本發(fā)明屬于生物藥學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種多肽及其在治療急性腎損傷中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

急性腎損傷是一個(gè)在全球有較高死亡率的疾病，其腎小管細(xì)胞缺血或者受到毒性損傷造成腎功能的急劇下降。急性腎損傷是造成終期腎臟疾病的重要原因之一。每年1.33億人發(fā)生急性腎損傷并且大約每年造成170人死亡。

腎臟的缺血再灌注損傷是造成急性腎損傷的最主要原因，并在全球很高的死亡率。腎臟缺血再灌注的病理過程包括炎癥的發(fā)生和凋亡的出現(xiàn)。有效的抑制促炎細(xì)胞因子和凋亡能夠保護(hù)急性的腎臟缺血再灌注損傷?，F(xiàn)在的醫(yī)療技術(shù)還沒有比較有效的手段進(jìn)行治療，常以腎臟替代療法延長腎病患者的生存期，所以尋找緩解腎臟缺血再灌注損傷的藥物迫在眉睫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種多肽及其在應(yīng)用，其目的在于通過構(gòu)建C末端為羧基的11肽以及包含11肽氨基酸序列的22肽和32肽，并應(yīng)用于急性腎損傷修復(fù)，本發(fā)明的11肽和32肽對(duì)腎臟的缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用；22肽在一定程度上對(duì)腎臟的缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，由此解決現(xiàn)有技術(shù)對(duì)急性腎損傷缺乏有效治療手段的技術(shù)問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種多肽，所述多肽的氨基酸序列包括第一序列，所述第一序列為：

(1)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或

(2)與序列SEQ ID NO：1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID NO：1限定的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，表達(dá)產(chǎn)物具有與序列SEQ ID No：1表達(dá)蛋白具有同等活性的氨基酸序列。

優(yōu)選地，所述第一序列N端連接有第二序列，所述第二序列為：

(1)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或

(2)與序列SEQ ID NO：2限定的氨基酸序列同源性在80％至100％編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID NO：2限定的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，表達(dá)產(chǎn)物具有與序列SEQ ID No:2表達(dá)蛋白具有同等活性的氨基酸序列。

優(yōu)選地，所述第一序列N端連接有第三序列，所述第三序列為：

(1)由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；或

(2)與序列SEQ ID NO：3限定的氨基酸序列同源性在80％至100％編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID NO：3限定的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，表達(dá)產(chǎn)物具有與序列SEQ ID No:3表達(dá)蛋白具有同等活性的氨基酸序列。

按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種所述的多肽的應(yīng)用，應(yīng)用于制備治療急性腎臟損傷或糖尿病并發(fā)腎病的藥物。

按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種所述的多肽的應(yīng)用，應(yīng)用于制備修復(fù)DNA損傷的藥物或保健產(chǎn)品。

按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求所述的多肽和藥學(xué)上可接受的賦形劑。

按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種所述的藥物組合物的制備方法，包括將如權(quán)利要求1～3任意一項(xiàng)所述的多肽與至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑混合。

總體而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠取得下列有益效果。

本研究發(fā)現(xiàn)11肽以及包含11肽氨基酸序列的22肽和32肽可以抑制C57BL/6小鼠腎臟缺血再灌注損傷引起的炎癥的上調(diào)和DNA損傷的加劇，其中，11肽和32肽能夠?qū)毙阅I損傷較明顯的保護(hù)作用，其中以11肽效果尤為顯著，22肽在一定程度上也對(duì)腎臟的缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，本發(fā)明的11肽、22肽和32肽為制備治療缺血再灌注藥物奠定了基礎(chǔ)，為開發(fā)出更有效的治療藥物提供了新思路。

本發(fā)明的32肽和11肽能夠通過抑制DNA損傷蛋白如p-ATR、p-chk1和p-H2A.X等從而抑制腎臟缺血再灌注引起的DNA損傷；能夠抑制腎臟缺血再灌注引起炎癥因子的上調(diào)、炎癥細(xì)胞的浸潤；能夠減少腎臟缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡；能夠抑制腎臟缺血再灌注引起腎臟形態(tài)的惡化、纖維化相關(guān)基因的上調(diào)和纖維化蛋白的沉積。而22肽也能夠一定程度的緩解這些情況，但是32肽和11肽表現(xiàn)出更好的效果，尤其是11肽尤為顯著。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的11肽、22肽和32肽的氨基酸序列；

圖2是本發(fā)明11肽、22肽和32肽給藥后各組細(xì)胞的炎癥基因Kim1、Ilb、Icam1、Tnfa的相對(duì)mRNA水平以及DNA損傷和凋亡蛋白的測(cè)試；

圖3是本發(fā)明的11肽、22肽和32肽抑制H/R引起的DNA損傷以及細(xì)胞凋亡情況測(cè)試；

圖4是本發(fā)明11肽、22肽和32肽給藥后細(xì)胞存活率、DNA損傷相關(guān)蛋白和凋亡蛋白測(cè)試；

圖5是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖；

圖6是本發(fā)明的11肽、22肽和32肽給藥后腎臟功能測(cè)試；

圖7是本發(fā)明的11肽、22肽和32肽給藥后凋亡相關(guān)蛋白測(cè)試。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

本發(fā)明提供了一種多肽，所述多肽的氨基酸序列包括第一序列，所述第一序列為：

(1)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或

(2)與序列SEQ ID NO：1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID NO：1限定的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，表達(dá)產(chǎn)物具有與序列SEQ ID No：1表達(dá)蛋白具有同等活性的氨基酸序列。

優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽的氨基酸序列可以為：在所述第一序列N端連接有第二序列，所述第二序列為：

(1)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或

(2)與序列SEQ ID NO：2限定的氨基酸序列同源性在80％至100％編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID NO：2限定的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，表達(dá)產(chǎn)物具有與序列SEQ ID No:2表達(dá)蛋白具有同等活性的氨基酸序列。

優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽的氨基酸序列還可以為：在所述第一序列N端連接有第三序列，所述第三序列為：

(1)由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；或

(2)與序列SEQ ID NO：3限定的氨基酸序列同源性在80％至100％編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID NO：3限定的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，表達(dá)產(chǎn)物具有與序列SEQ ID No:3表達(dá)蛋白具有同等活性的氨基酸序列。

本發(fā)明的多肽可以應(yīng)用于制備治療急性腎臟損傷或糖尿病并發(fā)腎病的藥物，或應(yīng)用于制備修復(fù)DNA損傷的藥物或保健產(chǎn)品。

本發(fā)明的多肽通過與至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑混合制備得到藥物組合物。

作為其中的一種優(yōu)選，本發(fā)明設(shè)計(jì)、構(gòu)建了C末端為羧基的11肽(其序列為CMPLHSRVPFP-COOH)，包括11肽氨基酸序列的22肽(其序列為KLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP-COOH)以及32肽(QRPVNLTMRRKLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP-COOH)，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

本發(fā)明實(shí)施例中使用的C57BL/6小鼠購買于湖北動(dòng)物中心，本發(fā)明的11肽、22肽和32肽按照標(biāo)準(zhǔn)的固相多肽合成步驟合成。多肽合成方向?yàn)镃端到N端，首先是樹脂的溶脹，使用的是氯樹脂；然后將第一個(gè)氨基酸連在樹脂上；第一個(gè)氨基酸連在樹脂上需要double coupling即氨基酸與樹脂反應(yīng)兩次；隨后將氨基酸氨基端Fmoc基團(tuán)的去除(脫保護(hù))；再次是肽鏈延長的過程，經(jīng)過重復(fù)縮合、洗滌、脫保護(hù)、洗滌、縮合的步驟，按多肽序列從C端向N端逐一連接氨基酸，直至合成所需肽片段；隨著樹脂去溶脹及干燥、將肽段切除和粗肽的純化，即可合成我們需要的11肽、22肽和32肽。

本發(fā)明的32肽和11肽能夠通過抑制DNA損傷蛋白如p-ATR、p-chk1和p-H2A.X等從而抑制腎臟缺血再灌注引起的DNA損傷；能夠緩解腎臟缺血再灌注引起炎癥因子的上調(diào)、炎癥細(xì)胞的浸潤；能夠減少腎臟缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡；能夠緩解腎臟缺血再灌注引起腎臟形態(tài)的惡化、纖維化相關(guān)基因的上調(diào)和纖維化蛋白的沉積。而22肽也能夠一定程度的緩解這些情況，但是32肽和11肽表現(xiàn)出更好的效果，尤其是11肽尤為顯著。

以下為實(shí)施例：

實(shí)施例1

11肽和32肽能夠抑制大鼠腎小管細(xì)胞(NRK-52E)缺氧復(fù)氧損傷所致的炎癥、DNA損傷和凋亡。

具體操作：對(duì)NRK-52E細(xì)胞進(jìn)行處理，分為正常組(CT組)、缺氧復(fù)氧組(H/R組)、缺氧復(fù)氧組給32肽(E32組)、缺氧復(fù)氧組給22肽(E22組)和缺氧復(fù)氧組給11肽(E11組)。收集各組細(xì)胞，提取RNA后運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR儀檢查各組的Kim1、Ilb、Icam1、Tnfa的相對(duì)mRNA水平(圖2A)。將各組不同處理的細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)(圖2B)，檢測(cè)細(xì)胞的存活率。收集NRK-52E細(xì)胞，進(jìn)行超聲裂解，通過免疫印跡檢測(cè)DNA損傷相關(guān)蛋白(p-ATR、p-Chk1和p-H2A.X)和凋亡相關(guān)蛋白(caspase3和c-caspase3)(圖2C和D)。圖2分析表明本發(fā)明的32肽、22肽和11肽能夠抑制H/R引起的炎癥上調(diào)、DNA損傷和凋亡。

對(duì)各組細(xì)胞通過免疫熒光染色檢測(cè)DNA損傷發(fā)生的標(biāo)志物p-H2A.X的熒光強(qiáng)度，通過TUNEL染色檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果如圖3所示。

結(jié)果如圖2和圖3所示，在缺氧復(fù)氧的條件下，NRK-52E細(xì)胞Kim1、Ilb、Icam1、Tnfa的相對(duì)mRNA水平有明顯的上升，給32肽和11肽后有明顯的下降；給22肽在一定程度上也有下降。在缺氧復(fù)氧處理后給予NRK-52E細(xì)胞32肽和11肽后，p-ATR、p-Chk1和p-H2A.X的蛋白水平有明顯的下調(diào)；22肽也在一定程度上改善了缺氧復(fù)氧損傷(簡稱H/R)。通過TUNEL染色和c-caspase3的蛋白水平檢測(cè)，32肽和11肽能夠明顯緩解細(xì)胞受到的缺氧復(fù)氧損傷(簡稱H/R)導(dǎo)致的凋亡增加。

實(shí)施例2

32肽和11肽能夠抑制腎小管細(xì)胞(NRK-52E)受到阿霉素(簡稱ADR)誘導(dǎo)的DNA損傷

具體操作：對(duì)NRK-52E細(xì)胞進(jìn)行處理，分為正常組(PBS組)、給予ADR處理(ADR組)、ADR處理后給32肽(E32組)、ADR處理后給22肽(E22組)和ADR處理后給11肽(E11組)。將各組不同處理的細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞的存活率(圖4A)。收集NRK-52E細(xì)胞，進(jìn)行超聲裂解，通過免疫印跡檢測(cè)DNA損傷相關(guān)蛋白(p-ATR、p-Chk1和p-H2A.X)和凋亡相關(guān)蛋白(caspase3和c-caspase3、PARP-1和c-PARP-1)(如圖4B和C)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，在ADR處理后給予NRK-52E細(xì)胞32肽和11肽后，p-ATR、p-Chk1的蛋白水平有明顯的下調(diào)。給予22肽后，有一定程度的上升。通過MTT實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)給予32肽、22肽和11肽后能夠減少ADR導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。通過免疫印跡發(fā)現(xiàn)給予32肽和11肽后，c-caspase3和c-PARP-1有明顯的減少，說明32肽和11肽能改善ADR誘導(dǎo)的凋亡。

實(shí)施例3

本發(fā)明的多肽能夠抑制C57BL/6小鼠腎臟缺血再灌注(簡稱I/R)引起的腎臟形態(tài)的改變、炎癥和纖維化。

具體操作：在正式實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前我們進(jìn)行了本發(fā)明的系列多肽注射劑量預(yù)實(shí)驗(yàn)，系列多肽注射后小鼠各方面生理指標(biāo)均正常，認(rèn)為系列多肽是安全的。

將體重在25g左右的小鼠分為三組：對(duì)照小鼠組(CT組)、腎臟缺血再灌注小鼠組(I/R組)、腎臟缺血再灌注小鼠組給32肽(E32組)和腎臟缺血再灌注小鼠組給11肽組(E11組)。腎臟缺血再灌注小鼠組進(jìn)行45分鐘的I/R手術(shù)。對(duì)照小鼠組(CT組)、腎臟缺血再灌注小鼠組(I/R組)腹腔注射磷酸鹽緩沖液每天兩次。腎臟缺血再灌注小鼠給32肽組(E32組)和腎臟缺血再灌注小鼠給11肽組(E11組)按照每千克體重注射1.2mol的32肽和11肽每天兩次，共三天。實(shí)驗(yàn)三天后，取腎臟測(cè)重并收集血液，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖5。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6和表1所示，小鼠在I/R損傷三天后，通過24h的尿液收集，發(fā)現(xiàn)尿液總量、蛋白尿、尿中肌酐的含量和氮含量有顯著地上升，而給予32肽和11肽能夠較好緩解這些腎臟功能指標(biāo)的上升(表1)。通過對(duì)小鼠腎臟組織變化進(jìn)行檢測(cè)；與CT組相比，I/R損傷會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腎小管損傷，如廣泛的腎小管壞死、腎小管細(xì)胞的脫落等。通過半定量的對(duì)組織切片進(jìn)行評(píng)分，表明32肽和11肽能夠明顯的提高受損腎臟的評(píng)分(圖6A)。通過對(duì)全部巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物F4/80的表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腎臟I/R損傷后，巨噬細(xì)胞的浸潤有明顯的增加，32肽和11肽能夠緩解這種浸潤，從而表明32肽和11肽在一定程度上能夠緩解炎癥(圖6B)。通過對(duì)纖維化的標(biāo)記物，如膠原蛋白的沉積(馬松三色染色簡稱Masson染色)，平滑肌激動(dòng)蛋白(簡稱-SAM)和波形蛋白(簡稱Vimentin)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)32肽和11肽能夠保護(hù)I/R損傷的小鼠明顯的纖維化變性(圖6C)。通過實(shí)驗(yàn)測(cè)試能表明32肽和11肽有顯著的改善效果，22肽有一定的改善效果但效果略遜色于32肽和11肽，其中11肽效果最好。

表1、32肽和11肽對(duì)腎臟功能的各種指標(biāo)的影響

實(shí)施例4

32肽和11肽能夠抑制腎臟I/R損傷誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)和凋亡

具體操作：體重在25g左右的小鼠分為三組：對(duì)照小鼠組(CT組)、腎臟缺血再灌注小鼠組(I/R組)、腎臟缺血再灌注小鼠組給32肽(E32組)和臟缺血再灌注小鼠組給11肽組(E11組)。小鼠腎臟用石蠟包埋，切成5μM厚的切片，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和TUNEL染色。取腎臟研磨超聲裂解，上樣20ug進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明CT組p-ATR,p-Chk1和p-H2A.X在蛋白水平幾乎檢測(cè)不到；在腎臟發(fā)生I/R損傷時(shí)，p-ATR,p-Chk1和p-H2A.X在蛋白水平上又有明顯的上調(diào)。32肽、22肽和11肽能夠抑制腎臟I/R損傷誘導(dǎo)的p-Chk1和p-H2A.X的上調(diào)。相比于32肽和22肽，11肽表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制腎臟I/R損傷誘導(dǎo)的p-ATR和p-Chk1蛋白水平的上升(圖7A)。腎表皮細(xì)胞的染色結(jié)果表明，32肽和11肽能抑制腎臟I/R損傷誘導(dǎo)的p-H2A.X染色加深(圖7C)。腎臟I/R損傷能夠上調(diào)c-caspase3，而32肽和11肽能下調(diào)I/R損傷誘導(dǎo)c-caspase3的上調(diào)(圖7B)，并且TUNEL染色結(jié)果也是一致的(圖7C)，表明32肽和11肽確實(shí)能夠抑制腎臟I/R損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 華中科技大學(xué)

<120> 多肽

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Met Pro Leu His Ser Arg Val Pro Phe Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Lys Leu Arg Lys His Asn Cys Leu Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gln Arg Pro Val Asn Leu Thr Met Arg Arg Lys Leu Arg Lys His Asn

1 5 10 15

Cys Leu Gln Arg Arg

20