專利名稱：石斑魚生長激素特異性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫化學(xué)試驗(yàn)物質(zhì)，更具體地說是涉及一種石斑魚生長激素特異性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
斜帶石斑魚屬于鱸形目魚旨科，主要分布在東南亞沿海近礁水域，為底棲肉食性魚類，其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價(jià)值很高，是我國南方重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚種。斜帶石斑魚的生長主要通過生長激素(Growth hormon，GH)調(diào)節(jié)。魚類GH是由173-190氨基酸組成的單鏈蛋白質(zhì)，分子量在20-23KD之間。魚類GH參與營養(yǎng)物質(zhì)的能量代謝，在魚類的生長、繁殖及滲透壓調(diào)節(jié)等方面起重要作用。
研究GH對(duì)生長的調(diào)控，首先必須得到GH的純品。最早的魚類GH分離工作可以追溯到1955年，Wilhelmi A E從鱈魚垂體中分離出GH樣蛋白，但未進(jìn)行純化。1976年Farmer首次從羅非魚垂體中分離并純化了GH。自此魚類GH的分離純化工作拉開了序幕。
隨著研究的深入，GH含量的測(cè)定顯得越來越重要。有人利用人GH放免測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定了大麻哈魚血清和垂體中的GH水平，事實(shí)上，人與大麻哈魚GH的同源性僅為35％，顯然，異源GH放免測(cè)定法缺乏特異性，靈敏度也很低。直到80年代，包括鯉魚、大麻哈魚、鱘魚、鰻鱺、日本鰈等多種魚類GH純品紛紛獲得，相應(yīng)的特異性的抗體得以制備，為魚類同源GH放免測(cè)定法的建立奠定了基礎(chǔ)。1983年，Cook首次建立了鯉魚GH同源放免測(cè)定系統(tǒng)，靈敏度達(dá)到5ng/ml，之后，大鱗大麻哈魚、羅非魚、日本鰻鱺、胡子鯰等多種魚類GH同源放免測(cè)定法相繼建立，并成為目前魚類GH水平測(cè)定的主要方法。
魚類GH放免測(cè)定方法的原理與人的相同，主要采用具有放射性的同位素125I標(biāo)記GH純品，與樣品中的GH共同競(jìng)爭(zhēng)特異性的一抗，加入相應(yīng)的二抗，通過層析、離心等方法將結(jié)合抗體的標(biāo)記抗原與未標(biāo)記抗原分離，測(cè)定結(jié)合抗體的標(biāo)記抗原的放射性比活，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可算出樣品中GH的含量。這種系統(tǒng)由于使用了放射性碘作為標(biāo)記物，具有很高的靈敏度，同時(shí)采用特異的一抗與抗原結(jié)合，具有很好的特異性，但正因?yàn)槭褂昧朔派湫詷?biāo)記物，使得此系統(tǒng)存在明顯的缺點(diǎn)高輻射危害人體健康，污染環(huán)境，高輻射對(duì)標(biāo)記蛋白同樣存在損害以及放射性碘的半衰期短(60天)，使得標(biāo)記物穩(wěn)定性不夠，需定期標(biāo)記；同時(shí)125I放出的γ射線能量很低，需靈敏的γ射線檢測(cè)儀才能測(cè)出，這就使得GH的放免測(cè)定技術(shù)難以在一般實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，限制了放免分析方法的普及。
與放免測(cè)定技術(shù)相比，激素的酶聯(lián)免疫測(cè)定具有無放射性污染，標(biāo)記物穩(wěn)定，標(biāo)記酶來源廣泛、經(jīng)濟(jì)，靈敏度、特異性與放免測(cè)定相當(dāng)?shù)忍攸c(diǎn)，使得激素的酶免測(cè)定方法有望替代放免測(cè)定技術(shù)。但酶聯(lián)免疫測(cè)定需要較多的激素標(biāo)準(zhǔn)品，用常規(guī)的垂體抽提技術(shù)需要大量的垂體。近年來，分子生物學(xué)的發(fā)展使得人們可以將魚GH基因?qū)氪竽c桿菌中并在其中高效表達(dá)，經(jīng)純化后，可以滿足酶聯(lián)免疫測(cè)定的需要。1991年，Takahashi A采用大麻哈魚垂體分離純化的天然GH制備特異性抗體，用重組大腸桿菌表達(dá)并純化的GH標(biāo)記上辣根過氧化物酶，建立了競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫測(cè)定系統(tǒng)，測(cè)定了垂體孵育液中的GH水平，該系統(tǒng)可檢測(cè)到每管0.625ng GH。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種無放射污染、使用方便、靈敏度高的石斑魚生長激素特異性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述試劑盒的制備方法。
本發(fā)明的石斑魚生長激素特異性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，由固相載體以及包被在其表面的純化的抗石斑魚生長激素的特異性抗體組成。
上述的石斑魚生長激素特異性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，固相載體為96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板。
本發(fā)明的石斑魚生長激素特異性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括如下步驟(1)抗原的制備將克隆的石斑魚生長激素基因在大腸桿菌中表達(dá)，得到的融合蛋白，經(jīng)純化后作為抗原；(2)抗體的制備將(1)中的抗原免疫兔制備特異性的抗石斑魚生長激素抗體；(3)抗體的純化(2)中所得的抗體經(jīng)離心、沉淀、脫鹽，得純化抗體；(4)純化抗體的標(biāo)記用酶標(biāo)記(3)中所得的純化抗體；(5)試劑盒的制備用(3)中所得的純化抗體包被固相載體。
上述的制備方法，所用的酶為辣根過氧化物酶。
本發(fā)明的試劑盒的使用方法，包括如下的操作步驟(1)加入樣品，使樣品中的生長激素蛋白與載體上的抗體相結(jié)合，洗去未結(jié)合的多余的非特異性雜蛋白；(2)使結(jié)合的生長激素蛋白與酶標(biāo)記的抗體相結(jié)合，洗去未結(jié)合的多余的酶標(biāo)記物；(3)加入底物，室溫作用，檢測(cè)酶標(biāo)記抗體中酶的催化活性。
本發(fā)明建立了雙抗體夾心法測(cè)定樣品中的生長激素水平，測(cè)試靈敏度可達(dá)到0.4ng/ml，為石斑魚GH的研究提供了有效的檢測(cè)手段。
B.試劑pGEM-T Easy Vector Systems(購自Premega Corporation)；Plasmid Miniprep Kit I、Gel Extraction Kit(Omega產(chǎn)品)；Ex Taq Polymerase、Kpn I、EcoR I、T4 DNA ligase(Takara Biotech產(chǎn)品)；100bp DNA Marker(MBI Fermentas產(chǎn)品)；Low Moleclar Weight Protein marker(Sigma產(chǎn)品)；瓊脂糖、Tris-base、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺(Gibico產(chǎn)品)；TEMED、過硫酸銨、Tween-20(Sigma產(chǎn)品)；羊抗兔-生物素、NBT-BCIP(購自華美生物工程公司)；鏈親和素-堿性磷酸酶(購自北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心)；硝酸纖維膜(PALL Gelman Laboratory Technical Service產(chǎn)品)；以下為國產(chǎn)分析純?cè)噭┲亟M黑棘鯛生長激素(Acanthopagrusbutcheri GH)、兔抗鯛魚多克隆抗血清(Rabbit Anti-Acanthopagrusbutcheri Polyclonal Antiserum，RAB)為GroPep公司產(chǎn)品(Australia)。
C.儀器電泳儀及電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)為Bio-rad產(chǎn)品。2.斜帶石斑魚生長激素基因的克隆以斜帶石斑魚生長激素cDNA為模板，用正向引物5`-TCATGGTACCCAGCCAATCACAGACGGCCAG-3`，反向引物5`-GACTGAATTCCTACAGGGTACAGTTGGCCTC-3`擴(kuò)增出560bp DNA片段，用Gel ExtractionKit回收此560bp片段，Kpn I、EcoR I雙酶解PCR產(chǎn)物，膠回收純化后，與Kpn I、EcoR I雙酶解的質(zhì)粒pBluscript-SK連接，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)篩選得到質(zhì)粒pBSK-rGH，酶切及PCR鑒定表明含560bp插入片段，膠回收此560bp片段，與Kpn I、EcoR I雙酶解的質(zhì)粒pRSETB連接，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)細(xì)胞，用X-gal、IPTG在Amp-LB平板上篩選得到多個(gè)重組子，PCR、酶切鑒定出9個(gè)陽性克隆。3.斜帶石斑魚生長激素基因的表達(dá)及其檢測(cè)陽性克隆6pRSETB-rGH-BL21用0.4mM IPTG于0.5、1、2、4小時(shí)誘導(dǎo)，檢測(cè)表達(dá)情況。在26KD處有一條蛋白帶呈逐漸增加趨勢(shì)，受體細(xì)胞BL21無此帶，未誘導(dǎo)的6pRSETB-r6H-BL21有很淡26KD帶，經(jīng)Western Blot表明，此帶為重組GH蛋白帶，見

圖1，未誘導(dǎo)的6pRSETB-rGH-BL21有少量GH基礎(chǔ)表達(dá)。凝膠掃描算出IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)，GH蛋白的表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白43％。結(jié)果表明，質(zhì)粒6pRSETB-rGH表達(dá)出的融合蛋白分子量為26KD，高效表達(dá)，為下一步制備GH抗體打下了基礎(chǔ)。4.融合蛋白的純化(1)細(xì)菌的培養(yǎng)將質(zhì)粒6Prsetb-gGH轉(zhuǎn)化BL21受體細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，按125-50接種1L LB液體培養(yǎng)基，至菌液OD600為0.6時(shí)，加入1mM IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)6小時(shí)，5000g，30分鐘離心收集細(xì)菌。
(2)細(xì)菌的裂解將細(xì)菌顆粒懸于懸浮液(10mM Tris.Cl pH7.1)，按0.5mg/ml濃度加入溶菌酶，室溫作用30分鐘。-20℃凍融三次，以利于細(xì)胞裂解。將菌懸液于冰上用超聲波打碎細(xì)胞，作用3-6次，30秒/次，中間間隔30秒，使大部分細(xì)菌裂解。
(3)包涵體的洗滌與溶解用9倍體積的洗滌液(10mM Tris.ClpH7.1-0.1％Triton X-100)懸浮細(xì)菌裂解物，4℃，12000g，30分鐘離心洗滌包涵體三次，得到純凈的包涵體。向包涵體中加入200ml裂解液(0.1mM NaH2PO4-0.01mM Tris.Cl pH8.0-8M Urea)慢慢混勻，直至包涵體完全溶解，離心取上清，經(jīng)0.45um微孔濾膜過濾，濾出液用于下步純化。12％SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白濃度情況。
(4)融合蛋白的純化將融合蛋白溶液稀釋成200ug/ml濃度，用HisTrap Kit(Amersham pharmacia Biotech)親合層析柱純化目的蛋白，所用試劑為Charge buffer0.1M NiSO4MTPBS150mM NaCl-16mM Na2HPO4-4mM NaH2PO4Ph8.0Binding buffer20mM phosphate buffer pH7.6-0.5M NaCl-30mMimidazoleElution buffer20mM phosphate buffer pH7.6-0.5M NaCl-400mMimidazole
Strip buffer100mM EDTA-20mM phosphate buffer pH7.6操作1.按試劑盒說明準(zhǔn)備好HisTrap 1ml預(yù)裝柱及以上試劑。
2.用注射器加10ml binding buffer平衡柱3.加樣品，流速控制在1-3ml/min.
4.用10ml binding buffer洗柱，收集洗出液.
5.加5ml elution buffer洗脫，按1ml每管收集洗脫液.
6.以上各收集液上SDS-PAGE電泳檢測(cè)，合并含單一目的條帶收集液，于20mM phosphate buffer pH7.6透析去imidazole，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定目的蛋白的濃度，分裝后凍存于-80℃。
BCA蛋白(Micro BCATM Protein Assay Reagent Kit，Pierce)定量1.按試劑盒說明準(zhǔn)備BCA工作液及制作標(biāo)準(zhǔn)曲線2.取150ul樣品，加入150ul BCA工作液，混勻作用30秒3.60℃溫浴1小時(shí)，取出冷至室溫4.于562nm讀OD值5.查標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品的蛋白濃度結(jié)果見附圖2，獲得一條單一的蛋白帶。二、特異性抗體的制備A、免疫程序自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心購入成年新西蘭大耳雄兔兩只，其中一只用做免疫兔，另一只做對(duì)照。取純化融合蛋白100ug溶液，與等體積Freund完全佐劑混勻，采用四肢、背部皮下多點(diǎn)注射，第一次注射10天后進(jìn)行第二次免疫，之后每周免疫一次，最后一次注射200ug進(jìn)行加強(qiáng)免疫，15天后自頸動(dòng)脈放血，制備血清，每次注射前自耳靜脈采取1ml血用于效價(jià)測(cè)定。
B、直接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)取純化融合蛋白包被96孔板，每孔1ug蛋白/100ul，4℃包被過夜，洗板三次后，用1％BSA溶液封閉，37℃作用2小時(shí)，加入倍比稀釋的血清，每孔100ul，37℃半小時(shí)，洗板三次，每次5分鐘，加入HRP-羊抗兔IgG1(1∶1000，華美生物工程公司)，37℃半小時(shí)，洗板三次后，加入OPD，反應(yīng)半小時(shí)后，加入2N H2SO4終止反應(yīng)，于OD490比色。測(cè)定結(jié)果如表1表1抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果免疫 時(shí)間 效價(jià)第一次免疫 10天后 1∶64第二次免疫 17天后 1∶8000第三次免疫 24天后 1∶64000第四次免疫 34天后 1∶80000三、抗體的純化1、取4.2ml斜帶石斑魚的特異性抗血清，加入等體積4.2ml PBS(0.01M，Ph7.8)，混勻。
2、邊攪邊加入硫酸銨飽和溶液8.4ml，使成50％飽和度，4℃放60分鐘。
3、4000rpm離心20分鐘，棄上清，用飽和硫酸銨∶PBS＝4.2∶4.2混合后的溶液清洗沉淀二次，去上清。
4、將沉淀溶于4.2ml PBS中，滴加飽和硫酸銨溶液2.1ml，使成30％飽和度，4℃放30分鐘，離心去上清，重復(fù)該步一次。
5、脫鹽沉淀溶于0.84ml生理鹽水，移入透析袋中，于生理鹽水中透析至析出液中沒有SO42-，用1％BaCl2溶液滴定檢測(cè)SO42-。再換一次透析液，制得純化抗體粗品1.5ml。四、純化抗體的標(biāo)記1、將10mg辣根過氧化物酶溶于0.2ml 1.25％戊二醛-0.1M PBS(Ph6.8)，室溫作用18小時(shí)，透析去戊二醛。
2、加生理鹽水至1ml，加5mg抗體，加入0.1ml 1M碳酸鹽緩沖液(Ph9.6)，4℃放24小時(shí)。
3、加入0.1ml0.2M賴氨酸，室溫作用2小時(shí)，于0.15M PBS(Ph7.2)中，充分透析。
4、離心去沉淀，上清即為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體。五、ELISA檢測(cè)斜帶石斑魚生長激素系統(tǒng)的建立及使用1、常規(guī)直接ELISA先預(yù)試酶標(biāo)抗體的最適工作濃度為1∶600。用直接ELISA確定包被固相酶標(biāo)板所用純化抗體的最適濃度為1∶800。2、包被用Ph9.5碳酸鹽緩沖液稀釋前述純化抗體(1∶800)，包被96孔板，100ul/孔，4℃包被過夜，陰性對(duì)照孔設(shè)4個(gè)/板，，用正常兔血清包被?？瞻讓?duì)照孔設(shè)4孔/板，加入包被液100ul。包被液0.0MNa2CO3-NaHCO3buffer(Ph9.6)。3、洗板，用自動(dòng)洗板機(jī)洗板三次，5分鐘/次，洗滌液為TTBS(20mMTris-0.8％NaCl-0.1％Tween 20，Ph7.5)。4、封閉用1％BSA封閉酶標(biāo)板上沒有結(jié)合上抗體的位點(diǎn)。200ul/孔，室溫作用1小時(shí)。洗板。5、加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋液，100-0.0457ng/ml，100ul/孔。樣品稀釋液1％BSA-TTBS，室溫作用1小時(shí)。陰性對(duì)照孔分別加入100、11.1、1.235ng/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。洗板。6、加入酶標(biāo)抗體(1∶600)，100ul/孔。7、加底物底物中含0.1M-檸檬酸鹽緩沖液-0.05％(wt/V)鄰苯二胺-
0.025％(V/V)H2O2暗處反應(yīng)20分鐘，加入2N H2SO4終止反應(yīng)，50ul/孔，10分鐘后讀取OD490，空白管調(diào)零。樣品測(cè)出OD490后查標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品中生長激素的含量。8、此系統(tǒng)的靈敏度為0.412ng/ml生長激素蛋白。
權(quán)利要求
1.一種石斑魚生長激素特異性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于由固相載體以及包被在其表面的純化的抗石斑魚生長激素的特異性抗體組成。
2.如權(quán)利要求1所述的石斑魚生長激素特異性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的固相載體為96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板。
3.如權(quán)利要求1或2所述的石斑魚生長激素特異性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的抗石斑魚生長激素的特異性抗體為抗斜帶石斑魚生長激素的特異性抗體。
4.權(quán)利要求1所述的石斑魚生長激素特異性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)抗原的制備將克隆的石斑魚生長激素基因在大腸桿菌中表達(dá)，得到的融合蛋白，經(jīng)純化后作為抗原；(2)抗體的制備將(1)中的抗原免疫兔制備特異性的抗石斑魚生長激素抗體；(3)抗體的純化(2)中所得的抗體經(jīng)離心、沉淀、脫鹽，得純化抗體；(4)純化抗體的標(biāo)記用酶標(biāo)記(3)中所得的純化抗體；(5)試劑盒的制備用(3)中所得的純化抗體包被固相載體。
5.如權(quán)利要求4所述的石斑魚生長激素特異性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于所述的酶為辣根過氧化物酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種石斑魚生長激素特異性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法，該試劑盒由固相載體以及包被在其表面的純化的抗石斑魚生長激素的特異性抗體組成；該試劑盒的制備方法包括抗原、抗體的制備、抗體的純化、純化抗體的標(biāo)記、試劑盒的制備等步驟；本發(fā)明的試劑盒，測(cè)試靈敏度可達(dá)到0.4ng/ml，為石斑魚生長激素的研究提供了有效的檢測(cè)手段。
文檔編號(hào)G01N33/535GK1403820SQ0213493
公開日2003年3月19日 申請(qǐng)日期2002年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月14日
發(fā)明者李文笙, 冉雪琴, 林浩然 申請(qǐng)人:中山大學(xué)