專利名稱：一種抗菌肽及其編碼序列和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗菌肽，特別是斜帶石斑魚抗菌肽，編碼該抗菌肽的核苷酸序列以及該抗菌肽的用途。
背景技術(shù)：
抗菌肽(antimicrobial peptide)是具有抗菌性短肽的總稱。1981年瑞典科學(xué)家Steiner等從惜古比天蠶(Hyatophora cecropia)蛹中分離得到一種殺菌肽，并將其命名為cecropin。到目前，已發(fā)現(xiàn)抗菌肽和類似抗菌肽的小分子短肽廣泛存在于生物界，包括細(xì)菌、動植物和人類。這種內(nèi)源性的抗菌肽經(jīng)誘導(dǎo)而合成，在機(jī)體抵抗病原體的入侵方面起著重要作用。抗菌肽具有廣譜殺菌作用，大多數(shù)對革蘭氏陽性菌有較殺滅作用，有些則對革蘭氏陽性菌和陰性菌均起作用，對某些真菌、原生動物、尤其對耐藥性細(xì)菌有殺滅作用。
隨著人們生活水平的提高，對海產(chǎn)品的需求愈來愈大。石斑魚是馳名世界的名貴海產(chǎn)魚類之一，其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，深受各地消費(fèi)者的喜愛。由于養(yǎng)殖密度不斷增高，以及人類活動的影響、環(huán)境的污染，造成石斑魚的育苗和養(yǎng)成過程受到病毒、細(xì)菌和寄生蟲的襲擊，造成養(yǎng)殖成活率低于50％，成為制約石斑魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素。
對于細(xì)菌病，目前主要應(yīng)用抗生素進(jìn)行防治。后果造成了環(huán)境污染；使魚的品質(zhì)口味下降；同時(shí)病原體的抗藥性增強(qiáng)，使化學(xué)藥物和抗生素的用量越來越大，但病害問題并未解決；農(nóng)藥和抗生素的殘留影響了水產(chǎn)品的質(zhì)量，如日本和歐盟國家都曾因抗生素殘留問題而拒絕進(jìn)口中國的水產(chǎn)品。尋找新的生物防治的方法，調(diào)動和開發(fā)石斑魚自身的免疫防御潛力，是保證食品安全和環(huán)境安全的必要手段，是開展健康養(yǎng)殖、實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要戰(zhàn)略。
魚類生活于富含各種各樣微生物的水環(huán)境中，長期的生存適應(yīng)使其形成了有效的防御機(jī)制。魚類天然免疫是抵抗感染的第一道防線，能有效阻止微生物的吸附、侵入與復(fù)制。由于是非特異的，不必依賴于對病原特異分子結(jié)構(gòu)的識別，因而可對多種入侵病原發(fā)生反應(yīng)；而且這種反應(yīng)迅速，沒有時(shí)間延遲，即便是經(jīng)過誘導(dǎo)產(chǎn)生也只有很短的時(shí)間延緩，這樣給病原體留下較少的生存時(shí)間。目前認(rèn)為，非特異性天然免疫對于魚類比對于恒溫動物更為重要，在抵抗感染中發(fā)揮重要作用。
隨著研究的深入，一些重要的魚類抗菌肽基因正陸續(xù)被克隆?，F(xiàn)已從美洲黃蓋鰈、鱸魚、真鯛中克隆到一些抗菌肽基因。另從一些魚類中獲得了具有抗菌肽活性的肽，如豹鰨、海士鰓鰻、海鞘、泥鰍、鯰等。研究表明，魚類抗菌肽是魚體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，當(dāng)魚體受到損傷或病原微生物侵襲時(shí)，能迅速產(chǎn)生抗菌肽以預(yù)防和殺傷病原微生物的入侵。其合成速度快，在體內(nèi)擴(kuò)散迅速、靈活的特點(diǎn)是其它大分子蛋白(如抗體)和免疫細(xì)胞所不具備的。
目前研究證實(shí)許多抗菌肽對魚類特異性的甚至其它動物的病原微生物都具有殺傷活性。最低殺死濃度多在微摩爾水平。Jia等發(fā)現(xiàn)蜂毒肽-天蠶素重組肽和C端酰胺化的美洲黃蓋鰈抗菌肽可保護(hù)銀大麻哈魚抵御鰻弧菌(Vibrio anguillarum)的感染。隨著對水產(chǎn)養(yǎng)殖品種抗菌肽的分離、結(jié)構(gòu)與功能的研究，改造并合成既具有穩(wěn)定高效抗菌活性又具特異抗菌譜且同時(shí)對宿主無害的抗菌肽基因，并通過基因工程在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或某些藻類中進(jìn)行表達(dá)，以批量生產(chǎn)，將有希望成為對付水產(chǎn)養(yǎng)殖品種主要病原體特別是耐藥菌的新型藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的抗菌肽，以及編碼該抗菌肽的核苷酸序列和該抗菌肽的用途。
本發(fā)明通過構(gòu)建斜帶石斑魚白細(xì)胞cDNA文庫，并通過克隆挑選和測序，獲得了一種斜帶石斑魚抗菌肽的cDNA。同時(shí)，通過人工合成方法和原核表達(dá)載體重組表達(dá)方法，分別獲得了該抗菌肽cDNA所編碼的多肽片段，并經(jīng)試驗(yàn)證明該多肽片段具有較強(qiáng)的抗菌作用，是一種新的抗菌肽。
本發(fā)明的抗菌肽，其特征在于，它含有序列表序列<400>2中1至25位的氨基酸序列。它可以是序列表序列<400>2中1至25位、1至45位或-22至45位的氨基酸序列；優(yōu)選序列表序列<400>2中1至25位的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供編碼以上所述抗菌肽的多核苷酸。該多核苷酸含有編碼序列表序列<400>2中1至25位、1至45位或-22至45位的氨基酸序列的核苷酸序列或它們的互補(bǔ)序列?？梢允切蛄斜硇蛄?amp;lt;400>1的核苷酸序列或其中的152～226位多核苷酸，或它們的互補(bǔ)序列。序列表序列<400>3是<400>1核苷酸序列的互補(bǔ)序列。
本發(fā)明還提供一種表達(dá)載體，它含有權(quán)利要求3，4或5所述的多核苷酸。該表達(dá)載體可以是在原核表達(dá)載體pTRX的多酶切位點(diǎn)插入上述的多核苷酸而構(gòu)建成的表達(dá)質(zhì)粒。
本發(fā)明還提供一種重組工程菌，它含上述的表達(dá)載體。它可以是將上述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(例如大腸桿菌BL21)而得到。
本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，上述本發(fā)明的抗菌肽，對多種細(xì)菌(包括多種水產(chǎn)細(xì)菌)有較強(qiáng)的殺滅作用(參見實(shí)施例二，表1)。因此，該抗菌肽可用于制備抗菌劑(特別是作為水生生物細(xì)菌病的預(yù)防和治療的抗菌劑)。
本發(fā)明的抗菌肽可通過以下方法之一制備1.根據(jù)所述抗菌肽的氨基酸序列(例如序列<400>2中1～25位氨基酸殘基的序列)，用固相合成法合成多肽，并將C端酰胺化。
2.將編碼所述抗菌肽的核苷酸序列(例如序列<400>1中152～226位的多核苷酸)克隆入重組表達(dá)載體，并將重組后的DNA轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，進(jìn)行重組表達(dá)。純化后獲得該抗菌肽。
本發(fā)明的抗菌肽及其多核苷酸序列還具有下列用途1.在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用該抗菌肽可通過浸泡、注射、添加于飼料等方法，用來預(yù)防和治療魚類或其它水生生物的細(xì)菌性疾病。
2.該抗菌肽與牛血清白蛋白偶聯(lián)后免疫動物，可以制備與抗菌肽特異性結(jié)合的抗體。該抗體可以用于檢測溶液中抗菌肽的存在，及通過免疫組化的方法檢測抗菌肽在魚體內(nèi)不同組織的表達(dá)情況。
3.將序列<400>1或與其互補(bǔ)的多核苷酸(包括DNA或RNA)，或其片段，進(jìn)行標(biāo)記后，可以通過Southern印跡、Northern印跡、基因芯片、微陳列等技術(shù)，檢測動物基因組中抗菌肽基因片段的存在，或檢測抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄情況。
4.根據(jù)序列<400>1或與其互補(bǔ)的多核苷酸設(shè)計(jì)引物，可通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測抗菌肽基因在動物體內(nèi)各組織中、不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄情況下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一斜帶石斑魚抗菌肽cDNA的獲取本發(fā)明人用Clontech公司SMARTcDNA文庫構(gòu)建試劑盒，構(gòu)建了斜帶石斑魚白細(xì)胞cDNA文庫，通過隨機(jī)挑取克隆測序，并將測得序列用BLAST程序與Genbank序列進(jìn)行比較，獲得了抗菌肽的cDNA。
1.斜帶石斑魚白細(xì)胞總RNA的提取健康斜帶石斑魚(重約600g)，腹腔注射polyIC(購自Amersham Pharmacia)0.4ml，濃度為2mg/ml。72h后，從尾靜脈抽血，加至四倍體積含肝素的生理鹽水。將此懸液緩慢加在二倍懸液體積的Ficoll-Paque Plus淋巴細(xì)胞分離液(購自Amersham Pharmacia)的表面。平衡后于室溫400×g離心30min。吸出中間層的白細(xì)胞，用生理鹽水洗兩次，每次于200×g離心15min并棄上清。細(xì)胞用1ml生理鹽水重懸，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，分裝至1.5ml離心管中，400×g離心2min棄上清。用Tripure試劑(購自Roche Diagnostics公司)提取總RNA。
2.cDNA一鏈的合成總RNA(0.25μg/μl) 3μlSMART III寡聚核苷酸1μlCDS III/3’PCR引物 1μl總體積 5μl將以上成分混勻，在離心機(jī)上甩一下，于72℃孵育2min。接著置冰浴2min。再在離心機(jī)上甩一下，然后于管中依次加入5×1st鏈緩沖液2.0μlDTT(20mmol/L) 1.0μldNTP mix(10mmol/L)1.0μlSUPERSCRIPTTMII反轉(zhuǎn)錄酶(200u/μl)1.0μl總體積10.0μl輕輕吹打混勻以上成分，在離心機(jī)上甩一下。加1滴礦物油，于42℃溫育1h。取出管子置冰浴終止第一鏈cDNA合成。
3.cDNA的長距離PCR取一0.5ml Eppendorf管依次加入1st鏈cDNA 2μl去離子水80μl10×cDNA PCR緩沖液 10μl50×dNTP mix2μl5’PCR引物 2μlCDS III/3’PCR引物 2μl50×Advantage cDNA聚合酶混合物 2μl總體積100μl輕彈管壁混勻以上成分，在離心上甩一下。加2滴礦物油，將反應(yīng)管置于已預(yù)熱至95℃的PCR儀上，進(jìn)行長距離PCR(LD-PCR)。
反應(yīng)程序?yàn)?1)95℃1min；(2)95℃ 15sec，68℃ 6min，30個(gè)循環(huán)。
反應(yīng)完畢，取5μl PCR產(chǎn)物，于1.1％瓊脂糖凝膠上，以0.1μg 1kb DNA Ladder為分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行電泳檢測。
4.LD-PCR產(chǎn)物的蛋白酶K消化于一滅菌0.5ml管加入50μl LD-PCR產(chǎn)物和2μl蛋白酶K(20μg/μl)，混勻，稍離心。將反應(yīng)管置于45℃孵育20min，稍離心。加50μl去離子水至管中，再加入100μl酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，來回緩慢顛倒1-2min。以14,000×g離心5min。移上層水相至一滅菌0.5ml管，加入10μl3mol/L NaAc溶液、1.3μl糖原溶液(20μg/μl)、260μl 95％乙醇(室溫)，立即于室溫以14,000×g離心20min。小心移去上清，用100μl 80％乙醇洗滌沉淀?？諝飧稍锍恋?～10min。接著加入79μl去離子水重懸沉淀。
5.cDNA進(jìn)行Sfi I酶切取一滅菌0.5ml管依次加入cDNA79μl10×Sfi I緩沖液 10μlSfi I酶(20u/μl)10μl100×BSA1μl總體積 100μl將管中以上成分充分混合，在離心上甩一下。置于50℃溫育2h。接著加入2μl 1％二甲苯青，充分混合。
6.cDNA的分部分離取16支1.5ml管，按1-16順序編號并依次放置在試管架上。將100μl Sfi I酶切的cDNA與二甲苯青混合物小心地逐滴加入到CHROMA SPIN-400柱子中基質(zhì)表面的中心，讓樣品被基質(zhì)充分吸收。用100μl CHROMA柱緩沖液洗柱。待緩沖液流盡后，加入600μl CHROMA柱緩沖液至柱中，立即開始逐滴收集流出的液滴到1#-16#管(約35μl/管)。每管分別取3μl收集液于1.1％瓊脂糖凝膠150V電泳10min，以0.1μg 1kb DNA為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在紫外燈下觀察cDNA帶的亮度。將亮度最高的，即cDNA含量最高的3管收集液集中至一1.5ml管，加入1/10體積3mol/L NaAc(pH4.8)、1.3μl糖原(20mg/ml)、2.5倍體積95％乙醇(-20℃)，緩慢地來回顛倒。將管置于-20℃放1h。室溫下14,000×g離心20min，小心移走上清，空氣干燥8～10min，用7μl去離子水重懸沉淀。
7.cDNA與載體的連接由于難以確定多少量的cDNA與載體連接效果最好，故進(jìn)行了一系列預(yù)連接和包裝反應(yīng)。按如下方法于3個(gè)0.5ml管內(nèi)建立3組連接-包裝反應(yīng)1#2#3#cDNA 0.5 1.0 1.5載體(500ng/μl) 1.0 1.0 1.010×連接緩沖液0.5 0.5 0.5ATP(10mmol/L) 0.5 0.5 0.5T4 DNA連接酶(400u/μl)0.5 0.5 0.5去離子水 2.0 1.5 1.0總體積(μl) 5.0 5.0 5.0將以上各管混勻后在離心上甩一下，于PCR儀上16℃溫育過夜。
8.連接產(chǎn)物的包裝按MaxPlax Lambda包裝提取物說明書進(jìn)行。
9.插入子的PCR擴(kuò)增從文庫平板隨機(jī)挑取單個(gè)噬菌斑，加至500μlλ噬菌體稀釋液，室溫放置1-2h，以使噬菌體從瓊脂中釋放出來。取1μl噬菌體做模板，用Advantage cDNA PCR試劑盒(購自Clontech公司)進(jìn)行PCR，鑒定插入子的大小。
所用引物λTriplEx 5’長距離插入子篩選引物(AP1)5’-CTC GGG AAG CGC GCC ATT GTG TTG GT-3’，λTriplEx 3’長距離插入子篩選引物(AP2)5’-ATA CGA CTC ACT ATA GGG CGA ATT GGC C-3’PCR反應(yīng)混合液10×PCR緩沖液5μl，AP1和AP2引物(每種10μmol/L)2μl，4×dNTP混合液(每種10mmol/L)1μl，cDNA聚合酶混合物1μl，水40.5μl。
PCR循環(huán)參數(shù)94℃，10min；30次循環(huán)94℃，30s；68℃，3min。68℃，3min。PCR結(jié)束后取5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。大于500bp的PCR產(chǎn)物，用PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒(購自上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行回收純化。
10.序列測定委托上?；瞪锕こ逃邢薰就瓿?。
11.測序結(jié)果的分析用美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的BLAST N和BLAST X工具，與GenBank的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較。發(fā)現(xiàn)一個(gè)序列與其它抗菌肽的cDNA有一定的同源性，經(jīng)分析確認(rèn)為是斜帶石斑魚的抗菌肽cDNA序列，該序列如序列表序列<400>1所示。
實(shí)施例二抗菌肽的固相化學(xué)合成及最低殺菌濃度的測定
1.抗菌肽的固相化學(xué)合成按序列表序列<400>2的1至25位氨基酸殘基的序列，委托深圳翰宇生物技術(shù)有限公司合成多肽，并將C末端酰胺化。合成后經(jīng)純化，達(dá)到85％的純度。
2.最低殺菌濃度的測定將不同細(xì)菌用營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基于37℃振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜菌用營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基稀釋至約2×105克隆形成單位每毫升(CFU ml-1)。分別取25μl菌液與等體積不同濃度的用1mmol/L醋酸緩沖液(pH4.0)稀釋的上述合成得到的抗菌肽溶液(400μg/ml至0.5μg/ml)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔中混勻，菌液與等體積醋酸緩沖液混勻做為對照，放于培養(yǎng)箱中37℃溫育1h，然后取孔中的液體涂于營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基平板，放37℃溫育過夜。數(shù)出平板上的菌落數(shù)目。與對照的平板相比，菌落數(shù)小于對照平板1％數(shù)目的平板的抗菌肽濃度做為對該菌的最低殺菌濃度(minimal bacteriacideconcentration，MBC)。結(jié)果如表1所示。
表1斜帶石斑魚抗菌肽對一些細(xì)菌的最低殺菌濃度細(xì)菌 MBC(μmol/L)副溶血弧菌 ＜0.131溶藻弧菌 0.262多殺性巴斯德桿菌 0.262摩根爾摩根菌 0.262溫和氣單胞菌 1.047大腸桿菌DH5α2.095創(chuàng)傷弧菌 4.190家畜葡萄球菌 ＞8.380枯草桿菌 ＞67.043熒光假單胞菌 67.043嗜水氣單胞菌 67.043腦膜炎膿毒性黃桿菌 ＜0.131如表1所示，該抗菌肽對多種細(xì)菌，特別是魚類最重要的病原菌弧菌類，有很好的殺滅作用，在制備抗菌劑以及魚類細(xì)菌病的預(yù)防和治療方面有著很大的應(yīng)用前景。
實(shí)施例三石斑魚抗菌肽在原核表達(dá)載體的重組表達(dá)根據(jù)序列表序列<400>1中152～226位多核苷酸的兩端序列和原核表達(dá)載體pTRX的多酶切位點(diǎn)，合成一對引物，序列如下上游引物，5‘CGGGGTACCGACGACGACGACAAATTT ATC TTC CAC ATC ATT 3’，其中單下劃線部分為KpnI酶切位點(diǎn)，雙下劃線為腸激酶切割位點(diǎn)。
下游引物，5‘CGGGCGGCCGCTCA GGC AAA AGC TTT CTC 3’，其中單下劃線部分為NotI酶切位點(diǎn)。
PCR擴(kuò)增、基因克隆皆按常規(guī)方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物約150bp。將目的基因(序列表序列<400>1的核苷酸序列或其中的152～226位多核苷酸)克隆到原核表達(dá)載體pTRX上，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pTRX-Epi，經(jīng)酶切鑒定和測序分析表明克隆的基因?yàn)槟康幕颉?br> 將表達(dá)質(zhì)粒pTRX-Epi轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。含目的基因的工程菌在37℃生長到OD600＝0.5時(shí)，立即加入終濃度為0.1mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)4小時(shí)。收集菌體，經(jīng)分離純化得到分子量為16kD的目標(biāo)蛋白。經(jīng)腸激酶切割并純化后，進(jìn)行N末端序列測定。結(jié)果表明所得到的目標(biāo)蛋白N末端氨基酸序列與序列表序列<400>2的N末端相符。
序列表<110>中山大學(xué)<120>一種抗菌肽及其編碼序列和用途<160>3<210>1<211>517<212>cDNA<213>斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)<220>
<221>CDS<222>(86)...(289)<400>1ggcagcatct gtagatctca cactacttga ttggccctct tcagtcacag ctttttgaca60ttcacgctga gtcactggaa agagg atg agg tgc atc gcc ctc ttt ctt gtg 112Met Arg Cys Ile Ala Leu Phe Leu Val-20 -15ttg tcg ctg gtg gtc ctc atg gct gaa ccc ggg gag ggt ttt atc ttc 160Leu Ser Leu Val Val Leu Met Ala Glu Pro Gly Glu Gly Phe Ile Phe-10 -5 -1 1cac atc att aaa gga ctc ttt cac gct ggc aag atg atc cat gga ctt 208His Ile Ile Lys Gly Leu Phe His Ala Gly Lys Met Ile His Gly Leu5 10 15gtc acc agg aga cga cat ggc gtg gaa gag ctg caa gac ctg gac caa 256Val Thr Arg Arg Arg His Gly Val Glu Glu Leu Gln Asp Leu Asp Gln20 25 30 35cgt gcc ttt gaa cga gag aaa gct ttt gcc tga gtctacgatg gtccatgtga 309Arg Ala Phe Glu Arg Glu Lys Ala Phe Ala ***40 45aagagccact ctttgcttaa atggggaaaa aaatatacat attgctgttg aatataatta 369aaaaaactgg ctcacgtggg taaccattgc aaaatatttc acactgatct aattgatttt 429tttggaagaa aacaaaaagt cagtgatttg aaataaatct ggaatctgtg ttacgcaaaa 489gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 517
<210>2<211>67<212>PRT<213>斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)<400>2Met Arg Cys Ile Ala Leu Phe Leu Val Leu Ser Leu Val Val Leu Met-20 -15 -10Ala Glu Pro Gly Glu Gly Phe Ile Phe His Ile Ile Lys Gly Leu Phe-5 -1 1 5 10His Ala Gly Lys Met Ile His Gly Leu Val Thr Arg Arg Arg His Gly15 20 25Val Glu Glu Leu Gln Asp Leu Asp Gln Arg Ala Phe Glu Arg Glu Lys30 35 40Ala Phe Ala45<210>3<211>517<212>cDNA<213>斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)<400>3tttttttttt tttttttttt ttttttgctt ttgcgtaaca cagattccag atttatttca 60aatcactgac tttttgtttt cttccaaaaa aatcaattag atcagtgtga aatattttgc 120aatggttacc cacgtgagcc agttttttta attatattca acagcaatat gtatattttt 180ttccccattt aagcaaagag tggctctttc acatggacca tcgtagactc aggcaaaagc 240tttctctcgt tcaaaggcac gttggtccag gtcttgcagc tcttccacgc catgtcgtct 300cctggtgaca agtccatgga tcatcttgcc agcgtgaaag agtcctttaa tgatgtggaa 360gataaaaccc tccccgggtt cagccatgag gaccaccagc gacaacacaa gaaagagggc 420gatgcacctc atcctctttc cagtgactca gcgtgaatgt caaaaagctg tgactgaaga 480gggccaatca agtagtgtga gatctacaga tgctgcc 51權(quán)利要求
1.一種抗菌肽，其特征在于，它含有序列表序列<400>2中1至25位的氨基酸序列。
2.按照權(quán)利要求1所述的抗菌肽，其特征在于它是序列表序列<400>2中1至25位、1至45位或-22至45位的氨基酸序列。
3.一種編碼權(quán)利要求1或2所述抗菌肽的多核苷酸。
4.按照權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，它是含有編碼序列表序列<400>2中1至25位、1至45位或-22至45位的氨基酸序列的核苷酸序列或它們的互補(bǔ)序列。
5.按照權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，它是序列表序列<400>1的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
6.按照權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，它是編碼序列表序列<400>2中1至25位的氨基酸序列的核苷酸序列或它的互補(bǔ)序列。
7.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3，4，5或6所述的多核苷酸。
8.一種重組工程菌，其特征在于，它含有權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體。
9.按照權(quán)利要求8所述的重組工程菌，其特征在于，它是將權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌而得到的。
10.權(quán)利要求1或2所述抗菌肽在制備抗菌劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗菌肽、編碼該抗菌肽的多核苷酸以及該抗菌肽的用途。該抗菌肽是含有序列表序列<400>2中1至25位的氨基酸序列。編碼該抗菌肽的多核苷酸是含有編碼序列表序列<400>2中1至25位、1至45位或－22至45位的氨基酸序列的核苷酸序列或它們的互補(bǔ)序列。該抗菌肽對多種細(xì)菌(包括多種水產(chǎn)細(xì)菌)有明顯的殺滅作用，對溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、多殺性巴斯德桿菌、溫和氣單胞菌、大腸桿菌、腦膜炎膿毒性黃桿菌的最低殺死濃度達(dá)小于10μmol/L，可用于制備抗菌劑，特別是用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病。
文檔編號A61P31/00GK1542017SQ20031011205
公開日2004年11月3日 申請日期2003年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月7日
發(fā)明者殷志新, 何建國, 顏江輝, 何薇 申請人:中山大學(xué)