斜帶石斑魚orexin-A在調(diào)控石斑魚糖代謝中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了斜帶石斑魚orexin-A在調(diào)控石斑魚糖代謝中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)orexin-A基因?qū)κ唪~糖代謝具有調(diào)控功能。在發(fā)現(xiàn)糖代謝功能的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)室利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了大量粗提級(jí)別的重組石斑魚orexin-A，并將其添加到石斑魚飼料中進(jìn)行生理實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)石斑魚生長(zhǎng)的影響；利用本發(fā)明可以獲得來(lái)源穩(wěn)定、成本低廉的石斑魚orexin-A重組蛋白，并進(jìn)一步制備適合海水魚類使用的魚類促生長(zhǎng)劑或添加劑。
【專利說(shuō)明】斜帶石斑魚orex i n-A在調(diào)控石斑魚糖代謝中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及斜帶石斑魚orexin-A在調(diào)控石斑魚糖 代謝中的應(yīng)用。具體應(yīng)用為將石斑魚orexin-A用于制備魚苗苗種促生長(zhǎng)劑或飼料添加劑。

【背景技術(shù)】
[0002] 斜帶石斑魚orexin-A (又稱為食欲肽）是由43個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。Orexin 是1998年在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的新型下丘腦神經(jīng)肽，分為orexin-A和orexin-B兩種，是來(lái) 源于同一個(gè)orexin前體信使RNA經(jīng)過(guò)不同剪接、翻譯后的產(chǎn)物。斜帶石斑魚Orexin-A含有 一對(duì)二硫鍵，由第7位與第14位的半胱氨酸構(gòu)成，蛋白大小約為4. 7Kda，其序列與結(jié)構(gòu)與哺 乳動(dòng)物orexin-A類似，哺乳動(dòng)物orexin-A由33個(gè)氨基酸及兩對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵構(gòu)成，蛋白大 小約為3. 6kda。近年來(lái)，魚類的orexin-A相繼被克隆出來(lái)，其中包括斜帶石斑魚、鱒魚、鱈 魚、羅非魚、青鏘及斑馬魚等，在基因序列與氨基酸序列的同源性上，斜帶石斑魚orexin-A 與其他的魚類的同源性高于哺乳動(dòng)物，表現(xiàn)出在魚類中較高的保守性。
[0003] 目前，對(duì)于魚類orexin-A功能及應(yīng)用的研究很少，對(duì)于哺乳動(dòng)物及魚類中的 orexin-A研究主要集中在orexin-A對(duì)攝食、體重的調(diào)控及睡眠覺(jué)醒的調(diào)控方面，哺乳 動(dòng)物中近年來(lái)已經(jīng)陸續(xù)有研究表明orexin-A可以調(diào)控機(jī)體代謝，而在魚類研究中針對(duì) orexin-A對(duì)于糖代謝調(diào)控方面的研究則未見(jiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中缺乏有效促進(jìn)石斑魚苗種生長(zhǎng) 的餌料添加劑的缺陷，提供斜帶石斑魚orexin-A基因在調(diào)控石斑魚糖代謝中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供斜帶石斑魚orexin-A蛋白在制備石斑魚魚苗苗種促 生長(zhǎng)劑或飼料添加劑中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)： 斜帶石斑魚orexin-A基因在調(diào)控石斑魚糖代謝中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，用人 工合成超純級(jí)別重組斜帶石斑魚orexin-A進(jìn)行腹腔注射斜帶石斑魚，結(jié)果展示，重組斜帶 石斑魚orexin-A以葡萄糖依賴性刺激石斑魚的糖代謝。
[0007] 本發(fā)明用于表達(dá)斜帶石斑魚orexin-A的基因片段是以斜帶石斑魚下丘腦總RNA 反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增而得到的，它來(lái)源于斜帶石斑魚下丘腦cDNA上 的前體orexin-A片段。按照上述的斜帶石斑魚orexin-A重組蛋白基因序列，它正好是斜 帶石斑魚orexin-A前體基因 139bp至267bp (相當(dāng)于1位至43位氨基酸）的片段，其核苷 酸序列及其所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO :1?2所示。
[0008] 本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)：斜帶石斑魚orexin-A基因可以以葡萄糖依賴的特性刺激 上調(diào)肝臟或肌肉中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白glut-Ι或glut-4的表達(dá)量。所以，本發(fā)明還保護(hù)斜帶 石斑魚orexin-A基因在上調(diào)肝臟或肌肉中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白glut-Ι或glut-4表達(dá)量中的 應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明提供斜帶石斑魚orexin-A蛋白在制備石斑魚魚苗苗種促生長(zhǎng)劑或飼料添 加劑中的應(yīng)用。本發(fā)明將高效表達(dá)并進(jìn)行粗提純的重組斜帶石斑魚orexin-A蛋白作為飼 料添加劑投喂斜帶石斑魚魚苗，實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示：飼料中添加重組斜帶石斑魚orexin-A蛋白 能夠顯著性的促進(jìn)石斑魚魚苗的生長(zhǎng)。
[0010] 石斑魚是海洋珊瑚礁魚類，屬飽科（Serranidae)，石斑魚屬（Epinephelus)，有30 多種。石斑魚是一種名貴的海水魚類，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。石斑魚的苗種培 育是養(yǎng)殖生產(chǎn)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵，但目前在石斑魚人工養(yǎng)殖中還沒(méi)有一種能有效促進(jìn)其苗種 生長(zhǎng)的餌料添加劑。
[0011] 一種石斑魚種苗促生長(zhǎng)劑或飼料添加劑，所述促生長(zhǎng)劑或飼料添加劑中含有有效 劑量的重組斜帶石斑魚orexin-A蛋白。 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)orexin-A基因?qū)κ唪~糖代謝具有調(diào)控功能，具體為斜帶石斑 魚orexin-A基因可以以葡萄糖依賴的特性刺激上調(diào)肝臟或肌肉中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白glut-1 或glut-4的表達(dá)量。所以，將orexin-A蛋白作為良好的添加劑加入飼料中，顯著性的促進(jìn) 石斑魚魚苗的生長(zhǎng)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1.以斜帶石斑魚下丘腦總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板的orexin-A基因中 間片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析圖，其中：M.分子量標(biāo)準(zhǔn)；I. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0013] 圖2.重組質(zhì)粒PCR和酶切鑒定凝膠電泳分析圖，其中：M1、M2.分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. PCR鑒定；2. J與班JJJ雙酶切鑒定。
[0014] 圖3.重組斜帶石斑魚orexin-A基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜，其中M 是蛋白分子量，泳道廣4是不同批次的誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物，泳道5飛是未誘表達(dá)產(chǎn)物。
[0015] 圖4.重組斜帶石斑魚orexin-A基因表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot圖譜，其中泳道 1飛是不同批次誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物。
[0016] 圖5.重組斜帶石斑魚orexin-A飛行時(shí)間質(zhì)譜MS/MS檢測(cè)一級(jí)質(zhì)譜結(jié)果。
[0017] 圖6.重組斜帶石斑魚orexin-A飛行時(shí)間質(zhì)譜MS/MS檢測(cè)二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果。
[0018] 圖7.對(duì)斜帶石斑魚腹腔注射orexin-A對(duì)肝臟組織glut-Ι表達(dá)量的影響。
[0019] 圖8.對(duì)斜帶石斑魚腹腔共注射orexin-A與葡萄糖對(duì)肝臟組織glut-Ι表達(dá)量的 影響。
[0020] 圖9.對(duì)斜帶石斑魚腹腔注射orexin-A對(duì)肝臟組織glut-4表達(dá)量的影響。
[0021] 圖10.對(duì)斜帶石斑魚腹腔共注射orexin-A與葡萄糖對(duì)肝臟組織glut-4表達(dá)量的 影響。
[0022] 圖11.對(duì)斜帶石斑魚腹腔共注射orexin-A對(duì)肌肉組織glut-Ι表達(dá)量的影響。
[0023] 圖12.對(duì)斜帶石斑魚腹腔共注射orexin-A與葡萄糖對(duì)肌肉組織glut-Ι表達(dá)量的 影響。
[0024] 圖13.對(duì)斜帶石斑魚腹腔共注射orexin-A對(duì)肌肉組織glut-4表達(dá)量的影響。
[0025] 圖14.對(duì)斜帶石斑魚腹腔共注射orexin-A與葡萄糖對(duì)肌肉組織glut-4表達(dá)量的 影響。
[0026] 圖15. orexin-A蛋白作為飼料添加劑投喂斜帶石斑魚魚苗對(duì)石斑魚體重的影響。
[0027] 圖16. orexin-A蛋白作為飼料添加劑投喂斜帶石斑魚魚苗對(duì)石斑魚肝、肌糖原的 影響。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā) 明采用的試劑、設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑和設(shè)備。
[0029] 實(shí)施例1 :斜帶石斑魚orexin-A基因的合成與表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)已發(fā)表的石斑魚前體orexin的cDNA序列，以與斜帶石斑魚下丘腦的cDNA 全序列為引物設(shè)計(jì)模板，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物并且加入了保護(hù)堿基，上游引 物 F 的序列為：5' - CGGGATCCGCACAGCGTGTCTGAGTGC-3'，下游引物 R 的序列為：5' -CCCAAGCTTCAGGGTGAGAATGCCAGC-3'。PCR反應(yīng)是以斜帶石斑魚下丘腦總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增orexin-A序列，反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5分鐘；下邊為38 個(gè)循環(huán)，分為95°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸15秒，共40個(gè)循環(huán)；PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物的電泳鑒定圖見(jiàn)圖1。從圖1可見(jiàn)第一次PCR擴(kuò)增了一段長(zhǎng)約150bp的序列。將目的條 帶用 E. Z. N. A. ? Gel Extraction Kit 回收。
[0030] 質(zhì)粒pET22b+與orexin-A PCR膠回收產(chǎn)物經(jīng)限制酶及麗7 J與班JJJ雙酶切 后，酶切產(chǎn)物用E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit回收。膠回收后的orexin-A基因片段與 載體片段按3:1混合，用MBI T4連接酶22°C連接16小時(shí)后用標(biāo)準(zhǔn)氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸 桿菌DH5 α中，篩選具氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，以標(biāo)準(zhǔn)方法提取質(zhì)粒，篩選大小約5. 4kb 的重組質(zhì)粒，用限制酶及_7 /與///雙酶切重組質(zhì)粒，得到150bp和5. 4kb的兩個(gè) 片段，大小分別與斜帶石斑魚orexin-A基因和表達(dá)載體pET22b+大小相同，證明斜帶石斑 魚orexin-A基因已克隆入大腸桿菌表達(dá)載體pET22b+中，將重組質(zhì)粒pET22b-〇rexin_A用 pET22b的一對(duì)通用引物進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與Genebank的序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明克 隆的PCR產(chǎn)物是斜帶石斑魚orexin-A基因，重組質(zhì)粒命名為pET22b-〇rexin_A。質(zhì)粒構(gòu)建 與酶切分析圖見(jiàn)圖2。
[0031] 實(shí)施例2 高效表達(dá)斜帶石斑魚orexin-A的大腸桿菌重組株pET22b-〇rexin-A-0rigami的構(gòu)建 CaCl2法將pET22b-〇rexin-A轉(zhuǎn)化Origami 2 (DE3)，在含氨芐青霉素、鏈霉素及四環(huán)素 的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒檢測(cè)和酶切分析獲得含pET22b-〇rexin-A的重組轉(zhuǎn)化子 pET22b-〇rexin_A-〇rigami 〇
[0032] 實(shí)施例3 : 利用大腸桿菌基因工程菌pET22b-〇rexin-A_0rigami生產(chǎn)重組斜帶石斑魚orexin-A : 挑取大腸桿菌基因工程菌pET22b-〇rexin-A-0rigami單菌落接種在含有100ug/ml氨節(jié)青 霉素、50ug/ml鏈霉素、25ug/ml四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)過(guò)夜，次日 按1:50接種量接種于適當(dāng)體積的相同培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至八_為0. 5?0. 6,加入IPTG (終濃度為〇. 8mmol/l)和20%葡萄糖(終濃度為0. 2%)，于37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)6小時(shí)后收菌。 合成的斜帶石斑魚胚胎期orexin-A在大腸桿菌基因工程菌pET22b-〇rexin-A-0rigami中 已獲得商效表達(dá)。
[0033] 取少量細(xì)胞加2X電泳上樣緩沖液，煮沸5分鐘后按標(biāo)準(zhǔn)方法跑SDS-PAGE凝膠 電泳。結(jié)果見(jiàn)圖9,顯示經(jīng)誘導(dǎo)的pET22b-〇rexin-A_0rigami在約7kD的位置上出現(xiàn)一 條新的蛋白帶，未誘導(dǎo)的pET22b-〇rexin-A-0rigami不出現(xiàn)此帶，證明斜帶石斑魚胚胎期 orexin-A 已在 pET22b-〇rexin_A-〇rigami 中誘導(dǎo)表達(dá)，見(jiàn)圖 3。
[0034] 將重組斜帶石斑魚胚胎期orexin-A采用免疫印跡(Western blot)方法進(jìn)行免疫 活性鑒定。一抗為兔抗His標(biāo)簽單克隆抗體，二抗為羊抗兔IgG-AP。結(jié)果見(jiàn)圖4,顯示兔抗 His標(biāo)簽單克隆抗體能識(shí)別我們用大腸桿菌表達(dá)的融合orexin-A蛋白。
[0035] 將SDS-PAGE上的蛋白進(jìn)行點(diǎn)靶后進(jìn)行時(shí)間飛行質(zhì)譜MS/MS檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明目 標(biāo)蛋白與預(yù)期蛋白完全匹配，見(jiàn)圖5、6。結(jié)合pET22b-〇rexin_A重組子的DNA測(cè)序結(jié)果，證 明得到的蛋白是重組斜帶石斑魚orexin-A。
[0036] 實(shí)施例4 用人工合成超純級(jí)別重組斜帶石斑魚orexin-A進(jìn)行腹腔注射斜帶石斑魚并測(cè)定 orexin-A對(duì)石斑魚糖代謝調(diào)控功能的檢測(cè)。
[0037] 實(shí)驗(yàn)用石斑魚馴養(yǎng)于循環(huán)海水養(yǎng)殖池中，自然光照，每天早7:00和晚6:00分別進(jìn) 行飽食投喂，馴養(yǎng)兩周，在注射實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，對(duì)實(shí)驗(yàn)用魚進(jìn)行饑餓3天處理。對(duì)于orexin-A 注射組，實(shí)驗(yàn)魚隨機(jī)分成4組，每組44條，分別注射0ng/g B.W.、10ng/g B.W.、100ng/g B.W.、1000ng/g B.W.的0ΧΑ，0ΧΑ用PBS稀釋，對(duì)照組0ng/g B.W.注射PBS。每組注射后 0h、2h、4h、6h取肝臟、肌肉（白肌)，液氮速凍，保存于-80°C備用。對(duì)于orexin-A+葡萄糖注 射組，實(shí)驗(yàn)魚隨機(jī)分成4組，每組44條，分別注射0ng/g B.W.、10ng/g B.W.、100ng/g B.W.、 1000ng/g B. W.的0ΧΑ，OXA用0. 002 g/g的葡萄糖（PBS溶解）溶液稀釋，對(duì)照組0ng/g B.W.注射0.002 g/g B.W.的葡萄糖。每組注射后011、211、411、611取肝臟、肌肉（白肌)，液氮 速凍，保存于-80 °C備用。
[0038] 所取樣本參照Trizol Reagent (Invitrogen, Inc.)說(shuō)明書進(jìn)行RNA提取，參照 Toyobo FSK-100試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，參照Toyobo SYBR-Green說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)突光 定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)量變化。試驗(yàn)結(jié)果如圖7、8、9、10、11、12、13、14。Orexin-A在 肝臟、肌肉中均以葡萄糖依賴的特性刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白glut-1，glut-4的表達(dá)量上調(diào)。
[0039] 實(shí)施例5 orexin-A蛋白作為飼料添加劑投喂斜帶石斑魚魚苗對(duì)石斑魚生長(zhǎng)特性的影響 實(shí)驗(yàn)用斜帶石斑魚購(gòu)自廣東省大亞灣養(yǎng)殖示范基地，共480尾，體重平均為50g，體長(zhǎng) 平均15cm。馴養(yǎng)于循環(huán)海水養(yǎng)殖池中，自然光照，每天早7:00和晚6:00分別進(jìn)行飽食投 喂，馴養(yǎng)兩周。馴化完成后，條件與馴化時(shí)期相同，在投喂前進(jìn)行蛋白噴灑，使蛋白均勻噴灑 到飼料表面，投喂前后進(jìn)行飼料稱重記錄。長(zhǎng)期投喂添加重組Orexin-A的飼料對(duì)斜帶石斑 魚體重的影響見(jiàn)圖15,對(duì)照組投喂噴灑滅菌超純水的常規(guī)含糖飼料，實(shí)驗(yàn)組在常規(guī)含糖飼 料的基礎(chǔ)上添加不同劑量的重組Orexin-A，實(shí)驗(yàn)連續(xù)投喂6周，所得數(shù)據(jù)用標(biāo)準(zhǔn)差土標(biāo)準(zhǔn) 誤來(lái)表示（n=40)，標(biāo)記星號(hào)表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比產(chǎn)生的顯著性差異水平，顯著性結(jié)果 通過(guò)單因素方差分析得到，采用Duncan分析方法f P〈0. 05)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果通過(guò)SPSS19. 0軟件 分析得到。
[0040] 長(zhǎng)期投喂添加重組Orexin-A的飼料對(duì)斜帶石斑魚血糖和肝肌糖原的影響見(jiàn)圖 16,對(duì)照組投喂噴灑滅菌超純水的常規(guī)含糖飼料，實(shí)驗(yàn)組在常規(guī)含糖飼料的基礎(chǔ)上添加不 同劑量的重組Orexin-A，實(shí)驗(yàn)連續(xù)投喂6周后取血清、肝臟、肌肉樣本分析血糖和肝肌糖 原含量。所得數(shù)據(jù)用標(biāo)準(zhǔn)差土標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示（n=40)，標(biāo)記星號(hào)表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比 產(chǎn)生的顯著性差異水平，顯著性結(jié)果通過(guò)單因素方差分析得到，采用Duncan分析方法C P〈0. 05)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果通過(guò)SPSS19. 0軟件分析得到。
【權(quán)利要求】
1. 斜帶石斑魚orexin-Α基因在調(diào)控石斑魚糖代謝中的應(yīng)用。
2. 斜帶石斑魚orexin-A蛋白在制備石斑魚苗種促生長(zhǎng)劑或飼料添加劑中的應(yīng)用。
3. -種石斑魚種苗促生長(zhǎng)劑或飼料添加劑，其特征在于，所述促生長(zhǎng)劑或飼料添加劑 中含有有效劑量的重組斜帶石斑魚orexin-A蛋白。
4. 斜帶石斑魚orexin-A基因在上調(diào)肝臟或肌肉中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白glut-Ι或glut-4 表達(dá)量中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，orexin-A基因是以葡萄糖依賴的特性刺激 上調(diào)肝臟或肌肉中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白glut-Ι或glut-4的表達(dá)量。
【文檔編號(hào)】A23K1/16GK104212807SQ201410357846
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】李文笙, 張聰 申請(qǐng)人:中山大學(xué)