quán)利要求4所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽是gspJ(orf3516)且包含SEQ ID NO 61-71的少于180個、少于170個、少于160個或少于150個氨基酸。
21.如權(quán)利要求20的分離或重組多肽，其特征在于，所述至少10個連續(xù)氨基酸包含選自SEQ ID NO =385-398的氨基酸序列。
22.如權(quán)利要求20的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽至少包含SEQIDNO61-71的氨基酸16-189。
23.如權(quán)利要求4所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽是tonB-依賴性鐵載體受體(orf3597)且包含SEQ ID NO :72-79的少于710個、少于700個、少于690個或少于680個氨基酸。
24.如權(quán)利要求23所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述至少10個連續(xù)氨基酸包含選自SEQ ID NO =399-425的氨基酸序列。
25.如權(quán)利要求23所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽至少包含SEQIDNO 72-79 的氨基酸 29-713。
26.如權(quán)利要求4所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽是菌毛蛋白(orf3613)且包含SEQ ID NO :80-81的少于180個、少于170個、少于160個或少于150個氨基酸。
27.如權(quán)利要求26所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述至少10個連續(xù)氨基酸包含選自SEQ ID NO =426-432的氨基酸序列。
28.如權(quán)利要求26所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽至少包含SEQIDNO 80-81 的氨基酸 25-187。
29.如權(quán)利要求4所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽是upec-948且包含SEQ ID NO 82-84的少于150個、少于140個、少于130個或少于120個氨基酸。
30.如權(quán)利要求29所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述至少10個連續(xù)氨基酸包含選自SEQ ID NO =493-499的氨基酸序列。
31.如權(quán)利要求29所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽至少包含SEQIDNO 82-84 的氨基酸 24-151。
32.如權(quán)利要求4所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽是upec-1232且包含SEQ ID NO 85-91的少于150個、少于140個、少于130個或少于120個氨基酸。
33.如權(quán)利要求32所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述至少10個連續(xù)氨基酸包含選自SEQ ID NO =500-506的氨基酸序列。
34.如權(quán)利要求32所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽至少包含SEQIDNO 85-91 的氨基酸 26-151。
35.如權(quán)利要求4所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽是I型菌毛蛋白A鏈前體(upec-1875)且包含SEQ ID NO :92-98的少于180個、少于170個、少于160個或少于150個氨基酸。
36.如權(quán)利要求35所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述至少10個連續(xù)氨基酸包含選自SEQ ID NO =507-515的氨基酸序列。
37.如權(quán)利要求35所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽至少包含SEQIDNO 92-98 的氨基酸 24-187。
38.如權(quán)利要求4所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽是yapH同源物(upec-2820)且包含SEQ ID NO :99-100的少于2640個、少于2620個、少于2600個或少于2580個氨基酸。
39.如權(quán)利要求38所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述至少10個連續(xù)氨基酸包含選自SEQ ID NO =516-638的氨基酸序列。
40.如權(quán)利要求38所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽至少包含SEQIDNO :99-100 的氨基酸 984-1495。
41.如權(quán)利要求38所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽至少包含SEQIDNO :99-100 的氨基酸 1496-1876。
42.如權(quán)利要求4所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽是溶血素A(recp-3768)且包含SEQ ID NO :101-105的少于1020個、少于1010個、少于1000個或少于990個氨基酸。
43.如權(quán)利要求42所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述至少10個連續(xù)氨基酸包含選自SEQ ID NO =433-492的氨基酸序列。
44.如權(quán)利要求42所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽至少包含SEQIDNO :101-105 的氨基酸 21-1024。
45.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽不含選自下組的全長蛋白orf353、細菌Ig樣結(jié)構(gòu)域(組I)蛋白(orf405)、流感抗原43 (orfl364)、NodT-家族外膜因子脂蛋白流出轉(zhuǎn)運子(orfl767)、gspK(orf3515)、gspj(orf3516)、tonB-依賴性鐵載體受體(orf3597)、菌毛蛋白(orf3613)、upec-948、upec-1232、I型菌毛蛋白的 A 鏈前體(upec-1875)、yapH 同源物(upec-2820)和溶血素 A(recp_3768)。
46.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的分離或重組免疫原性多肽，其特征在于，所述多肽不含選自SEQ ID NO 1-105的氨基酸序列。
47.如權(quán)利要求1-46中任一項所述的分離或重組免疫原性多肽，其還包含佐劑。
48.編碼權(quán)利要求1-46中任一項所述免疫原性多肽的多核苷酸。
49.如權(quán)利要求48所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸與選自SEQIDNO:106-210的核酸序列具有80%的序列相同性。
50.一種大腸桿菌細胞，其含有編碼權(quán)利要求1-45中任一項所述免疫原性多肽的質(zhì)粒。
51.一種含orf405蛋白的片段的免疫原性多肽,其特征在于,所述片段含有相對大腸桿菌orf405的缺失，該缺失使所述片段的溶解度相比全長蛋白有提高，且其中所述片段與大腸桿菌orf405在對象內(nèi)引起的免疫應答基本相似。
52.如權(quán)利要求51所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述缺失包括假擬的氨基末端易位體結(jié)構(gòu)域。
53.如權(quán)利要求51所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述orf405蛋白對應于SEQIDNO :642的氨基酸序列。
54.如權(quán)利要求51-53中任一項所述的免疫原性多肽,其特征在于，所述片段具有orf405蛋白的少于1200個氨基酸、少于1100個氨基酸、少于1000個氨基酸、少于950個氨基酸、少于900個氨基酸、少于850個氨基酸、少于800個氨基酸、少于750個氨基酸、少于700個氨基酸、少于650個氨基酸、少于600個氨基酸、少于590個氨基酸或少于580個氨基酸。
55.如權(quán)利要求51-54中任一項所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述orf405氨基酸序列包含 (a)選自SEQID NO 3-18的氨基酸序列； (b)與SEQID NO 3-18相比有1-10個單氨基酸改變； (c)與SEQID NO 3-18中任一項具有至少85%的序列相同性； 和/或 (d)采用成對比對算法與SEQID NO 3-18中任一項比對時，從N末端向C末端的各x個氨基酸的移動窗口中具有至少X y個相同的匹配氨基酸，其中X為30而y為0. 75。
56.如權(quán)利要求51-55中任一項所述的免疫原性多肽,其特征在于,所述免疫原性多肽片段是分離、純化或重組的。
57.如權(quán)利要求51-56中任一項所述的免疫原性多肽，其特征在于，還包括佐劑。
58.編碼權(quán)利要求51-55中任一項所述免疫原性多肽的多核苷酸。
59.一種包含編碼權(quán)利要求51-55中任一項所述免疫原性多肽的質(zhì)粒的宿主細胞。
60.一種含流感抗原43(orfl364)蛋白的片段的免疫原性多肽，其特征在于，所述片段相對大腸桿菌流感抗原43(orfl364)含有缺失，該缺失使所述片段的溶解度相比全長蛋白有提高，且其中所述片段與大腸桿菌流感抗原43(orfl364)在對象內(nèi)引起的免疫應答基本相似。
61.如權(quán)利要求60所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述缺失包括羰基末端￠-桶狀結(jié)構(gòu)域。
62.如權(quán)利要求60所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述流感抗原43(orf1364)蛋白對應于SEQ ID NO :652的氨基酸序列。
63.如權(quán)利要求60-62中任一項所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述片段具有流感抗原43(orfl364)蛋白的少于950個氨基酸、少于900個氨基酸、少于850個氨基酸、少于.800個氨基酸、少于750個氨基酸、少于700個氨基酸、少于650個氨基酸、少于600個氨基酸、少于550個氨基酸、少于500個氨基酸、少于450個氨基酸、少于440個氨基酸或少于.430個氨基酸。
64.如權(quán)利要求60-63中任一項所述的免疫原性多肽,其特征在于,所述流感抗原.43(orfl364)氨基酸序列包含 (a)選自SEQID NO 19-40的氨基酸序列； (b)與SEQID NO 19-40相比有1-10個單氨基酸改變；(C)與SEQ ID NO :19-40中任一項具有至少85%的序列相同性； 和/或 (d)采用成對比對算法與SEQ ID NO :19-40中任一項比對時，從N末端向C末端的各X個氨基酸的移動窗口中具有至少X y個相同的匹配氨基酸，其中X為30而y為0. 75。
65.如權(quán)利要求60-64中任一項所述的免疫原性多肽,其特征在于,所述免疫原性多肽片段是分離、純化或重組的。
66.如權(quán)利要求60-65中任一項所述的免疫原性多肽,其特征在于,還包括佐劑。
67.編碼權(quán)利要求60-64中任一項所述免疫原性多肽的多核苷酸。
68.—種包含編碼權(quán)利要求46-64中任一項所述免疫原性多肽的質(zhì)粒的宿主細胞。
69.一種含含yapH同源物(upec-2820)蛋白的片段的免疫原性多肽，其特征在于，所述片段相對大腸桿菌yapH同源物(upec-2820)含有缺失，該缺失使所述片段的溶解度相比全長蛋白有提高，且其中所述片段與大腸桿菌yapH同源物(upec-2820)在對象內(nèi)引起的免疫應答基本相似。
70.如權(quán)利要求69所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述yapH同源物(upec-2820)蛋白對應于 SEQ ID NO 644, SEQ ID NO :646，SEQ ID NO :648 或 SEQ ID NO :650 的氨基酸序列。
71.如權(quán)利要求69或70所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述片段具有yapH同源物(upec-2820)蛋白的少于2500個氨基酸、少于2000個氨基酸、少于1750個氨基酸、少于1500個氨基酸、少于1400個氨基酸、少于1300個氨基酸、少于1200個氨基酸、少于1100個氨基酸、少于1000個氨基酸、少于900個氨基酸、少于850個氨基酸、少于800個氨基酸、少于750個氨基酸、少于700個氨基酸、少于650個氨基酸、少于600個氨基酸、少于550個氨基酸、少于500個氨基酸、少于450個氨基酸、少于400個氨基酸或少于390個氨基酸。
72.如權(quán)利要求69-71中任一項所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述yapH同源物(upec-2820)氨基酸序列包含 (a)選自SEQID NO 99-100的氨基酸序列； (b)與SEQID NO =99-100相比有1-10個單氨基酸改變； (c)與SEQID NO =99-100中任一項具有至少85%的序列相同性； 和/或 (d)采用成對比對算法與SEQID NO =99-100中任一項比對時，從N末端向C末端的各X個氨基酸的移動窗口中具有至少X y個相同的匹配氨基酸，其中X為30而y為0. 75。
73.如權(quán)利要求69-72中任一項所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述免疫原性多肽片段是分離、純化或重組的。
74.如權(quán)利要求69-73中任一項所述的免疫原性多肽，其特征在于，還包括佐劑。
75.編碼權(quán)利要求69-72中任一項所述免疫原性多肽的多核苷酸。
76.—種包含編碼權(quán)利要求69-72中任一項所述免疫原性多肽的質(zhì)粒的宿主細胞。
77.一種含溶血素A(reCp3768)蛋白的片段的免疫原性多肽，其特征在于，所述片段含有相對大腸桿菌溶血素A(reCp3768)的缺失，該缺失使所述片段的溶解度相比全長蛋白有提高，且其中所述片段與大腸桿菌溶血素A (recp3768)在對象內(nèi)引起的免疫應答基本相似。
78.如權(quán)利要求77所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述缺失包括膜插入和孔形成所需的氨基末端疏水性結(jié)構(gòu)域(疏水性a -螺旋區(qū))，轉(zhuǎn)錄后乙?；罂仔纬苫钚运璧慕Y(jié)構(gòu)域和羧基末端信號序列。
79.如權(quán)利要求77所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述溶血素A(recp3768)蛋白對應于SEQ ID NO :640的氨基酸序列。
80.如權(quán)利要求77-79中任一項所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述片段具有溶血素A(recp3768)蛋白的少于1000個氨基酸、少于950個氨基酸、少于900個氨基酸、少于850個氨基酸、少于800個氨基酸、少于750個氨基酸、少于700個氨基酸、少于650個氨基酸、少于600個氨基酸、少于550個氨基酸、少于500個氨基酸、少于450個氨基酸、少于400個氨基酸、少于390個氨基酸、少于380個氨基酸、少于350個氨基酸、少于300個氨基酸、少于250個氨基酸、少于240個氨基酸、少于230個氨基酸或少于220個氨基酸。
81.如權(quán)利要求77-80中任一項所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述溶血素A(recp3768)氨基酸序列包含 (a)選自SEQID NO 101-105的氨基酸序列； (b)與SEQID NO =101-105相比有1-10個單氨基酸改變； (c)與SEQID NO =101-105中任一項具有至少85%的序列相同性； 和/或 ⑷采用成對比對算法與SEQ ID NO :101-105中任一項比對時，從N末端向C末端的各X個氨基酸的移動窗口中具有至少X y個相同的匹配氨基酸，其中X為30而y為0. 75。
82.如權(quán)利要求77-81中任一項所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述免疫原性多肽片段是分離、純化或重組的。
83.如權(quán)利要求77-82中任一項所述的免疫原性多肽，其特征在于，還包括佐劑。
84.編碼權(quán)利要求77-81中任一項所述免疫原性多肽的多核苷酸。
85.—種包含編碼權(quán)利要求77-81中任一項所述免疫原性多肽的質(zhì)粒的宿主細胞。
86.一種分離或重組多肽，其包含大腸桿菌含Sell重復蛋白(upec-5211)。
87.如權(quán)利要求86所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽含有的氨基酸序列與SEQ ID NO =653-655有至少80%相同性，至少85%相同性，至少90%相同性，至少95%相同性，至少96%相同性，至少97%相同性，至少98%相同性，至少99%相同性或100%相同性。
88.如權(quán)利要求86所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽包含的氨基酸采用成對比對算法與SEQ ID NO =653-655中任一項比對時，從N末端向C末端的各x個氨基酸的移動窗口中具有至少X y個相同的匹配氨基酸，其中X為30而y為0. 75。
89.一種含SEQ ID NO :653-655中任一項的至少10個連續(xù)氨基酸的分離或重組多肽，其特征在于，所述至少10個連續(xù)氨基酸是致免疫的。
90.如權(quán)利要求89所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽含有SEQIDNO653-655的少于480個、少于470個、少于460個、少于450個、少于425個、少于400個、少于350個、少于200個或少于250個氨基酸。
91.如權(quán)利要求90所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述至少10個連續(xù)氨基酸包含選自SEQ ID NO =656-675的氨基酸序列。
92.如權(quán)利要求86-89中任一項所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽不含全長大腸桿菌含Sell重復蛋白(upec-5211)。
93.如權(quán)利要求86-89中任一項所述的分離或重組多肽，其特征在于，所述多肽不含選自SEQ ID NO =653-655的氨基酸序列。
94.如權(quán)利要求86-93中任一項所述的分離或重組免疫原性多肽，其特征在于，還包含佐劑。
95.編碼權(quán)利要求86-93中任一項所述免疫原性多肽的多核苷酸。
96.如權(quán)利要求95所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸與編碼SEQIDNO653-655之一的核酸序列具有80%的序列相同性。
97.一種大腸桿菌細胞，其含有編碼權(quán)利要求86-93中任一項所述免疫原性多肽的質(zhì)粒。
全文摘要
鑒定出多個致病型大腸桿菌菌株中大腸桿菌蛋白orf353、細菌Ig-樣結(jié)構(gòu)域(組1)蛋白(orf405)、流感抗原43(orf1364)、NodT-家族外膜因子脂蛋白流出轉(zhuǎn)運子(orf1767)、gspK(orf3515)、gspJ(orf3516)、tonB-依賴性鐵載體受體(orf3597)、菌毛蛋白(orf3613)、upec-948、upec-1232、1型菌毛蛋白的A鏈前體(upec-1875)、yap H同源物(upec-2820)、溶血素A(recp-3768)和含Sel 1重復蛋白(upec-5211)的同源物，以及在所述蛋白質(zhì)中具有的在所有大腸桿菌中保守的區(qū)域。提供對應所述保守區(qū)域的片段，特別是免疫原性片段如線性B表位。此外，本申請?zhí)峁┘毦鶬g-樣結(jié)構(gòu)域(組1)蛋白(orf405)的變體、yapH同源物(upec2820)的變體和溶血素A(recp3768)兩個不同片段的變體，所述變體的溶解度比天然蛋白高，其中所述變體仍能在對象中引起與相應天然蛋白基本相似的免疫應答。
文檔編號A61K39/02GK102666571SQ201080040619
公開日2012年9月12日 申請日期2010年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日
發(fā)明者D·G·莫里爾, L·塞里諾, M·R·豐塔納 申請人:諾華有限公司