本發(fā)明涉及蛋白修飾檢測的技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種用于檢測組蛋白豆蔻酰化修飾的重組蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
組蛋白是染色體的重要組成部分。組蛋白會經(jīng)歷100多種不同的翻譯后修飾，比如磷酸化、乙?；?、甲基化、泛素化和糖基化。這些翻譯后修飾是調(diào)控染色體的結(jié)構(gòu)和功能的重要方式，對發(fā)育、代謝、疾病等眾多生理過程均起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。研究這些組蛋白修飾具有重要意義，系統(tǒng)地定位這些組蛋白修飾已成為眾多國際性大課題的焦點。這些組蛋白修飾在基因組范圍的定位需要借助針對這些組蛋白修飾的特異性抗體。賴氨酸側(cè)鏈具有兩種特性：電荷豐富和親核性，適合翻譯后修飾與不同的親電底物以共價鍵結(jié)合。賴氨酸上可發(fā)生很多翻譯后修飾，如甲基化，乙?；锼鼗?，泛素化，豆蔻酰化和sumo化修飾等，這些修飾在細胞生理和病理中有重要作用。
組蛋白上的賴氨酸可被如甲基化，乙酰化，泛素化，sumo化、核糖體化和豆蔻酰化修飾等。其中，豆蔻?；卜Q十四酰化，采用豆蔻酸作為酰基進行的酰化作用，在基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)中具有重要的生物學功能。
目前，針對組蛋白不同位點賴氨酸上的豆蔻?；?，通常購買商業(yè)化的抗組蛋白特定修飾位點的多抗，但是經(jīng)動物免疫獲得的抗體價格昂貴，批次質(zhì)量不穩(wěn)定，容易發(fā)生交叉反應(yīng)，滿足特定位點修飾的抗體制備周期很長，產(chǎn)量低，嚴重制約了對組蛋白豆蔻酰化修飾的高通量檢測。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
(一)要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對組蛋白豆蔻?；揎椢稽c的商業(yè)化抗體價格昂貴，各批次質(zhì)量不穩(wěn)定，交叉反應(yīng)明顯，特定位點修飾的抗體制備周期長，產(chǎn)量低。
(二)技術(shù)方案
為了解決上述技術(shù)問題或者至少部分地解決上述問題，本發(fā)明提供了一種重組蛋白，重組蛋白的氨基酸序列包括優(yōu)化PHD結(jié)構(gòu)域序列，其中，優(yōu)化PHD結(jié)構(gòu)域序列為：
a)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或
b)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
應(yīng)當理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的重組蛋白包含優(yōu)化PHD結(jié)構(gòu)域序列SEQ ID NO.1片段，在不影響其活性的前提下，本發(fā)明的重組蛋白還包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列取代、缺失或增加一個或幾個氨基酸，具有與含有優(yōu)化PHD序列的重組蛋白同等活性的由優(yōu)化PHD序列衍生得到的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明通過區(qū)段優(yōu)化的方法優(yōu)化PHD1-PHD2結(jié)構(gòu)域，利用大腸桿菌Origami2DE3重組表達和純化含有PHD結(jié)構(gòu)域的重組蛋白，得到含優(yōu)化PHD結(jié)構(gòu)域序列的重組蛋白，該重組蛋白包含了N端多聚組氨酸標簽，提高對H3K14cr親和力。為了得到親和力更佳的重組蛋白，優(yōu)化的PHD結(jié)構(gòu)域序列選自DPF2。
在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，為了得到質(zhì)量穩(wěn)定的重組蛋白，重組蛋白的氨基酸序列還包括融合蛋白標簽的氨基酸序列。
在本發(fā)明一個實施方式中，融合蛋白標簽優(yōu)選為HA標簽、Myc標簽或FLAG標簽。
在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，可以利用大腸桿菌Origami2DE3重組表達和純化含有PHD結(jié)構(gòu)域的重組蛋白，該重組蛋白包含了N端多聚組氨酸標簽，中間的SUMO融合蛋白，隨后的PHD雙結(jié)構(gòu)域和C端的HA標簽(Myc標簽或FLAG標簽可選)，即HIS8-SUMO-PHD-HA，HIS8-SUMO-PHD-Myc或HIS8-SUMO-PHD-FLAG，在實驗室規(guī)模即可方便的純化得到大量的，質(zhì)量穩(wěn)定的重組蛋白。
在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，重組蛋白的氨基酸序列為：
a)SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；或
b)SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
應(yīng)當理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的重組蛋白包含優(yōu)化PHD結(jié)構(gòu)域序列SEQ ID NO.3(HIS8-SUMO-PHD-HA)、SEQ ID No.4(HIS8-SUMO-PHD-Myc)或SEQ ID No.5(HIS8-SUMO-PHD-FLAG)片段，在不影響其活性的前提下，本發(fā)明的重組蛋白還包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列取代、缺失或增加一個或幾個氨基酸，具有與上述含有優(yōu)化PHD序列的重組蛋白同等活性的由上述含有優(yōu)化PHD序列的片段衍生得到的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明涉及的SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5重組蛋白還分別包括了不同的免疫檢測標簽，方便了對后續(xù)抗體使用的兼容性，即只要含有上述3種通用標簽抗體之中的任何一個，都可以完整地實現(xiàn)檢測實驗。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明還提供了編碼上述重組蛋白的基因。
在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，上述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了提供含有上述基因的重組表達載體，可以方便轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細胞，進行重組蛋白的表達。在本發(fā)明一個實施方式中，可以為載體pET28a,來源于Novagen公司。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了含有上述表達載體的宿主細胞。在本發(fā)明中，可以使用商業(yè)化菌株，如BL21(DE3),OrigamiB(DE3)等含DE3溶源的大腸桿菌。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了上述重組蛋白的制備方法，包括：
1)首先全基因優(yōu)化合成HIS8-SUMO-PHD-HA核苷酸序列，翻譯的氨基酸序列與SEQ ID No.3所示序列保持一致；合成的基因克隆到pUC57載體中；
2)分別合成2對引物,以Myc序列或FLAG序列替換HA標簽序列，分別獲得含有SEQ ID No.4或SEQ ID No.5基因序列的pUC57載體；
3)含SEQ ID No.3或4或5的核苷酸序列通過酶切，亞克隆到pET28a載體或同等效果的pET系列載體中，篩選得到正確的重組載體，分別可以編碼SEQ ID No.3或4或5所示的氨基酸序列；
4)以步驟3)獲得的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21DE3或其它DE3溶源的大腸桿菌,可以得到該重組蛋白的可溶性表達；
5)依據(jù)步驟4)，從1L液體LB誘導表達的發(fā)酵液中獲得約30mgSEQ ID No.3或4或5氨基酸序列一致的重組蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了含有上述重組蛋白的檢測試劑盒。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了使用上述重組蛋白在檢測組蛋白位點豆蔻?；揎椫械膽?yīng)用。
更選地是，組蛋白位點為組蛋白H3中14位賴氨酸的位點。
在本發(fā)明的實施方式中，組蛋白可以取自人、鼠、馬、牛、豬、綿羊、山羊、雞、狗、貓、果蠅、線蟲和酵母等細胞中。
在該應(yīng)用中，使用上述重組蛋白與抗免疫標簽通用抗體以及HRP標記的羊抗鼠IgG多抗，經(jīng)過結(jié)合和信號放大，可得到高靈敏度的檢測效果。
其中，根據(jù)SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5所述的重組蛋白特征，在蛋白免疫印記檢測中，分別使用抗免疫標簽HA或Myc或FLAG通用抗體。
在該應(yīng)用中，以SEQ ID No.3所述的重組蛋白為例，檢測方法具體為：
1)提取待檢測蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜(NC)上，封閉，TBST洗滌；
2)使用PBS稀釋后的重組蛋白(HIS8-SUMO-PHD-HA)孵育，加入小鼠抗HA單抗和帶HRP的羊抗鼠IgG多抗孵育，觀察免疫印跡結(jié)果。
其中，在檢測方法的步驟1)中，通常為組織或細胞的細胞核蛋白質(zhì)，提取后，先在15％的聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，再將其轉(zhuǎn)移至NC膜上。
在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，檢測方法的步驟2)具體為：
21)使用SEQ ID No.2制備的重組蛋白孵育NC膜,,37℃孵育,使用TBST和TBS依次洗滌；
22)加入小鼠抗HA單抗,37℃孵育,使用TBST和TBS依次洗滌；
23)加入帶HRP的羊抗鼠IgG多抗孵育，加入TMB或ECL底物液，暗室反應(yīng)或曝光，觀察免疫印跡結(jié)果。
本發(fā)明提出的重組蛋白含有優(yōu)化PHD結(jié)構(gòu)域，可以提高對H3K14cr的特異性，同時，將上述優(yōu)化PHD結(jié)構(gòu)域與融合蛋白標簽結(jié)合，在實驗室規(guī)?？傻玫酱罅?、特異性強且質(zhì)量穩(wěn)定的重組蛋白。另外，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備重組蛋白的成本低，一次研發(fā)理論上可以無數(shù)次重復生產(chǎn)，容易實現(xiàn)標準化工藝和規(guī)?；a(chǎn)，從而保證批次間同質(zhì)性好，質(zhì)量穩(wěn)定。
使用商業(yè)化抗體時，每100次樣品實驗使用同樣的抗體，在保證實驗成功的基礎(chǔ)上平均消耗100ug抗體，平均成本為4500元，在成千上萬次的檢測中，這樣的抗體價格就十分昂貴。而使用PHD結(jié)構(gòu)域作為替代抗體，在一個制備周期內(nèi)，每毫克重組蛋白生產(chǎn)的平均成本不超過150元，加上使用通用抗體的市場價格,每100ug為500元，可以預期檢測成本至少降低5倍。因此將上述重組蛋白替代商業(yè)化抗體，實驗檢測成本將顯著降低。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)手段。若未特別指明，實施例中所用的試劑為市售。
實施例1
重組蛋白HIS8-SUMO-PHD-HA、HIS8-SUMO-PHD-Myc、HIS8-SUMO-PHD-FLAG的制備
1)首先全基因優(yōu)化合成HIS8-SUMO-PHD-HA核苷酸序列，翻譯的氨基酸序列與SEQ ID No.3所示序列保持一致，合成的基因克隆到pUC57載體中，基因兩端的限制性酶切位點為NcoI和XhoI。(pUC57為通用克隆載體；
2)分別合成2對引物,以Myc序列或FLAG序列替換HA標簽序列，以含有SEQ ID No.1基因序列的pUC57載體為模版,PCR擴增，DpnI消化母本質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞,經(jīng)測序驗證,分別獲得含有SEQ ID No.4或SEQ ID No.5基因序列的pUC57載體。翻譯的氨基酸序列與SEQ ID No.4或5所示氨基酸序列保持一致；
3)以NcoI和XhoI雙酶切含SEQ ID No.3或4或5基因序列的pUC57載體,回收對應(yīng)的基因序列,HIS8-SUMO-PHD-HA(Myc或FLAG),亞克隆到同樣雙酶切以及回收后的pET28a載體中，篩選得到正確的重組載體，分別可以編碼SEQ ID No.3或4或5所示的氨基酸序列；
4)以步驟3)獲得的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21DE3或其它DE3溶源的大腸桿菌,單克隆菌株活化到5ml LB液體培養(yǎng)基中，置于37度恒溫搖床中，220rpm振蕩培養(yǎng)當菌液OD600＝0.6時，加入0.2-0.5mM IPTG,0.1mM ZnCl2，恒溫16-25攝氏度誘導10h到15h,可以得到該重組蛋白的可溶性表達；
5)依據(jù)步驟4)，從1L液體LB誘導表達的發(fā)酵液中獲得約30mg SEQ ID No.3或4或5氨基酸序列一致的重組蛋白。
實施例2
重組蛋白的特異性檢測
ITC儀器設(shè)備：The titration was performed using MicroCal iTC200 system(GE Healthcare)
實驗方法參考儀器使用說明和標準設(shè)置。
主要步驟：確定合適的反應(yīng)物濃度，準備樣品；滴定，收集熱量數(shù)據(jù)；校正數(shù)據(jù)，擬合回歸，計算熱力學參數(shù)，最后分析模型。
1)所有檢測樣本置于恒溫25℃反應(yīng)。
2)合成待測的多肽10mg，使用ITC基礎(chǔ)緩沖液溶解。母液濃度為0.5mg/ml；其中，多肽序列源于H3K14cr，為組蛋白H3第14位賴氨酸上豆蔻酰化修飾；
其中，稀釋溶液：20mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH7.5；多肽工作濃度1-1.5mM；
3)重組蛋白濃度調(diào)整為0.5mg/ml，使用上述緩沖液稀釋，工作濃度0.05-0.08mM；
4)收集反應(yīng)的熱量數(shù)據(jù)，最終結(jié)果由Origin7擬合計算，解離常數(shù)Kd值為28.4nM。
通過ITC實驗，SEQ ID No.3所述的重組蛋白，對模擬多肽的親和常數(shù)Kd值為28.4nM。相比公開文獻中，源于DPF2蛋白的PHD結(jié)構(gòu)域，其Kd值為85nM，因此優(yōu)化后的PHD結(jié)構(gòu)域?qū)δM多肽的特異性提高了3倍，特異性得到了明顯的提高；在實際應(yīng)用中，可以減少重組蛋白的使用量或反應(yīng)孵育時間。
實施例3
重組蛋白HIS8-SUMO-PHD-HA(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)的蛋白免疫印跡WB(Western Blot)檢測，以人肝組織作為檢測樣本
3.1使用RIPA裂解液提取人肝組織細胞核蛋白.采用15％SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品中的蛋白質(zhì)，隨后電轉(zhuǎn)移蛋白到硝酸纖維素膜上；
3.2使用5％BSA或脫脂奶粉37度封閉1到2個小時,TBST洗滌3次，每次5min；用TBS洗滌3次，每次5min；
3.3使用重組的結(jié)構(gòu)域蛋白(HIS8-SUMO-PHD-HA)，孵育NC膜,工作濃度為2-30nM或0.2-2ug/ml,37℃孵育1到2個小時,使用TBST和TBS依次洗滌3次，每次5min；
3.4加入小鼠抗HA單抗,按說明書稀釋抗體(1:1000)，37度孵育2h,TBST洗滌3次，每次5min，再用TBS洗滌3次，每次5min；
3.5加入帶HRP的羊抗鼠IgG多抗(1:2000)，按說明書稀釋抗體，37度孵育2h,TBST洗滌3次，每次5min，用TBS洗滌3次，每次5min；
3.6加入ECL發(fā)光液，依次顯影，定影，曝光1-5min。觀察免疫印跡結(jié)果。
同樣使用SEQ ID No.4和5分別實施同樣的技術(shù)方案。
免疫印跡結(jié)果：
使用SEQ ID No.3或4和5進行免疫印記檢測的最優(yōu)使用濃度均可以低至5uM,依然可以得到良好的特異性條帶。沒有發(fā)生明顯的交叉反應(yīng)，說明3種重組蛋白共有的，經(jīng)優(yōu)化后的核心結(jié)構(gòu)域PHD，對組蛋白H3K14cr有更好的特異性結(jié)合。
最后，本發(fā)明的方法僅為較佳的實施方案，并非用于限定本發(fā)明的保護范圍。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
SEQUENCE LISTING
<110> 武漢博歐特生物科技有限公司
<120> 一種用于檢測組蛋白豆蔻?；揎椀闹亟M蛋白及其應(yīng)用
<130> KHP171111257.6
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 109
<212> PRT
<213> 優(yōu)化PHD序列
<400> 1
Asn Asn Tyr Cys Asp Phe Cys Leu Gly Asp Ser Lys Ile Asn Lys Lys
1 5 10 15
Thr Gly Gln Pro Glu Glu Leu Val Ser Cys Ser Asp Cys Gly Arg Ser
20 25 30
Gly His Pro Ser Cys Leu Gln Phe Thr Pro Val Met Met Ala Ala Glu
35 40 45
Lys Thr Tyr Arg Trp Gln Cys Ile Glu Cys Lys Cys Cys Asn Ile Cys
50 55 60
Gly Thr Ser Glu Asn Asp Asp Gln Leu Ile Phe Cys Asp Asp Cys Asp
65 70 75 80
Arg Gly Tyr His Met Tyr Cys Arg Thr Pro Ser Met Ser Glu Pro Pro
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Glu Gly Ser Trp Ser Cys His Leu Cys Leu Asp Leu Glu
100 105
<210> 2
<211> 327
<212> DNA
<213> 優(yōu)化PHD序列
<400> 2
aacaactact gtgatttctg tctgggcgac tccaaaatca acaaaaagac tggccagcct 60
gaggagcttg ttagctgctc cgattgtggg cgtagcgggc atcctagctg cttacaattt 120
acgcccgtga tgatggccgc tgaaaagaca taccgttggc agtgcatcga gtgcaagtgc 180
tgtaacattt gcggtacaag cgagaatgat gaccagctga ttttctgtga tgattgtgac 240
cgcggatatc atatgtattg ccgtacccca agtatgagtg agccgccgga ggggtcgtgg 300
tcatgccact tgtgccttga tttggaa 327
<210> 3
<211> 237
<212> PRT
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Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu
20 25 30
Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser
35 40 45
Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met
50 55 60
Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe
65 70 75 80
Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu
85 90 95
Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly
100 105 110
Gly Ala Thr Tyr Asn Asn Tyr Cys Asp Phe Cys Leu Gly Asp Ser Lys
115 120 125
Ile Asn Lys Lys Thr Gly Gln Pro Glu Glu Leu Val Ser Cys Ser Asp
130 135 140
Cys Gly Arg Ser Gly His Pro Ser Cys Leu Gln Phe Thr Pro Val Met
145 150 155 160
Met Ala Ala Glu Lys Thr Tyr Arg Trp Gln Cys Ile Glu Cys Lys Cys
165 170 175
Cys Asn Ile Cys Gly Thr Ser Glu Asn Asp Asp Gln Leu Ile Phe Cys
180 185 190
Asp Asp Cys Asp Arg Gly Tyr His Met Tyr Cys Arg Thr Pro Ser Met
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Ser Glu Pro Pro Glu Gly Ser Trp Ser Cys His Leu Cys Leu Asp Leu
210 215 220
Glu Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Tyr Pro Asp Tyr Ala
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<212> PRT
<213> HIS8-SUMO-PHD-Myc
<400> 4
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Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu
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