二氯甲烷在急性肺損傷中的一種治療方法
【專利摘要】本發(fā)明屬生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及二氯甲烷在急性肺損傷中的一種治療方法。主要用于治療由于臨床上各種疾病引起的急性肺損傷，誤服百草后引起的急性中毒后造成的肝損傷；從形態(tài)學(xué)特征證實(shí)二氯甲烷在體內(nèi)轉(zhuǎn)換成一氧化碳，而一氧化碳在肺疾病中具有抗炎等組織細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)；能夠有效減輕肺組織的形態(tài)學(xué)損傷，減輕大鼠癥狀，提高其生存率，并改善生存質(zhì)量；生化檢測(cè)指標(biāo)等證實(shí)，二氯甲烷是通過(guò)在體內(nèi)代謝生成一氧化碳發(fā)揮其抗炎、抗損傷的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)的。
【專利說(shuō)明】二氯甲烷在急性肺損傷中的一種治療方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了二氯甲烷在急性肺損傷中的一種治療方法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 在甲烷氯化物中，二氯甲烷（methylene chloride，MC)的毒性最低。其在肝內(nèi)由 細(xì)胞色素P4502E1 (CYP 2E1)催化生成一氧化碳（carbon monoxide,CO)而導(dǎo)致碳氧血紅蛋 白（CO-Hb)濃度升高，該代謝具有高親和性和低容量的特性，即進(jìn)入體內(nèi)很容易代謝生成 CO和CO 2，且在低濃度時(shí)已達(dá)到飽和，即使增大劑量，其代謝產(chǎn)物CO也保持相對(duì)較低的濃度 不再增大，使血中CO-Hb濃度不致過(guò)高而引起嚴(yán)重組織缺氧。越來(lái)越多的研究提示CO在多 種在體動(dòng)物肺疾病模型中都具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗缺血/再灌注損傷等組織細(xì)胞保 護(hù)效應(yīng)。本研究通過(guò)觀察MC對(duì)盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture, CLP)誘導(dǎo) 急性肺損傷（acute lung injury,Au)大鼠中性粒細(xì)胞在肺臟聚集、脂質(zhì)過(guò)氧化損傷產(chǎn)物生 成、炎癥細(xì)胞因子的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明二氯甲烷對(duì)急性肺損傷具有明顯的保護(hù)作用。給予 CO的途徑主要有直接吸入、上調(diào)血紅素加氧酶一 1表達(dá)、應(yīng)用CO釋放復(fù)合物及其他生成CO 的前體藥物（如MC)等。MC主要由肝內(nèi)CYP 2E1催化生成CO而導(dǎo)致CO-Hb濃度升高，該代 謝具有高親和性和低容量的特性，即進(jìn)入體內(nèi)很容易代謝生成CO和C02,且在低濃度時(shí)已 達(dá)到飽和，即使增大劑量其代謝產(chǎn)物CO也保持相對(duì)較低的濃度不再增大，而使血中CO-Hb 濃度不致過(guò)高而引起嚴(yán)重組織缺氧。所以如果能以MC作為CO供體通過(guò)口服即能達(dá)到給予 目的，無(wú)疑會(huì)更方便，且不需要特殊的環(huán)境、特殊的設(shè)備，更不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染或影響醫(yī) 護(hù)人員的健康。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003] 本發(fā)明公開了二氯甲烷在急性肺損傷中的一種治療方法，用于治療急性肺損傷的 一種方法。
[0004] 本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)證明二氯甲烷在急性肺損傷中的一種治療方法：將40只SD 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為SHAM組、CLP組、MC組和DSF+MC組4組，每組10只。IOh后右 側(cè)頸總動(dòng)脈放血處死。左肺行支氣管肺泡灌洗，灌洗液進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測(cè)蛋白濃度和 TNF-α及IL-10水平；右肺下葉觀察大鼠肺組織病理變化，其他肺葉勻漿后檢測(cè)丙二醛和 髓過(guò)氧化物（myeloperoxidasedefieieney，MPO)。另取40只大鼠隨機(jī)分組處理同上，手術(shù) 后分籠，觀察其活動(dòng)、刺激后反應(yīng)；記錄72h生存率。CLP組大鼠肺部炎癥和損傷明顯，MC 組肺泡壁無(wú)增厚，肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺組織內(nèi)TNF-α降低，IL-10增高，丙二醛降 低，術(shù)后72h生存率顯著增高。MC+DSF組肺泡壁增厚，肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多；肺組織內(nèi) TNF-α增高，丙二醛升高，術(shù)后72h生存率顯著增高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明二氯甲烷對(duì)急性肺損傷 具有明顯的保護(hù)作用。
[0005] 具體實(shí)施方法
[0006] 下面的實(shí)例將具體說(shuō)明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0007] 將40只健康成年雄性SD大鼠，體重為280g?3309,按隨機(jī)數(shù)字表法分為SHAM組 (以橄欖油灌胃；2h后麻醉，僅打開腹腔，游離盲腸至腹腔外，即還納關(guān)腹）；CLP組（以橄欖 油灌胃后；2h后麻醉施行CLP) ;MC組（橄欖油灌胃IOh后以MC灌胃液灌胃；2h后麻醉施行 CLP)和DSF+MC組（DSF灌胃液灌胃IOh后以MC灌胃液灌胃；2h后麻醉施行CLP)4組，灌胃 液容量為〇. 3ml，工具藥的給予量分別為：DSF液取3. 4mmol/kg體重，MC液取6. 4 μ mol/kg 體重。每組10只動(dòng)物。
[0008] 麻醉、固定后，消毒并切開腹部，打開腹腔，游離盲腸出腹腔，避免損傷腸系膜血 管；為避免引起腸梗阻，在距回盲瓣Icm的遠(yuǎn)端處結(jié)扎盲腸，在腸系膜對(duì)側(cè)游離面以16號(hào)穿 刺針貫穿盲腸，針孔間距約3mm，以4號(hào)絲線貫穿留置瘺口內(nèi)，輕擠盲腸使少量?jī)?nèi)容物溢出 瘺口；還納盲腸回腹腔內(nèi)，逐層縫合關(guān)閉腹腔。術(shù)后皮下注射生理鹽2ml/100g^nl/100g體 重，分籠喂養(yǎng)，觀察大鼠活動(dòng)、刺激后的反應(yīng)等一般情況。
[0009] 術(shù)后IOh采集標(biāo)本。麻醉大鼠后，右側(cè)頸總動(dòng)脈穿刺置管，以5ml/min速度放血處 死大鼠。左肺進(jìn)行灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF)， 光鏡下計(jì)數(shù)白細(xì)胞，ELISA檢測(cè)TNF-α和IL-10濃度。右肺取下葉以4%甲醛固定，蘇木素 伊紅（HE)染色，光鏡下觀察病理變化；其余葉勻漿，鄰連茴香胺法檢測(cè)MPO活性，硫代巴比 妥酸法測(cè)定丙二醛含量。
[0010] 另取40只大鼠分組及實(shí)驗(yàn)方法同上，CLP術(shù)后分籠，自由食水，觀察大鼠活動(dòng)、刺 激后的反應(yīng)等一般情況，并以12h為單位記錄大鼠72h內(nèi)生存率。生存率數(shù)據(jù)以百分率表 示，其余統(tǒng)計(jì)資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（X 土 S)表示。
[0011] 1 一般情況與生存率觀察：在CLP術(shù)后6h，動(dòng)物蜷縮、嗜睡，活動(dòng)度減少，不進(jìn)食， 刺激后可見(jiàn)痛覺(jué)反應(yīng)；其后毛發(fā)堅(jiān)立，呼吸以腹式為主，漸趨窘迫；16h可見(jiàn)少量泡沫狀分 泌物自鼻腔溢出。MC組24h生存率為90%，明顯高于CLP組（P〈0. 01) ;DSF組生存率僅為 20%，顯著低于MC組（P〈0. 01)。術(shù)后72h，MC組、CLP組和DSF組生存率分別為80%、0% 和0%。本實(shí)驗(yàn)條件下，CLP大鼠的死亡高發(fā)時(shí)段在第1個(gè)24h內(nèi)，手術(shù)后24h僅10 %大鼠 存活，且呼吸窘迫。而MC組大鼠醒后的6h左右，呼吸以腹式為主，急促，口鼻有漿液性分泌 物，毛發(fā)堅(jiān)起，活動(dòng)度差；但之后癥狀逐漸減輕，在第1個(gè)24h內(nèi)90%的大鼠存活，且其后并 未重新出現(xiàn)癥狀；手術(shù)后72hMC組生存率為80%，顯著高于CLP組。在DSF+MC組，由于阻 斷了 MC生成CO的代謝途徑，癥狀加重，生存率顯著下降。以上結(jié)果提示MC在體內(nèi)代謝生 成的CO發(fā)揮了保護(hù)作用，減輕大鼠癥狀，提高其生存率，并改善生存質(zhì)量。
[0012] 2肺組織形態(tài)學(xué)變化：400倍光鏡下顯示，SHAM組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔無(wú)增寬， 肺泡腔內(nèi)見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞;MC組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔稍增寬，可見(jiàn)炎 性細(xì)胞浸潤(rùn)；CLP組肺組織明顯受損，可見(jiàn)肺泡間隔增寬，肺泡完整性被破壞，大量炎癥細(xì) 胞浸潤(rùn)，肺泡內(nèi)充滿漿液性滲出液，大量紅白細(xì)胞滲出；DSF+MC組肺組織明顯受損，可見(jiàn)肺 泡間隔增寬，肺泡完整性被破壞，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡內(nèi)充滿漿液性滲出液，大量紅白 細(xì)胞滲出。研究提示CO在動(dòng)物肺疾病模型中具有抗炎等組織細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。
[0013] 3BALF內(nèi)炎癥因子水平：與CLP組相比，MC組大鼠BALF中IL-10水平增高 (P〈0. 01) ;TNF_a水平降低（p〈0. 01);與MC組相比，DSF組大鼠BALF中IL-10水平較低 (P〈0. 01)，TNF-a水平較高（P〈〇. 05)，見(jiàn)表1。BALF內(nèi)白細(xì)胞計(jì)數(shù)：SHAM組大鼠BALF中白 細(xì)胞計(jì)數(shù)很少；與CLP組比較，MC組大鼠BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低（P〈0. 01);與MC組比較， DSF組大鼠BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)增高（P〈0. 01)，見(jiàn)表1。CLP組大鼠肺部炎癥明顯，且處于進(jìn) 展中，肺組織損傷較重；MC組大鼠肺部炎癥局限，肺組織損傷不明顯；DSF組大鼠肺部炎癥 明顯，肺組織損傷較重。而DSF為CYP2E1抑制劑，阻斷MC在體內(nèi)生成CO,提示MC是通過(guò)在 體內(nèi)代謝生成CO發(fā)揮其抗炎、抗損傷的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)的。
[0014] 4肺組織MPO和丙二醛含量檢測(cè)：MC組大鼠肺組織內(nèi)MPO活性與CLP組相比顯著 減少（P〈0. 01) ;DSF組大鼠肺組織內(nèi)MPO與MC組相比顯著增高（P〈o. 05)，見(jiàn)表1。在CLP 組大鼠肺組織中MPO活力很高，提示其中大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，且丙二醛含量很高，提示大 量細(xì)胞受到損傷。而在MC組大鼠肺組織中MPO活力顯著降低，丙二醛含量顯著降低，提示 無(wú)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)組織，組織細(xì)胞未受到明顯損傷；在DSF組大鼠肺組織中，MPO活力 很高，提示其中大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，且丙二醛含量很高，提示大量細(xì)胞受到損傷。這些與 病理切片所顯示的一致，與BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)也一致：在CLP組大鼠BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)很 高，MC組顯著降低，而與DSF組相比MC組則顯著增高。在CLP組大鼠BALF中IL-10濃度偏 低，而促炎細(xì)胞因子TNF-a偏高，提示炎癥明顯，且可能進(jìn)一步發(fā)展；在MC組大鼠BALF中， IL-10濃度顯著升高，處于較高水平，TNF-α濃度相比CLP組明顯降低，提示炎癥較為局限； 在DSF組大鼠BALF中IL-10濃度偏低，而促炎細(xì)胞因子TNF-α偏高，提示炎癥明顯，且可 能進(jìn)一步發(fā)展。MC組大鼠肺組織內(nèi)丙二醛含量與CLP組相比減少（P〈0. 01) ;DSF組與MC組 相比增高（P〈〇. 05)，見(jiàn)表1。
[0015] 表1各組大鼠生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（X土 s，η = 10)
[0016]

【權(quán)利要求】
1. 二氯甲烷在急性肺損傷中的一種治療方法。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的二氯甲烷在急性肺損傷中的一種治療方法，其特征在于：在 臨床發(fā)現(xiàn)有急性肺損傷時(shí)應(yīng)及時(shí)應(yīng)用二氯甲烷；用量為lml/kg/d ;應(yīng)用方法為口服，三次/ 天。
【文檔編號(hào)】A61K31/02GK104434887SQ201410764768
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月12日
【發(fā)明者】龐慶豐, 范紅斌, 杜斌, 陳俊良 申請(qǐng)人:江南大學(xué)